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图1。高通量人iastrocyte-hb9-gfp+小鼠运动神经元共培养实验的时间轴

材料和试剂

材料
1. 10cm组织培养板（Thermo Scientific，目录号：150350）
2. 9cm培养皿（科学实验室用品，目录号：PET2000）
3. 384个井板（Greiner Bio，目录号：781091）
4. 384井聚丙烯源板（Labcyte，目录号：PP-0200）
5. 5毫升一次性吸管（Fisher Scientific，目录号：13-676-10H）
6. 10毫升一次性吸管（Fisher Scientific，目录号：13-676-10J）
7. 25毫升一次性吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-11）
8. 10微升吸管头（Fisher Scientific，目录号：02-707-441）
9. 200微升吸管头（Fisher Scientific，目录号：02-707-422）
10. 1000微升吸管头（Fisher Scientific，目录号：02-707-402）
11. 15毫升Falcon试管（Greiner Bio，目录号：188271）
12. 50毫升Falcon试管（Greiner Bio，目录号：227261）
13. 0.2微米注射器过滤器（Sartorius，目录号：16534K）
14. 耐二甲基亚砜箔盖（布鲁克斯生命科学，目录号：4TI-0512）
15. 硬顶过滤器（微孔，目录号：S2GPt05re）
16. 无菌细胞过滤器，40μm筛孔（Fisher Scientific，目录号：11587522）
17. 无菌细胞过滤器，70μm网（康宁，目录号：431751）
  
  < BR>
试剂
1. 原代小鼠胚胎成纤维细胞（Sigma-Aldrich，目录号：PMEF-CF）
2. 笔杆（Lonza，目录号：DE17-603E）
3. 10x胰蛋白酶（lonza，目录号：BE02-007E）
4. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
5. Accutase（Gibco，目录号：11599686）
6. B-27（Gibco，目录号：11530536）
7. bdnf（peprotec，目录号：450-02）
8. CACL（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
9. CNTF（PEPROTEC，目录号：450-13）
10. D-（+）-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
11. DMEM（Lonza，目录号：12-741F）
12. DMEM/F-12，谷氨酰胺（Gibco，目录号：11524436）
13. 无水二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
14. DNA酶I（苹果生命科学，目录号：A3778）
15. EDTA（热科学，目录号：17892）
16. 电子稳定控制系统FBS（Gibco，目录号：11500526）
17. FBS（Biosra，目录号：FB-1090）
18. FGF（PEPROTEC，目录号：100-18B）
19. GDNF（PEPROTEC，目录号：450-10）
20. 火腿F-12营养素混合物（Gibco，目录号：15172529）
21. 人纤维粘连蛋白（sigma-aldrich，目录号：fc010-10mg）
22. KCL（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
23. 淘汰DMEM（Gibco，目录号：10389172）
24. 敲除血清置换（GIGBO，目录号：11520366）
25. L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
26. L-谷氨酰胺（Lonza，目录号：BE-17-605E）
27. MGSO4（Sigma-Aldrich，目录号：M2643）
28. 鼠标LIF（Sigma-Aldrich，目录号：ESG1106）
29. N-2（Gibco，目录号：11520536）
30. NaCl（Fisher Scientific，目录号：11904061）
31. NaH2Po4（Sigma-Aldrich，目录号：S3139）
32. NAHCO3（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
33. 氮（无氧）（BOC，目录号：44-Y）
34. 非必需氨基酸（Gibco，目录号：12084947）
35. 木瓜蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：P4762）
36. PBS片剂（Thermo Scientific，目录号：BR0014G）
37. 维甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：R2625）
38. SAG（Sigma-Aldrich，目录号：566660）
39. 无菌1X PBS（见配方）
40. 无菌超纯水（见配方）
41. 人类inpc增殖培养基（见配方）
42. 人iastrocyte分化培养基（见配方）
43. 小鼠胚胎干细胞（mesc）增殖培养基（见配方）
44. 小鼠胚胎体（MEB）分化培养基（见配方）
45. 小鼠运动神经元（mmn）培养基（见配方）
46. EB解离缓冲液（见配方）

设备

4°C冰箱
-20°C冷冻柜
-80°C冷冻柜
高压灭菌器
二级生物安全柜（Nuaire，目录号：NU-437-400E）
CO2孵化器（三洋，目录号：MCO-19AIC）
Echo 550液体处理器（Labcyte，目录号：Echo 550）
血细胞仪
Harrier 15/80台式离心机（MSE，目录号：msb.080.cx1.5）
2000细胞内分析仪（GE Healthcare，目录号：52-851714-001）
液氮杜瓦
机械移液管（p10，p50，p200，p 1000）
多通道机械移液管（p10，p50）
多功能控制器（Roylan开发，目录号：SPOD0012）
机械移液枪
PK120离心机，配有T336旋转式离心机（ALC，目录号：11200030）和微孔板吊桶（ALC，目录号：11210267）
水浴用聚苯乙烯浮子
存储舱外壳（Roylan开发，目录号：SPOD0010）
水浴
无菌培养罩

软件

回声液体处理软件（Labcyte）
回声板重整术（Labcyte）
2000细胞内分析仪（GE Healthcare）
哥伦布图像数据存储与分析系统（Perkinelmer）
Excel 2016（微软）
graphpad棱镜7.0（graphpad）

程序

第一部分：hb9-gfp小鼠胚胎干细胞（mesc）维持方案
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提前准备mesc维护协议
根据以下配方，在无菌培养箱中制备人iastrocyte分化培养基、小鼠胚胎干细胞（mesc）增殖培养基和无菌1x pbs。
在无菌培养箱中分离或解冻hb9-gfp-mesc前一天解冻原代小鼠胚胎成纤维细胞（mefs）（除非另有说明）
1. 将人iastrocyte分化培养基置于37℃水浴中。
2. 制备纤维连接蛋白涂层组织培养板。
  1. 以1:400的比例向室温PBS中添加1 mg/ml人纤维粘连蛋白，制备每10 cm板18 ml 2.5μg/ml纤维粘连蛋白涂层溶液。
  2. 混合2.5微克/毫升纤维粘连蛋白涂层溶液，并使用10毫升移液管将6毫升移到3 x 10厘米的组织培养板上。
  3. 在室温下，用2.5μg/ml纤维连接蛋白涂层溶液培养平板至少5分钟。
3. 将mefs解冻并接种到人iastrocyte分化培养基中。
  1. 从液氮杜瓦中取出一瓶mefs，用浮子在37℃水浴中解冻。
  2. 用10毫升移液管从10厘米的组织培养板上移去纤维粘连蛋白涂层溶液，并在每个10厘米的组织培养板上加入10毫升温热的人iastrocyte分化培养基。
  3. 使用p1000（1 ml）机械移液管将1 ml解冻的mef从小瓶移到15 ml Falcon中的2 ml温热的人造血干细胞分化培养基中，混合，然后将1 ml该mef混合物移到每个10 cm组织培养板上。
  4. 前后摇动装有MEF的盘子，然后左右混合。
  5. 在37℃/5%co2培养箱中培养过夜，准备在第二天添加解冻的mesc或分离的mesc。
  < BR>
在无菌培养箱中解冻或分离HB9 gfp-mesc（除非另有说明）
1. 将小鼠胚胎干细胞（mesc）增殖培养基和1x胰蛋白酶溶液置于37℃水浴中。
2. 更换含有MEF的10cm板上的介质。
  1. 用p10（10微升）机械吸管将6微升lif添加到50毫升Falcon试管中的45毫升热mesc增殖培养基中，制备45毫升mesc增殖培养基+lif。
  2. 用10毫升移液管从mefs中取出人iastrocyte分化培养基。
  3. 用25毫升移液管将15毫升热mesc培养基+lif加入含有mefs的10厘米板中。
  4. 在37℃/5%co2中培养mefs板至少30分钟，或直到mesc准备好进行培养。
3. 在MEF进料板上解冻和播种MESC。
  1. 从液氮杜瓦中取出一瓶mesc，用浮子在37℃水浴中解冻。
  2. 使用p1000（1 ml）机械移液管将1 ml解冻的mef从小瓶移到15 ml Falcon中的2 ml温热的人造血干细胞分化培养基中，混合，然后将1 ml该mef混合物移到每个10 cm组织培养板上。
  3. 前后摇动装有MEF的盘子，然后左右混合。
  4. 在37℃/5%co2培养箱中培养过夜，准备在第二天添加解冻的mesc或分离的mesc。
  < BR>
在无菌培养箱中解冻或分离HB9 gfp-mesc（除非另有说明）
1. 将小鼠胚胎干细胞（mesc）增殖培养基和1x胰蛋白酶溶液置于37℃水浴中。
2. 更换含有MEF的10cm板上的介质。
  1. 用p10（10微升）机械吸管将6微升lif添加到50毫升Falcon试管中的45毫升热mesc增殖培养基中，制备45毫升mesc增殖培养基+lif。
  2. 用10毫升移液管从mefs中取出人iastrocyte分化培养基。
  3. 用25毫升移液管将15毫升热mesc培养基+lif加入含有mefs的10厘米板中。
  4. 在37℃/5%co2中培养mefs板至少30分钟，或直到mesc准备好进行培养。
3. 在MEF进料板上解冻和播种MESC。
  1. 从液氮杜瓦中取出一瓶mesc，用浮子在37℃水浴中解冻。
  2. 使用p1000（1 ml）机械移液管将1 ml解冻的mefs从小瓶转移到15 ml Falcon中的2 ml热mesc增殖培养基中，混合，然后将1 ml该mesc混合物转移到每个10 cm的mefs板上。
  3. 前后摇动含有mesc的盘子，然后左右混合。
  4. 在37℃/5%co2培养箱中培养mesc板。
4. 或者，到步骤c3，mesc可能已经在培养物中，并且可以被分离（而不是解冻）到mefs上（根据下面的“分离mesc”部分）。
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每天在无菌培养箱中更换mesc上的培养基（除非另有说明）
1. 将mesc增殖培养基置于37℃水浴中。
2. 更换含有mesc的10cm板上的介质。
  1. 用p10（10微升）机械吸管将6微升lif添加到50毫升Falcon试管中的45毫升热mesc增殖培养基中，制备45毫升mesc培养基+lif。
  2. 用25毫升移液管从mesc板上移走大部分培养基，留下几毫升盖住mesc。
  3. 用25毫升移液管向每个mesc板中加入15毫升热mesc培养基+lif。
  4. 在37℃/5%co2中培养mesc板24小时。
  5. 每天重复步骤1和2a-2d。
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每隔3-4天在无菌培养箱中分离mesc
1. 将mesc增殖培养基和1x胰蛋白酶溶液置于37°C水浴中。
2. 在无菌培养箱中将hb9-gfp-mesc分为meb分化培养基（除非另有说明）。
  1. 用25ml移液管从mesc培养皿中取出所有mesc增殖培养基，用10ml移液管在8ml室温pbs中清洗10cm培养皿。
  2. 用10毫升移液管移走所有PBS清洗液，并用p1000（1毫升）机械移液管将1毫升1x胰蛋白酶添加到每个mesc板上。
  3. 在37°C培养箱中用胰蛋白酶培养mesc 5分钟。
  4. 如有必要，培养更长时间，理想情况下，mesc与一些mef混悬。
  5. 用10毫升移液管向每个培养皿中加入10毫升的mesc增殖培养基。
  6. 对于每个mesc板，使用10毫升吸管激发mesc和培养基，并将悬浮液释放回10厘米组织培养板中，同时将吸管喷嘴压到板的底部并施加压力。重复此步骤10次。这个过程有助于将mesc菌落分裂成单个细胞。
  7. 将每个10cm培养板的内容物转移到单独的、干净的10cm组织培养板中，使用10ml移液管，并在37℃/5%co2培养箱中培养30分钟。
  8. 对于每个板，激发mesc悬浮液，并使用10ml移液管用mesc悬浮液清洗板几次，然后将所有mesc悬浮液转移到50ml falcon管中。在一个50毫升的Falcon试管中混合三个10厘米厚的mesc悬浮液。
  9. 在试验台上，在室温下以200x g离心mesc悬浮液4分钟。
  10. 用25毫升移液管移走上清液，然后为转移到Falcon试管中的每10厘米的mesc板添加4毫升mesc增殖培养基。
  11. 用10毫升移液管重新悬浮mesc颗粒。
  12. 将无菌70μm细胞过滤器放入50 ml Falcon管中，然后使用10 ml吸管通过过滤器转移mesc悬浮液。
  13. 用1毫升mesc增殖培养基冲洗过滤器。
  14. 使用p200（200微升）机械移液管将150-200微升的mesc悬浮液添加到mesc media+lif中的每10 cm mef板中。
  15. 前后摇动含有mesc的盘子，然后左右混合。
  16. 在37℃/5%co2培养箱中培养mesc板。
  < BR>

第二部分：人类inpc维护协议
< BR>

预先准备人类inpc维护协议
根据以下配方在无菌培养箱中制备人inpc增殖培养基和无菌1x pbs。
分裂inpc
1. 将人inpc增殖培养基和1x Accutase溶液置于37°C水浴中。
2. 制备纤维粘连蛋白涂层组织培养板，用于inpc的维护。
  1. 以1:200的比例向室温PBS中加入1 mg/ml人纤维粘连蛋白，制备每10 cm组织培养板6 ml的5μg/ml纤维粘连蛋白涂层溶液。\
  2. 混合5微克/毫升纤维粘连蛋白涂层溶液，并使用10毫升移液管将6毫升移到每个10厘米的组织培养板上。
  3. 在室温下，用5μg/ml纤维连接蛋白涂层溶液培养平板至少5分钟。
3. 在无菌培养箱中将inpc分成人类inpc增殖培养基（除非另有说明）。
  1. 用10毫升移液管从inpc中取出所有人inpc增殖培养基，用10毫升移液管在5毫升室温pbs中清洗细胞。
  2. 用10毫升移液管去除所有PBS清洗液，用p1000（1毫升）机械移液管向INPC添加1毫升Accutase。
  3. 用Accutase在37°C培养箱中培养INPC 4分钟。
  4. 轻轻敲击INPC板，将电池从板上完全取出。
  5. 向提升的inpc中加入5ml室温pbs，混合并使用10ml移液管转移到15ml falcon管中。
  6. 在试验台上，在200x g下，在室温下离心inpcs 4分钟。
  7. 倒出上清液，将inpc颗粒重新悬浮在适量的人inpc增殖培养基中。
  8. 用10毫升移液管从10厘米的组织培养板中取出纤维粘连蛋白涂层溶液。
  9. 用10毫升移液管将12毫升温热的人inpc增殖培养基加入10厘米的组织培养板中，该培养板涂有5微克/毫升纤维连接蛋白涂层溶液。
  10. 将再悬浮的inpc溶液适量加入10cm组织培养板中的人inpc增殖培养基中。
  11. 将inpc增殖板在37℃/5%co2培养箱中培养2-4天，或直到inpc达到80-90%的融合率，然后按上述方法再次分裂inpc。
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第三部分：人iastrocyte小鼠hb9 gfp+运动神经元共培养方案 < BR>

预先准备共培养方案
1. 按照以下配方在无菌培养箱中制备人inpc增殖培养基、人iastrocyte分化培养基、小鼠胚胎干细胞（mesc）增殖培养基、小鼠胚胎体（meb）分化培养基、无菌1x pbs和无菌超纯水。
2. 用100%无水二甲基亚砜在384孔聚丙烯源板上制备化合物库，并盖上抗二甲基亚砜箔盖。储存在储存箱外壳中，并使用多功能控制器保持干燥的氮气环境。
3. 使用回声液体处理器软件编写复合传输协议。简单地说，将源板设置为“384pp_dmso”，将目标板设置为“griener_384ps_781096”，并使用自定义映射模式。设置协议，将40 NL的DMSO化合物从源板转移到目的板上的每个井。考虑到目的板上的每口井将有40微升的介质，最终DMSO浓度将为0.1%（v/v）。设定方案为每个试验化合物提供6个技术复制井，阳性对照组提供12-16个技术复制井，阴性对照组提供12-16个技术复制井（仅DMSO）。我们在室内发现了一种化合物，在共培养试验中增加了hb9 gfp+mmn的存活率，我们称之为化合物a，并将其作为阳性对照。对于所选测试化合物的综合剂量响应，我们建议在每半对数，即、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μm处测试7点剂量响应。
4. 在细胞内分析仪2000软件上编写一个“hb9-gfp-mn”协议来成像hb9-gfp+运动神经元。简单地说，设置以下标准：目标=尼康10x；场数=每孔4个；波长=FITC（EX490 nm/EM525 nm）；曝光=0.5 s；聚焦=10%功率下的激光自动聚焦；反褶积=增强比率法，5个周期；板温=37°C。注意，其他高通量fluoRescence显微镜和软件可以分别代替细胞内分析仪2000和细胞内分析仪2000软件，但是成像协议需要相应的调整。
< BR>
将人inpc分化为人iastrocytes（第0天）
1. 将人inpc增殖培养基、人iastrocyte分化培养基、小鼠胚胎体（meb）分化培养基、小鼠胚胎干细胞（mesc）增殖培养基、1份胰蛋白酶溶液和1份淀粉酶溶液置于37℃水浴中。
2. 制备纤维连接蛋白涂层的组织培养板，用于细胞分化。
  1. 以1:400的比例向室温PBS中添加1 mg/ml人纤维粘连蛋白，制备每10 cm板6 ml 2.5μg/ml纤维粘连蛋白涂层溶液。
  2. 将2.5微克/毫升纤维粘连蛋白涂层溶液混合，用10毫升移液管将6毫升移到每个10厘米的组织培养板上。
  3. 在室温下，用2.5μg/ml纤维连接蛋白涂层溶液培养平板至少5分钟。
3. 准备纤维粘连蛋白涂层的组织培养板用于inpc的维护（见上面的人类inpc维护协议）。
4. 在无菌培养箱中将inpc分为人iastrocyte分化培养基或人inpc增殖培养基（除非另有说明）。
  1. 用10毫升移液管从inpc中取出所有人inpc增殖培养基，用10毫升移液管在5毫升室温pbs中清洗细胞。
  2. 用10毫升移液管去除所有PBS清洗液，用p1000（1毫升）机械移液管向INPC添加1毫升Accutase。
  3. 用Accutase在37°C培养箱中培养INPC 4分钟。
  4. 轻轻敲击INPC板，将电池从板上完全取出。
  5. 向提升的inpc中加入5ml室温pbs，混合并使用10ml移液管转移到15ml falcon管中。
  6. 在试验台上，在200x g下，在室温下离心inpcs 4分钟。
  7. 倒出上清液，将inpc颗粒重新悬浮在适量的人inpc增殖培养基中。
  8. 用10毫升移液管从10厘米的组织培养板中取出纤维粘连蛋白涂层溶液。
  9. 用10毫升移液管将12毫升温热的人iastrocyte分化培养基加入涂有2.5微克/毫升纤维连接蛋白涂层溶液的10厘米组织培养板中。
  10. 用10毫升移液管将12毫升温热的人inpc增殖培养基加入10厘米的组织培养板中，该培养板涂有5微克/毫升纤维连接蛋白涂层溶液。
  11. 在10cm的组织培养板中加入适量的再悬浮inpc溶液到人iastrocyte分化培养基中。
  12. 将再悬浮的inpc溶液适量加入10cm组织培养板中的人inpc增殖培养基中。
  13. 将iastrocyte分化板在37℃/5%co2培养箱中培养3天。
  14. 将inpc增殖板在37℃/5%co2培养箱中培养2-4天，或直到inpc达到80-90%的融合率，然后如上所述分离inpc。
< BR>
将mesc区分为meb（第0天）
1. 更换含有mefs的10cm板上的介质（如上述hb9 gfp mesc维护协议所述）。
2. 在无菌培养箱中将hb9-mesc分成meb分化培养基（除非另有说明）。
  1. 拆分mesc（如上hb9 gfp mesc维护协议所述）。
  2. 在9cm培养皿中加入18ml温性meb分化培养基，然后用p1000（1ml）机械吸管加入1ml mesc悬液，通过meb开始mesc向运动神经元分化。分化7天后，每10cm meb板将产生约4x 106hb9 gfp小鼠运动神经元。
  3. 将meb培养板在37℃/5%co2中培养24小时。
  < BR>
在MEB上更换介质（第1-6天）
1. 将meb分化培养基置于37℃水浴中。
2. 在EBS上更换媒体。
  1. 用25毫升移液管将meb和培养基从9厘米培养皿转移到50毫升falcon。
  2. 将猎鹰管在罩内的猎鹰架中孵育10分钟，使MEB沉入猎鹰管底部。
  3. 从顶部向下取出Falcon中的培养基，将最后的5毫升培养基留在Falcon试管底部，该试管含有MEB软颗粒。
  4. 每根falcon管加入15ml新鲜meb分化培养基。
  5. 仅在第2-6天，使用p20（20微升）机械移液管将9微升4毫米维甲酸（在乙醇中）和18微升1毫米凹形液添加到每个Falcon试管中。
  6. 用25毫升移液管将meb和培养基混合，然后转移到新鲜的9厘米培养皿中。
  7. 将mebs培养皿在37℃/5%co2培养箱中培养24小时。
  8. 每天重复步骤1和2a-2g，直到eb分离。
< BR>
更换iastrocytes培养基（第3天）
1. 将人iastrocyte分化培养基置于37℃水浴中。
2. 用10毫升移液管将所有人iastrocyte分化培养基从iastrocytes中移走。
3. 将12毫升新鲜人iastrocyte分化培养基加入每10厘米的iastrocyte组织培养板中。
4. 将培养板在37°C/5%Co2培养箱中培养2天。
< BR>
在384孔板上接种iastrocytes（第5天）
1. 将人iastrocyte分化培养基和1x Accutase溶液置于37°C水浴中。
2. 制备纤维连接蛋白涂层384孔板。
  1. 以1:400的比例向室温PBS中加入1 mg/ml人纤连蛋白，制备每384孔板2 ml的2.5μg/ml纤连蛋白涂层溶液。
  2. 混合2.5微克/毫升纤维粘连蛋白涂层溶液，并将其转移到9厘米的培养皿中作为贮存器。
  3. 使用p10（10微升）多通道机械吸管将5微升纤维连接蛋白涂层溶液转移到384孔板的每个孔中，最外层的孔除外。
  4. 使用P50（50微升）多通道机械吸管，将40微升的PBS转移到384井板上的每一个最外面的井，用作防火墙。
  5. 在室温下，用2.5μg/ml纤维连接蛋白涂层溶液培养平板至少5分钟。
3. 将iastrocytes和种子2000 iastrocytes/孔提升到无菌培养罩中的384孔板上（除非另有说明）。
  1. 用10毫升移液管将所有人iastrocyte分化培养基从iastrocytes中移走，用10毫升移液管在5毫升室温pbs中清洗细胞。
  2. 用10毫升移液管移走所有PBS冲洗液，用p1000（1毫升）机械移液管向iAstrocels中加入1毫升Accutase。
  3. 用Accutase在37°C培养箱中培养iAstrocels 4分钟。
  4. 轻轻敲击iAstrocyte板，将细胞从板上完全取出。
  5. 将5毫升室温PBS添加到提升的iAstrocyte中，混合并使用10毫升移液管转移到15毫升Falcon试管中。
  6. 在试验台上，室温下，以200x g离心4分钟。
  7. 倒出上清液，轻拍Falcon试管底部，轻轻搅动iastrocyte小球，在适量的人iastrocyte分化培养基中重新悬浮iastrocytes。
  8. 制备血细胞仪，并将10微升的iAstrocyte悬浮液转移到计数网格上。
  9. 计算细胞数，计算悬浮液中细胞数/ml。
  10. 在人iastrocyte分化培养基中将iastrocytes稀释至5.7x 104iastrocytes/ml，并将iastrocyte悬液移入9cm培养皿中作为贮存器。
  11. 使用p50（50微升）多通道机械移液管将35微升5.7 x 104iAstrocels/ml悬浮液转移至384孔板的每个孔（不包括最外面的孔）。
  12. 在400x g下使用带有T336旋转装置的PK120离心机和微型板桶将384孔板离心60秒，以将介质和细胞收集到井底。
  13. 将384孔板在37℃/5%co2的培养箱中培养24小时，使iAstrocels粘附在板上。
    < BR>
用化合物治疗iastrocytes（第6天）
1. 使用multipod控制器对storagepod机柜减压，解锁并将384井pp源板从storagepod机柜中取出。
2. 校准并聚焦回声550液体处理器。
3. 在1200x g下，使用带有T336旋转装置的PK120离心机和用于微孔板的桶将384井PP源板离心120 s，以在DMSO中去除化合物中的气体。
4. 对384井含dmso化合物的pp源板进行了调查。应具有足够的体积，以使用所需的化合物转移协议（如上文“在共培养协议之前制备”一节所述）将化合物从源板传送到目的板。此外，该化合物的水分含量应低于70%DMSO是不可接受的，药物应在源板上更新。
5. 使用Echo 550液体处理器，使用复合转移协议，将DMSO中的化合物从384井PP源板转移到384井板的含有iAstrocels的目的板。dmso在iastrocyte培养基中的最终浓度不应超过0.5%（v/v），并且在任何给定的实验中，所有井中的dmso浓度应一致。仅包括DMSO井作为阴性对照。
6. 在400x g下使用带有T336旋转装置的PK120离心机和微型板桶将384孔板离心60秒，以将介质和细胞收集到井底。
7. 将384孔板在37℃/5%co2培养箱中培养24小时。
8. 将防DMSO箔盖放回384井PP源板上，然后返回存储箱外壳，锁定，然后使用多功能控制器用氮气重新加压存储箱外壳。
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用复合处理的iastrocytes分离mebs和小鼠gfp+运动神经元（第7天）
1. 根据以下配方在无菌组织培养罩中制备EB分离缓冲液。
2. 根据以下配方，在无菌组织培养罩中制备适当体积的小鼠运动神经元（mmn）培养基。
3. 将mmn介质、eb解离缓冲液和fbs置于37°c水浴中。
4. 分离mebs
  1. 将MEB和介质从一个或两个MEB板转移到一个50毫升的Falcon管中。
  2. 在试验台上，在200x g下，在室温下离心mebs 2分钟。
  3. 用25毫升移液管移走上清液，并在10毫升PBS中重新悬浮MEB。
  4. 在试验台上，在200x g下，在室温下离心mebs 2分钟。
  5. 用10毫升移液管移走PBS清洗液。
  6. 将4.75 ml热eb解离缓冲液和100微升200 u/ml木瓜蛋白酶添加到每个mebs的falcon中。
  7. 用p1000（1毫升）机械吸管轻轻上下吸管十次。
  8. 将Falcon试管在37°C水浴中培养3分钟。
  9. 取下管子并轻轻摇动，然后返回37°C水浴2分钟。
  10. 用p1000（1毫升）机械吸管轻轻地上下吸管MEB溶液十次。
  11. 重复步骤h-j至多3次，或直到溶液浑浊且没有大的meb团。
  12. 根据木瓜蛋白酶的活性，可能需要向猎鹰中添加200 u/ml的木瓜蛋白酶，以完全分离mebs。
  13. 同样，避免过度的木瓜蛋白酶处理，因为细胞会溶解。
  14. 在试验台上，在300x g下，在室温下离心5分钟。
  15. 对于每50ml Falcon试管，制备2.7 ml EB解离缓冲液，并使用P200（200微升）机械移液管添加300微升FBS和150微升0.5 mg/ml DNA酶I，并使用10 ml移液管混合FBS/DNA酶I溶液。
  16. 用10毫升移液管从分离的mebs中除去上清液，并用10毫升移液管添加3毫升fbs/dnase i溶液。
  17. 用p1000（1毫升）机械吸管轻轻上下吸管五次。
  18. 用10毫升移液管将5毫升FBS非常缓慢地添加到含有分离的MEB的50毫升Falcon的底部。这就产生了缓冲，meb溶液（上部）和fbs（下部）之间的界面应该清晰可见。
  19. 在试验台上，在室温下将mebs在100x g下离心6min，使分离的细胞颗粒化，同时在上清液部分留下碎片。
  20. 用10毫升移液管移走上清液，然后在适当体积的mmn培养基中轻轻地重新悬浮细胞。
  21. 用p1000（1毫升）机械吸管轻轻地上下吸管mmn溶液五次。
  22. 将无菌的40μm细胞过滤器放入50 ml Falcon管中，然后使用5 ml吸管通过过滤器转移mmn悬浮液。
  23. 使用p1000（1 ml）机械吸管用1 ml mmn介质冲洗过滤器。
  24. 制备血细胞仪，并将10微升mmn悬浮液转移到计数网格上。
  25. 计数明亮的圆形细胞，排除较暗的粗糙边缘细胞和潜在碎片（图2），然后计算悬浮的神经元细胞/ml。
  26. 在mmn培养基中将mmn稀释至2.5x 106neuronal cells/ml，并将mmn悬液移入9cm培养皿中作为贮存器。
  27. 使用p50（50微升）多通道机械吸管将10微升2.5 x 106神经元细胞/ml悬浮液转移到384孔板的每个孔中，该孔板含有经化合物处理的iastrocytes，不包括最外层的孔。
  28. 在400x g下使用带有T336旋转装置的PK120离心机和微型板桶将384孔板离心60秒，以将介质和细胞收集到井底。
  29. 将384孔人iastrocyte小鼠运动神经元共培养板在37℃/5%co2培养箱中培养24小时。 < BR>
    图2。用血细胞仪计数来自小鼠胚胎体的细胞。来自小鼠胚胎体（mebs）的明亮圆形细胞包括在神经元细胞计数中（四个小箭头表示示例）。较暗的粗糙边缘细胞和潜在的碎片被排除在神经元细胞计数之外（两个大的V形表示例子）。比例尺=100微米。
    < BR>
将培养基添加到共培养板（第8天）
1. 根据以下配方，在无菌组织培养罩中制备适当体积的小鼠运动神经元（mmn）培养基。
2. 将mmn介质置于37°C水浴中。
3. 使用p50（50微升）多通道机械移液管，向含有iAstrocyte-mn共培养物的384孔板（不包括最外面的孔）的每个孔中添加15微升暖mmn培养基。
< BR>
在高通量显微镜上成像HB9 gfp+mn（第8天和第10天）
1. 打开照明器并预热试管内分析仪2000至37°C。
2. 一旦照明器准备好，使用细胞内分析仪2000（图3）运行“HB9-gfp-mn”方案（如上文“在共培养方案之前准备”一节所述）来对共培养板中的HB9-gfp+运动神经元进行成像。为了进行下游分析，在共培养方案的第8天和第10天成像的hb9 gfp+运动神经元分别称为第1天和第3天。
3. 将共培养板培养在37℃/5%co2培养箱中。
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  图3。人类iastrocyte-hb9-gfp+mmn共培养的示例图像。人类iastrocyte和hb9-gfp+mmn在mmn接种后1天和3天共培养的代表图像，使用gfp通道在细胞内分析仪2000上成像。在mmn共培养前24小时，用dmso处理iastrocytes，或用复合物a处理iastrocytes。在共培养3天后，与仅用dmso处理的井相比，用化合物a处理的井有更大的mmn存活率。比例尺=200微米。
  
  < BR>

数据分析

运动神经元活性评估
1. 将细胞内分析器2000上捕获的.xcde/.tif文件导入Columbus图像数据存储和分析系统。
2. 在哥伦布图像数据存储和分析系统上编写一个分析协议，可以识别和计算gfp+mmn。分析协议由Columbus图像数据存储和分析系统的图像分析部分中的几个“构建块”或步骤组成，详细描述如下：
  1. 输入图像。这里，图像被加载到分析协议中（图4a）。将堆栈处理设置为“单个平面”，不设置“平场校正”和“快速调整”。
  2. 找到细胞核。识别运动神经元的gfp+细胞体（图4b）。在gfp频道上使用方法“m”。方法“m”是哥伦布图像数据存储和分析系统上提供的一种稳健方法，用于从一系列不同类型的图像中检测称为“核”的圆形物体。
  3. 计算形态特性。这一步骤允许计算标准的形态特征，如图像中gfp+细胞体或“细胞核”的面积或圆度。在此步骤中使用“标准方法”，它允许根据单元格区域大小过滤图像。
  4. 选择人口（1）。选择大于120像素2且宽长比大于0.2的gfp+细胞体的总体（图4c）。这样可以过滤掉小的gfp+物品，如碎片。
  5. 计算强度特性。此步骤允许计算标准强度属性，例如图像中gfp+细胞体或“细胞核”的平均像素强度。在此步骤中，请使用Columbus图像数据存储和分析系统中的“标准方法”选项。
  6. 选择人口（2）。选择平均像素强度大于2000（任意单位）的gfp+细胞体的总体（图4d）。这将过滤掉暗色gfp+物品，如碎片。
  7. 找到神经突。这一步骤识别从gfp+细胞体生长的gfp+神经突（由步骤b-f定义）（图4e）。使用“CSIRO神经轴突分析2”分析方法，该方法由澳大利亚CSIRO研究所开发的算法完成。这个步骤中使用的精确参数可能需要对不同的实验重复进行一些细微的修改。
  8. 选择人口（3）。选择至少有一个突起（在步骤g中定义）相连的gfp+细胞体（由步骤b-f定义）的总体（图4f）。这个种群是存活的gfp+mmn的数量。没有轴突附着的gfp+细胞体死亡，因此从活的gfp+mmn计数中滤过。
  9. 定义结果。此步骤对图像中的多个参数进行统计分析，包括gfp+细胞体的数量、至少有一个轴突的gfp+细胞体的数量（即，活gfp+mmn）以及其他形态和强度特性。
    < BR>
    图4。哥伦布图像数据存储与分析系统的分析协议，用于识别和计数gfp+mmn。a.将gfp通道中的图像加载到哥伦布图像分析软件中。比例尺=200μm。b.圆形gfp+项目被识别，然后用多种不同颜色突出显示，以区分不同的项目。这些圆形gfp+项目包括mmn细胞体。c.选择大小大于120像素2的gfp+项目（绿色），而小于120像素2的gfp+项目被排除（红色）。d.选择平均强度大于2000的gfp+项目（绿色），而排除平均像素强度小于2000的gfp+项目（红色）。e.从gfp+细胞体生长的gfp+轴突被识别，然后用多种不同颜色突出显示，以区分不同的轴突。f.计算至少有一个轴突附着（绿色）的gfp+细胞体的数量，排除没有轴突的gfp+细胞体（红色）。在每张图像右上角插入的框中，用白色虚线框突出显示的区域放大2倍。
    < BR>
3. 使用步骤2中描述的分析协议，使用Columbus图像数据存储和分析系统的批处理分析部分，计算第1天和第3天的图像中的可行gfp+mmn的数量。
4. 将结果文件导出到Excel 2016。
5. 在图7.0中绘制第3天的存活gfp+mmn数量。
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统计分析
所需的精确统计分析取决于实验装置。通常，当在一个iastrocyte细胞系中以单剂量或多剂量筛选多个化合物时，使用dunnet事后检验（将每个条件与dmso对照进行比较）进行单向方差分析。在图7.0中进行统计分析（图5）。
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图5。例HB9-gfp+mmn在第3天从iAstrocyte-HB9-gfp+mmn共培养分析的384孔板中计数。-ve control=dmso only，+ve control=compound a.
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笔记

注意使用的血清批次，因为这会影响共培养结果。我们推荐相同批次的血清用于任何给定批次的工作，例如，筛选化合物库。
在光学显微镜下观察时，mesc应显示为大而明亮的菌落，边缘清晰。如果菌落变成深灰色，或边缘粗糙或不清晰，mesc已经分化，分化后将产生较低的hb9 gfp+mns产量。
mesc在培养过程中一直生长到第18代，然后被较年轻的后代所取代。这是因为当mesc达到较高的传代率时，它们所能产生的hb9 gfp+mn的产量就会降低。
在共培养方案的第7天，使用绿色荧光显微镜观察mebs。如果meb分化良好，那么gfp+细胞的比例应该很高，并且gfp的表达水平也很高。如果meb较暗，或gfp表达水平较低，则mn产量较低，不宜在共培养中使用。
当使用iastrocyte-hb9-gfp+mn共培养法进行高通量药物筛选试验时，我们建议阴性对照组（仅dmso）和阳性对照组（内部鉴定的化合物a）至少使用12个技术复制品（384孔板上的单独孔）。对于实验条件，1个技术复制就足够了，但我们建议使用6个技术复制。此外，在二次验证实验中，我们强烈建议每个实验条件使用6个技术复制品（阳性和阴性对照至少使用12个技术复制品）。对于高通量屏幕和二次验证实验，也建议至少重复3次实验。
当用2.5或5.0微克/毫升纤维连接蛋白涂层溶液覆盖10cm组织培养板时，没有最佳的培养时间。但是，我们建议在室温下至少5分钟，或者在4°C下过夜。

食谱

Sterile1x PBS
将5片PBS片加入500毫升Milli-Q超纯水中，并在121℃高压灭菌15分钟
使用前让PBS冷却至室温
无菌超纯水
在121°C下高压灭菌500毫升Milli-Q超纯水15分钟
使用前让水冷却至室温
人inpc增殖培养基 class=“ke zeroborder”bordercolor=“000000”style=“width:350px；”border=“0”cellspacing=“0”cellpadding=“2”>dmem/f-12，谷氨酰胺
500毫升
n-2
5毫升
B-27
5毫升
4毫克/毫升FGF
5微升
人iastrocyte分化培养基 class=“ke zeroborder”bordercolor=“000000”style=“width:350px；”border=“0”cellspacing=“0”cellpadding=“2”>dmem
500毫升
n-2
1毫升
< >fbs
< >50毫升
笔迹
< >5毫升
小鼠胚胎干细胞（mesc）增殖培养基 class=“ke zeroborder”bordercolor=“000000”style=“width:350px；”border=“0”cellspacing=“0”cellpadding=“2”>击倒dmem
< > < > 400毫升
esc fbs
< >75毫升
谷氨酰胺
5毫升
非必需氨基酸
< >5毫升
< >2-巯基乙醇
< >3.6微升
小鼠胚胎体（meb）分化培养基
class=“ke zeroborder”bordercolor=“000000”style=“width:350px；”border=“0”cellspacing=“0”cellpadding=“2”>击倒dmem
222.5毫升
火腿的F-12营养素混合物
222.5毫升
敲除血清置换< BR>50毫升
谷氨酰胺
2.5毫升
30%（w/v）过滤葡萄糖
2.5毫升
n-2
5毫升
2-巯基乙醇
4微升
使用Steritop过滤器过滤
小鼠运动神经元培养基 class=“ke zeroborder”bordercolor=“000000”style=“width:350px；”border=“0”cellspacing=“0”cellpadding=“2”>meb分化培养基
40毫升
200微克/毫升bdnf
4微升
200微克/毫升cntf
4微升
200微克/毫升GDNF
4微升
eb解离缓冲液
class=“ke zeroborder”bordercolor=“000000”style=“width:400px；”border=“0”cellspacing=“0”cellpadding=“2”>无菌Milli-Q超纯水
31.472毫升
1 m氯化钠
4.64毫升
1米KCl
0.216毫升
1米NaHCO3
1.04毫升
0.1 m NaH2Po4
0.4毫升
0.1米cacl2
0.6毫升
0.1米mgso4
0.4毫升
30%（w/v）过滤葡萄糖
1毫升
0.5米EDTA
0.04毫升
25 mg/ml L-半胱氨酸
0.192毫升
使用0.2μm注射器过滤器过滤

致谢

我们要感谢所有为这项研究捐赠样本的als患者。HB9gfp-mesc是托马斯·杰塞尔教授的一份厚礼。inpc重编程和iastrocyte分化方案是由kathrin meyer博士和laura ferraiuolo博士在brian kaspar教授的实验室中开发的。这项工作由S.P.A.的运动神经元疾病协会高级研究员奖（赠款编号956-799，MNDA注册慈善机构编号294354）资助。L.F.和M.J.S.由Benevolentai资助。L.F.由医学科学院（SBF002\1142）资助。