材料和试剂

移液器吸头（1000μl，200μl，10μl）
Tissue，Kimwipes一次性刮水器（Sigma-Aldrich，目录号：Z188956-1PAK）
6孔板，无菌组织培养级（Sigma-Aldrich，Corning，目录号：SIAL0506-100EA）
15毫升无菌锥形管（Sigma-Aldrich，Greiner，目录号：T1943-1000EA）
1.5毫升无菌管（Eppendorf，目录号：0030 120.086）
27 G针（Sigma-Aldrich，目录号：Z192384-100EA）
10毫升一次性塑料注射器（Fischer Scientific，目录号：15889152）
12周龄小鼠C57BL / 6J
EasySep中性粒细胞富集试剂盒（StemCell Technology，目录号：19762）
乙醇
RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：61870010）
TC等级1 M HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：15630080）
台盼蓝溶液（赛默飞世尔科技，目录号：15250061）
ATP钠（Sigma-Aldrich，目录号：A7699-1G）
氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
Phenylmethanesulfonyl fluoride（PMSF）（Sigma-Aldrich，Roche，目录号：PMSF-RO）
cOmplete Mini，不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂（Sigma-Aldrich，Roche，目录号：11836170001）
Opti-MEM，降血清培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985062）
70％乙醇溶液（见食谱）
中性粒细胞培养基（见食谱）
PMSF储备液（见食谱）
ATP储备液（见食谱）
低渗缓冲液（见食谱）

设备

P1000微量移液管
剪刀
血细胞计数器
离心机（Eppendorf，型号：5415C）
恒温箱
-80°C冰箱
细胞破碎容器，45 ml（Parr Instrument Company，目录号：4639）
氮气罐连接到减压阀
鼠标解剖套件（世界精密仪器）
组织培养罩

程序

通过颈椎脱位或任何其他合适的方法杀死小鼠。
注意：用于安乐死小鼠的方案应由您的机构动物伦理委员会批准。
用针将鼠标固定在背面。固定每条腿。用70％乙醇喷洒小鼠。使用鼠标解剖套件，沿前腿切开皮肤，进入胫骨和股骨。
切开臀部和脚踝上方的前腿。
用纸巾轻轻去除骨头周围的肉。将股骨和胫骨分开。将骨头放入6孔板中的70％乙醇溶液中15秒。将细胞培养罩内的骨骼（在乙醇中）带入。将骨骼转移到6孔板中的中性粒细胞培养基中并将它们保持在冰上。
在引擎盖下，用一把剪刀剪掉骨头的末端，用27G针头用中性粒细胞介质冲洗骨头。
注意：通常，每只小鼠10毫升中性粒细胞培养基足以冲洗。
使用Stemcell技术的阴性选择试剂盒easysep纯化骨髓中性粒细胞。或者，中性粒细胞也可以如（Chen等人，2014年）所述进行纯化。洗脱时，将电池放在冰上。
注：通常，一只12周大的老鼠会给你带来1200万到2000万的中性粒细胞。雄性小鼠会产生更高的中性粒细胞数。>
用血细胞仪计数活细胞，用台盼蓝将洗脱液1/10稀释。
在400x g下离心细胞5分钟，在4°C下。通过抽吸去除细胞上清液。
使用p1000微量移液管，轻轻地将中性粒细胞重新培养至5000万中性粒细胞/ml的低渗缓冲液浓度。
注：中性粒细胞是非常脆弱的细胞。温柔地对待它们，避免使它们产生涡流或摇晃它们而使之恢复。这种治疗可以激活中性粒细胞，并会影响你的实验结果。我们通常使用p1000微量吸管缓慢地重新培养细胞。>
将细胞在冰上孵育10分钟，使其膨胀。
当细胞溶解时，准备氮空化装置（Zhou和Philipp，2017）。确保容器的下部阀门已关闭。
移除细胞破裂血管的上部，将细胞放入血管内。把船放在冰上。
将容器连接至氮气罐，轻轻打开罐上的减压阀，直到容器上的指示器指示380 psi。关闭上部阀门并断开氮气罐。在冰上孵育5分钟。
注意：仔细监测压力。压力过高可能会破坏中性粒细胞颗粒并污染细胞核准备。>
取一根1.5毫升的微乳管，将其靠近下阀门。慢慢打开阀门，让液体在微管内流动。
注意：打开下阀时要小心。过快地打开阀门会导致样品完全丢失。>
在500x g>，4°C下离心细胞提取物5分钟。轻轻去除上清液。
向小球中加入300μl低渗缓冲液，然后轻轻地将其再溶解。重复步骤15两次。
用p1000移液管在200μl低张缓冲液中轻轻地再注射颗粒。使用血细胞仪，计数细胞核，并根据你的需要重新分配。
核准备就绪，可用于您的分析。
注意：>
1. 核制剂应准备好立即使用。如果准备用于网病研究，则不建议冷冻。>
2. 该方案可用于从新鲜人血液中分离的中性粒细胞中纯化细胞核。在这种情况下，实验者应该从步骤7开始协议。easysep人中性粒细胞富集试剂盒（stemcell技术）可用于纯化人中性粒细胞。>
3. 如果实验人员更方便，则可以在其他缓冲器中进行最终再悬浮（步骤17）。这种缓冲液可能不会溶解细胞核，必须在使用前进行测试，以确保细胞核保持完整（例如，对sytox染色不可渗透）。有关详细信息，请参见数据分析部分。>

数据分析

这个方案应该能够纯化完整的中性粒细胞核。如果用于显微镜检查，实验者应使用DNA染色试剂（例如>，Sytox，Invitrogen）验证细胞核是否完整且未生成网（Chen等人，2018年）。

食谱

70%乙醇溶液
用蒸馏水配制70%乙醇溶液
中性粒细胞培养基
500毫升RPMI 1640
10%胎牛血清（热灭活）
5ml Tc 1级甲肝
将重组培养基保持在4°C，远离光线
PMSF储备溶液
1. 溶于乙醇
2. 将溶液分为1毫升试管
3. 储存于-20°C
atp原液（0.5m）
1. 在无菌蒸馏水中溶解atp
2. 在冰上等分并在-80°C下冷冻
注意：不要冻融等份，解冻后丢弃。>
低张缓冲液
100毫米kcl
1毫米氯化钠
1毫米atp
3.5毫米氯化镁2
10 mm管道
1片Compete Mini-EDTA游离蛋白酶抑制剂（1片/5毫升缓冲液）
0.5毫米pmsf
注：atp、蛋白酶抑制剂片和pmsf应新鲜添加（细胞溶解前10分钟）。>

致谢

在优化该方案的过程中，dave boucher博士得到了昆士兰大学博士后奖学金的资助。作者感谢Kate Schroder和Ian Ross博士（昆士兰大学）在优化该协议的过程中提供的帮助。

相互竞争的利益

提交人没有可申报的竞合利益。

伦理学

昆士兰大学动物伦理委员会批准了所有实验方案（批准号：IMB/423/17）。

工具书类

Chen，K.W.，Gross，C.J.，Sotomayor，F.V.，Stacey，K.J.，Tschopp，J.，Sweet，M.J.和Schroder，K.（2014年）。中性粒细胞NLRC4炎症小体在急性沙门氏菌感染期间选择性地促进IL-1β的成熟，而不发生热休克。细胞代表>8（2）：570-582。

Chen，K.W.，Monteleone，M.，Boucher，D.，Sollberger，G.，Ramnath，D.，Condon，N.D.，Von Pein，J.B.，Broz，P.，Sweet，M.J.和Schroder，K.（2018年）。非特异性炎症细胞信号诱导gasdermin d依赖性中性粒细胞胞外陷阱。sci-immunol>3（26）。PII:EAAR6676。

Gonzalez，A.S.，Bardoel，B.W.，Harbort，C.J.和Zychlinsky，A.（2014）。中性粒细胞胞外陷阱的诱导和量化。方法分子生物学>1124:307-318。

Papayannopoulos，V.（2018年）。免疫和疾病中的中性粒细胞胞外陷阱

Shi，J.，Zhao，Y.，Wang，K.，Shi，X.，Wang，Y.，Huang，H.，Zhuang，Y.，Cai，T.，Wang，F.和Shao，F.（2015年）。炎症性caspases对gsdmd的裂解决定了热致性细胞死亡。自然>526（7575）：660-665。

Zhou，M.和Philips，M.R.（2017年）。氮空化和差速离心可以监测培养细胞外周膜蛋白的分布。j vis exp>18（126）。doi:10.3791/56037.