材料和试剂

1 cm路径长度石英比色杯（Hellma？，目录号：Z801712）
96孔板（康宁，目录号：3897）
Wilmad LabglassTMNMR管（费希尔科学公司，16-800-554）
6孔组织培养处理板（细胞一号，目录号：CC7672-7506）
低滞留微离心管（Fisher Scientific，目录号：02-681-331；琥珀色，目录号：05-402-31）
FisherbrandTM微型搅拌棒（Fisher Scientific，目录号：16800523）
flex-column？经济列（Fisher Scientific，目录号：K420400-1030）
spectrumTMspectrum/porTMfloat-a-lyzerTMG2透析设备（Fisher Scientific，目录号：08-607-020）Fisher BrandTM B级琥珀色玻璃螺纹小瓶
CAPs（费希尔科学公司，目录号：14-955-332）
PierceTM蛋白质浓缩器PES，3K MWCO，2-6毫升（Fisher Scientific，目录号：PI88515）
Sephadex G-15（GE Healthcare，目录号：17002001）
MCF7（ATCC？HTB-22TM）和HEK 293T（ATCC？ACS-4500TM）细胞系
猪肠粘膜肝素钠（Sigma-Aldrich，目录号：H4784-1g，4°C保存）
dabcyl c2胺（100 mg）（anaspec，目录号：AS-81819，在-20°C下储存，n2）
EDANS，钠盐，5-[（2-氨基乙基）氨基]萘-1-磺酸，钠盐（0.5 g）（ANASPEC，目录号：AS-23886，在-20°C氮气下储存）
N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC）（Sigma Aldrich，目录号：03449，储存于-20°C）
N-羟基丁二酰亚胺（NHS）（Sigma-Aldrich，目录号：130672-5g，N2时，-20°C）
冰醋酸（高效液相色谱级）（Fisher Scientific，目录号：A35-500）
甲基亚砜，99.7%，超干，无水，SC（AcrosealTM，Acros OrganicsTM，目录号：AC610971000）
Thermo ScientificTMNerlTM高纯度水（Fisher Scientific，目录号：23-249-590）
水（高效液相色谱级）（Fisher Scientific，Fisher Chemical W5-4）
苏拉明（Sigma-Aldrich，目录号：S2671）
氧化氘，d2o（Sigma Aldrich，目录号：151882）
醋酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7545）
氯化钠（Fisher Scientific，目录号：BP358-1）
HEPES（细白色晶体/分子生物学）（Fisher生物制剂，目录号：BP310-500）
HyoLoop[SUP> TM胎牛血清（FBS），Fisher生物反应器，目录号：SH77102
杜尔贝科改良鹰培养基（DMEM）生长培养基（美国因维特洛根）
（可选）乙酰肝素酶蛋白（研发系统，目录号：7570-GH-005）
抗生素抗真菌溶液（AA）（Fisher Scientific，目录号：15-240-062），抗生素谱：两性霉素B，青霉素，链霉素
分析缓冲液（见配方）

设备

Freezone Plus 6冻干机（Labconco公司）
蠕动泵P-1（GE Healthcare，目录号：18111091）
温控离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge 20R；Eppendorf，型号：5804R）
Flex Station III（分子器件，CA）
岛津分光光度计（岛津科学仪器，美国）
荧光计PTI QM-400（加拿大Horiba）
pH计（丹佛仪器，型号：220）
400 mhz上旋h1核磁共振布鲁克
C24经典系列孵化器（新泽西州新不伦瑞克科学）
精密水浴（精密科学，型号：25）
-20°C（Norlake Scientific）和-80°C冷冻柜（Thermo Scientific）
FORMA系列II，水套式CO2培养箱（美国热电公司）
搅拌加热板（FisherbrandTMISOtempTM，产品编号：SP88850200）
荧光比色杯（Hellma？，目录号：101.015-qs；试管架，目录号：013.013）

软件

Sigmaplot 13（Systat软件公司或OriginPro或Kaleidagraph）

程序

肝素标记
1. 称取100毫克肝素，移入琥珀色玻璃瓶。
2. 溶于0.1-0.2毫升蒸馏水H2O。
3. 添加5.9 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和25.6 mg 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）。用微型搅拌棒搅拌混合物3分钟。
4. 分别称取4.1和3.8 mg Dabcyl C2胺和EDans于琥珀色Eppendorf中，溶于100μl DMSO中。化学计量见表1。
  
  表1。用于合成标记肝素的化学计量比（体积排阻色谱后的产率：70-75）
5. 从第4步开始，将二甲基亚砜溶解混合物添加到含有肝素、NHS和EDC的小瓶中。
6. 用蒸馏的H2O使最终体积达到2毫升，并滴入微量搅拌棒。
7. 在温控磁力搅拌器上连续搅拌混合物。
8. 在37°C的油浴上继续搅拌20小时。如果油浴不可用，也可以使用偶尔混合的温控烤箱。
  注意：在标记过程中，确保搅拌/混合反应混合物。>
9. 随后，在室温下用蒸馏的h2o对混合物进行透析，以去除未反应的标签和盐。使用分子量截止值（MWCO）为3.5-5 kDa的膜。
  注：在1L蒸馏水H2O（暗/关灯）中透析，并在24小时内将蒸馏水H2O改变3次。透析后，样品体积从2增加到~6/7毫升。>
10. 接下来，用3000da mwco膜离心浓缩器浓缩去除多余的h2o和盐。重复离心，直到体积减小到~0.5毫升。
  注：使用Eppendorf离心机在4500 x g（RCF）下，在8°C下静置20分钟。一次性离心浓缩器主要用于浓缩和脱盐。根据制造商的不同，这些设备被称为Centricon或离心过滤装置。>
11. 最后一步，将浓缩样品装入G-15尺寸排除柱。
  注：该技术根据分子量洗脱/分离混合物。高分子量化合物先洗脱，低分子量后洗脱。由于肝素分子量~15000da，用sephadex g-15（大于1500分子量的小分子生物）柱脱盐。>
  
  将sephadex g-15（50g）用蒸馏水洗涤，并使其一夜膨胀。第二天早上，在填料塔之前，将漂浮的细颗粒倾析。在重力下包装柱（24毫升），并使用蠕动泵以0.5毫升/分钟的流速与水平衡过夜。>
12. 随后，使用玻璃滴管将浓缩标记（0.5 ml）肝素轻轻地加载到平衡柱上，并以0.5 ml/min的速度用水洗脱。在锥形管中手动收集1 ml大小的有色部分，并使用1 cm路径长度的比色皿（Figu）在500 nm处记录吸光度回复1）。
  注：之前对管子进行称重，以计算产品最终重量（wf-wi=产品重量）。>
  
  图1。标记肝素在g-15柱上分馏。在500 nm处记录分馏物的吸光度，并根据洗脱体积绘制图。
13. edans标记、dabcyl标记和dabcyl-edans标记肝素的吸收光谱如图2所示。此外，图3显示了冻干标记肝素、10 mg/ml溶液和在360 nm（1 mg/ml）下激发的96孔板。
14. 将荧光色组分在-80℃下冷冻3h，然后冻干。此外，使用核磁共振（图4）确认标记。在d2o中制备每种（10 mg/ml）标记的肝素、肝素、edans标记的肝素和dabcyl标记的肝素。注：edans标记和dabcyl标记肝素的制备方法与上述类似。步骤4将有EDAN（EDAN标记肝素）或DABCYL（DABCYL标记肝素）。>
15. 小心地填充核磁共振管（500μl）并记录光谱。这里使用肝素作为参照物。
16. 进一步的实验细节可以在sistla等中找到。（2019年）。
  
  图2。代表标记肝素的光谱。（…）（红色虚线）肝素达布西；（…）（蓝色虚线）肝素依丹；和（…）（实线）肝素达布西依丹。用1cm长的石英比色杯将标记的肝素溶解在水中，从600-250nm处记录光谱。
  
  图3。样品制备流程。a.标记肝素；b.在分析缓冲液中标记肝素（10 mg/ml）；c.在96孔板中标记肝素溶液（1 mg/ml），在360 nm激发时显示EDANS荧光。
  
  图4。肝素和fret标记的肝素在d2o中的400mhz 1h nmr谱图。在5.43和5.26ppm处的峰表示肝素中的异聚质子，而在7-9ppm范围内的峰对应于edans和dabcyl c2胺。a.未标记肝素；b.用edans标记肝素；c.用dabcyl标记肝素；d.用edans和dabcyl标记肝素。
样品制备和数据采集
1. 乙酰肝素酶蛋白的表达与纯化乙酰肝素酶蛋白用公布的方法表达和纯化（Wu等，2015；Sisla等，2019）。这种蛋白质也可以从研发系统中获得。将储备蛋白质等分并储存在-80
2. 分析
  1. 制备醋酸钠缓冲液，0.2 M，pH 5。（见配方1）
  2. 将含有重组乙酰肝素酶（1 mm）和标记底物（1 mg/ml）的溶液剧烈摇动4 h。
  3. 通过在冰上孵育直到测量结果被读取而使酶失活。
  4. 将混合物转移到荧光反应杯中，记录350至600 nm的发射光谱（lex=340 nm）。兴奋发射缝设置为0.5毫米（图5）。
  5. 反应设置为一式两份或一式三份。
  图5。基于FRET的人乙酰肝素酶测定。标记肝素（1 mg/ml）与乙酰肝素酶（1μm）在37°C、20 mm醋酸钠缓冲液（pH 5.0）中孵育。（黑线）0h，（虚线）4h处的荧光发射光谱（λex=340nm）。
抑制试验-平板格式
用不同浓度的抑制剂进行抑制试验。肝素酶在苏拉明（一种已知的抑制剂）存在下水解标记肝素，在荧光微板阅读器flex station iii（分子装置）上的96孔板（康宁）中以100μl的最终体积进行监测。
1. 在分析缓冲液中制备抑制剂的储备溶液。
2. 将乙酰肝素酶（1μm）和各种浓度的苏拉明在37°C的分析缓冲液中培养30分钟。
3. 通过添加标记肝素（最终浓度66μm）开始水解反应。
4. 持续搅拌4小时，放置在冰上终止反应。
5. 记录500 nm处的荧光读数（λex=340 nm，图6）。
6. 使用标准方法计算ic50。与不含抑制剂的对照组相比，计算残余活度。
7. 绘制浓度与剩余活度的半对数图。
  
  图6。苏拉明对乙酰肝素酶的抑制作用。实验以微孔板形式（100μl）在20 m m醋酸钠缓冲液中进行，pH值为5.0，含有1 mg/ml标记肝素和1μm乙酰肝素酶，在37°C下，在不同浓度的苏拉明。实线表示标准剂量反应方程的曲线拟合。
生物样品中乙酰肝素酶活性的检测
1. 人乳腺癌细胞系MCF7和HEK293T（阴性对照）细胞系在DulbCo改性EGO培养基（DMEM）生长培养基（美国）中添加单层培养条件，添加10%胎牛血清（FBS），1%抗生素抗真菌液（AA）在5% Co中维持。2在37°C时，由ATCC推荐。
2. 最初，将mcf7/hek细胞作为单层在生长培养基中培养24小时，以确保高效生长和粘附。
3. 随后，在培养基中用2% FBS血清代替培养基，使细胞在常温条件下继续生长48小时（在5%℃下保持湿度为37°C的亚湿空气＞2＜/亚＞95%空气空气）。
4. 培养48h后，收集上清液并在1000x g>下在4°C下离心10min。
5. 对于基于时间的乙酰肝素酶活性测量，在不同的时间点采集培养基，并在-20°C下立即冻结，直到进行分析。
6. 将含有乙酰肝素酶的培养基添加到标记的肝素基质中，最终体积为100μl，置于96孔板中（corning？3897）。
7. 持续搅拌4小时，放置在冰上终止反应。
8. 记录500 nm处的荧光读数（λex=340 nm）。实验结果如图7所示。
  
  图7。mcf7细胞在常氧条件下表达活性乙酰肝素酶。结果以平均值±标准差（n>；3）表示。