材料和试剂

12孔板（VWR，目录号：665180）
10μl过滤嘴（Thermo Fisher，目录号：11977714）
100μl过滤嘴（Thermo Fisher，目录号：11953466）
1000μl过滤嘴（Thermo Fisher，目录号：11973466）
6孔板（VWR，目录号：734-2323）
18毫米盖玻片（VWR，目录号：631-0153）
5毫升移液器（VWR，目录号：606180）
10毫升移液器（VWR，目录号：607180）
15毫升管（VWR，目录号：525-0400）
显微镜载玻片（VWR，目录号：631-0108）
注射器针头（BD Biosciences，目录号：300400）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542-5MG）
Accutase（Merck-Millipore，目录号：sf006）
抗MAP2抗体（Abcam，目录编号：AB5392）
抗MBP抗体（Covance，目录号：SMI-99P）
Anti-Olig2抗体（Merck-Millipore，目录编号：AB9610）
抗SMI312抗体（Eurogentec，目录编号：SMI-312P-050）
阿拉伯糖基胞嘧啶（AraC）（Merck-Millipore，目录号：251010）
β-巯基乙醇（赛默飞世尔科技，目录号：21985023）
B27含维生素A（赛默飞世尔科技，目录号：17504-044）
不含维生素A的B27（赛默飞世尔科技，目录号：12587-010）
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（Peprotech，目录号：100-18B-50ug）
脑源性神经营养因子（BDNF）（Peprotech，目录号：450-02）
生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4501-100MG）
牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇，目录号：A9418）
环磷酸腺苷（cAMP）（西格玛，目录号：D0260-5MG）
定义胰蛋白酶抑制剂（DTI）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R007100）
含有Glutamax的DMEM / F12（Life Technologies，目录号：21331-020）
不含L-谷氨酰胺的DMEM / F12（Life Technologies，目录号：21331-046）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
Dorsomorphin（Tocris Bioscience，目录号：3093/10）
表皮生长因子（EGF）（Peprotech，目录号：AF-100-15-500ug）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Invitrogen，目录号：15575-038）
胎牛血清（FBS）（ThermoFisher Scientific，目录号：16140063）
Fluoromount G（Southern Biotech，目录号：0100-01）
胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）（Peprotech，目录号：450-10）
Geltrex（Life Technologies，目录号：A1413302）
Glutamax（赛默飞世尔科技，目录号：35050-038）
山羊抗大鼠/小鼠/兔/鸡/豚鼠Alexa Fluor抗体（Life Technologies）
肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3393-50KU）
HEPES（赛默飞世尔科技，目录号：15630-056）
Human Sonic Hedgehog（hSHH）（Peprotech，目录号：100-45-500ughSHH）
胰岛素样生长因子1（IGF1）（Peprotech，目录号：100-11-100ug）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I9278）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P5405-250gr）
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P5379）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030-024）
小鼠层粘连蛋白（mLaminin）（Sigma-Aldrich，目录号：L2020-1mg）
N2补充剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：17502-048）
Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S7907-500gr）
NaCl（VWR，目录号：S9888-1Kg）
Neurobasal培养基（赛默飞世尔科技，目录号：21103-049）
Neurotrophin 3（NT3）（Peprotech，目录号：450-03-100ug）
Noggin（Peprotech，目录号：120-10C）
非必需氨基酸（NEAA）（赛默飞世尔科技，目录号：11140-035）
正常山羊血清（NGS）（Life Technologies，目录号：16210-064）
青霉素/链霉素（Pen / Strep）（西格玛奥德里奇，目录号：P0781）
多聚甲醛（PFA）16％（电子显微镜科学，目录号：15710-S）
Poly-L-ornithine（PLO）（Sigma-Aldrich，目录号：P3655-100mg）
Rock Inhibitor（RI）（Y27632; Selleckchem，目录号：S1049）
维甲酸（RA）（西格玛奥德里奇，目录号：R2625-100MG）
SB431542（Selleckchem，目录号：S1067）
三碘甲状腺原氨酸（T3）（西格玛奥德里奇，目录号：T6397-100MG）
TeSRE8（干细胞技术，目录号：5940）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787-100ml）
TryplE（Life Technologies，目录号：12563-029）
丙戊酸（VPA）（Sigma-Aldrich，目录号：P4543-10G）
维生素C /抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A4544-25G）
N1补充剂（Sigma-Aldrich，目录号：N6530-5ML）
Neuroglia共培养基（参见食谱）
含有维生素A的神经维持培养基（NMM）（见食谱）
不含维生素A的神经维持培养基（NMM）（见食谱）
N2培养基（见食谱）
NB介质（见食谱）
阻塞缓冲液（见食谱）
PBS（见食谱）
PLO / mLaminin涂层（见食谱）
Geltrex涂层（见食谱）

设备

移液器控制器（BD Biosciences，型号：Falcon Express）
培养箱（粘合剂，型号：9140-0044; 5％CO 2 ，20％O 2 ）
培养箱（粘合剂，型号：9140-0044；5%CO2，20%O2）
片剂顶部离心机（Eppendorf，型号：离心机5810）
-80-C冷冻柜（Thermo Fisher Scientific；型号ULT1786-6-V49）
亮场显微镜（蔡司，型号：Axiovert 40C.）
荧光显微镜（徕卡微系统，型号：徕卡DM6000B）

软件

哥伦布2.5在线软件（Perkin Elmer）
徕卡高级荧光应用套件（徕卡）

程序

神经分化
神经元根据先前发表的协议进行分化（Shi等人，2012年；Nadadhur等人，2017年），很快：
1. HIPSC在1毫升的Tesre8培养基中通过盖尔特涂层的12孔板，每孔10毫米ri。
2. 每天刷新全部中等。
3. 两天后（或当细胞100%汇合时），加入1毫升含有维生素A+1毫米背吗啡+10毫米SB431542的神经维持培养基（NMM）。
4. 每天刷新所有媒体，直到第12天。
  注意：在第8天到第12天之间，应出现均匀的神经上皮层（见图1）。
5. 按照配方中的说明，准备PLO/MLaminin涂层6孔板。
6. 通过手工切割收集神经上皮玫瑰花结细胞（NES细胞）（见注释中的描述）并将其置于6孔板中。< BR> 注：用维生素A+1毫米多索芬+10毫米SB431542+10毫米碘化锂制备新鲜的预热NMM。从12孔板上取出培养基，用PBS清洗一次，然后加入1毫升新制备的培养基。用70%乙醇消毒显微镜区域，并用10毫米的尖端切割玫瑰花结，以标记其边缘并将其提起。用5毫升移液管收集漂浮的玫瑰花结，并将其移到pLO/mLaminin涂层的6孔板上，用维生素A+1毫米多索芬+10毫米SB431542+10毫米ri的NMM。12孔板的1孔的所有玫瑰花结都镀在6孔板的1孔中。
  < BR>
  图1。Brightfield图片显示了在第8天到第12天之间形成的神经丛结构。比例尺=200米。
  < BR>
7. 第13天，将培养基改为2毫升预热的NMM，加入维生素A+20 ng/ml bFGF+20 ng/ml EGF。
8. 每天取出1毫升培养基，加入1毫升预先加热的NMM和维生素A+40 ng/ml bFGF+40 ng/ml EGF。当细胞汇合时，用锥虫以1:2或1:3的比例传代细胞，如下所述。
  注：
  1. 细胞可在NES细胞期保存1-4代。
  2. 当只改变一半培养基时，生长因子浓度加倍：与留在井中的培养基一起，浓度将与步骤a7中的浓度相似。
  3. 锥虫通道：从井中取出所有培养基，加入300毫升预热锥虫。在井周围旋转，在室温（RT）下培养2分钟。加入600毫升预热DTI或培养基以停止反应，并将细胞收集到含有5毫升NMM的试管中。在室温下以300 x g的速度旋转5分钟，然后将颗粒重新悬浮在所需的介质中。
9. 为了开始神经诱导，将锥状通道后的NES细胞置于PLO/mLaminin包被的12孔板中，预先加热，每孔1毫升NMM+20 ng/ml bFGF+20 ng/ml EGF。
10. 当细胞达到80%-90%汇合时，将一半培养基（500 m/井）切换到预热的氮气培养基+800ng/ml HSHH。
  注：这被视为差异化协议的第一天。
11. 在第4天之前，每天用预热的N2培养基+800 ng/ml HSHH刷新一半培养基（500 m/井）。
12. 在第5天，将一半的培养基（500米/井）切换到预热NB培养基+40毫米VPA。
13. 在第7天之前，每天用预热的NB培养基+40毫米VPA刷新一半培养基（500米/井）。
14. 如食谱所述，在第8天之前准备好涂有plo/mlaminin的12孔盘子。
15. 在第8天，用Accutase1:2或1:3将神经祖细胞传至一个新井（解释见注释）。在预热的1.5ml NB培养基+20ng/ml BDNF+10ng/ml GDNF+10ng/ml IGF1+1μm cAMP中培养板细胞。
  Accutase处理：取下所有培养基，每孔12孔培养皿中加入300μl Accutase，将培养皿放回培养箱5-7分钟。轻轻敲击培养皿，细胞会明显脱落。此时，将细胞收集在试管中，加入5毫升新鲜预热培养基，在室温下以300×g旋转5分钟，并将颗粒重新悬浮在所需培养基中。小心地重新使用；不要将块分成单个单元格。
16. 直到第18天，每周三次刷新培养基，去除1毫升培养基，加入1毫升预热NB培养基+30 ng/ml BDNF+15 ng/ml GDNF+15 ng/ml IGF1+1.5μm cAMP。
17. 在第12天，准备一个12孔夹心板，如注释、图2和视频1所述。如食谱所述，在盘子上涂上盖尔特。在每个含有预热DMEM/F12培养基（谷氨酰胺+10%FBS+1x NeAA+1x Pen/Strep）的孔中放置25000个原代大鼠星形胶质细胞。
  注：夹心板准备：取12孔板，用火焰加热无菌注射器针头。在每口井的4个角上打孔，使井的塑料底部均匀地出现小凸起。这些凸起将有助于在其上悬挂一个盖玻片，与井底的细胞相隔一小段距离。参见图2和视频1。
  < BR> 视频1.夹层板
  < BR>
18. 在第18天之前，准备所需数量的12孔板，其中包含直径为18 mm的盖玻片，并按照配方中的说明涂上plo/层粘连蛋白。
  注意：盖片可在4°C下用副膜密封板，最多保存1周。
19. 在第18天，如注释所述，用Accutase使神经元单细胞悬浮。在预先加热的1毫升NB培养基+20纳克/毫升BDNF+10纳克/毫升GDNF+10纳克/毫升IGF1+1μm cAMP中，在预先涂层的PLO/mLaminin盖玻片上每12孔板上放置150万个细胞。
  注：取下所有培养基，每孔12孔板中加入300μl的Accutase，并将培养板放回培养箱10-15分钟。轻轻敲击培养板，细胞会明显脱落。用1000μl移液管缓慢分离Accutase中的细胞，并用5 ml神经基础培养基移液管移到15 ml管中。在室温下，以300 x g旋转5分钟。取出上清液，非常轻地将颗粒重新放入1 ml NB培养基中，并尝试使用1000μl移液管非常轻地打破细胞团（上下移液管最多3-4次）。然后离开管子2-5分钟，让大团块在底部沉淀下来。将上清液放入另一个试管中；搅拌颗粒（大团不会有成熟细胞，但主要是增殖前体细胞）。
  < BR>
  图2。三明治板准备。a.取12孔板和无菌注射器针头。把针点燃，直到它变热。用滚烫的针头在井（B-D）的四个侧面做一个凸起。星形胶质细胞将被镀在板的底部，一个有神经元的盖玻片可以被倒置在板的顶部。床单会靠在颠簸处。另请参见视频1。
  < BR>
20. 第19天，翻转盖玻片，将粘附的神经元倒置在星形胶质细胞板上的突起上。< BR> 注意：到目前为止，星形胶质细胞应该已经达到80%的汇合，以便支持神经元。
21. 用预先加热的nb培养基+40ng/m l bdnf+20ng/ml gdnf+20ng/ml igf1+2μm camp，每周更换一半培养基（500μl/孔）。
22. 在第二次刷新前一天（24/25天），向培养物中添加1μm arac以阻止增殖。
23. 第二天（第25/26天）用预热的NB培养基+40 ng/m l BDNF+20 ng/ml GDNF+20 ng/ml IGF1+2μm cAMP刷新一半培养基（500μl/孔）。
24. 将培养基保存到第37天（见图3），同时按步骤21所述每周刷新培养基两次。
  < BR>
  图3。共培养前37天神经元的Brightfield图像，显示三明治培养中神经元网络的形成。比例尺=100μm。
  
  < BR>
opc差异
OPC是根据先前发布的协议（Izrael等人，2007）生成的，很快：
1. 用EDTA穿过HIPSC，并在3毫升预热NMM中的抗粘附6孔板上镀上Vit A+20 ng/ml EGF+4 ng/ml bFGF+10μm Ri+20 ng/ml T3/孔，以形成胚状体（EB）（见图3）。
  注：对于1口EBS井，使用2口IPSC井。
2. 第二天（第1天），刷新培养基：将细胞旋转到孔的中间，小心地吸出2毫升培养基。加入2毫升预热的NMM，Vit A+20 ng/ml EGF+4 ng/ml bFGF+10μm Ri+20 ng/ml T3。
3. 在第2天，用预先加热的NMM（含维生素A+20 ng/ml EGF+4 ng/ml bFGF+10μm RA）刷新步骤B2中所述的培养基。
4. 每隔一天重复一次。
5. 在第10天，如注释所述，将EBS板放在盖尔特涂层板上。如果EBS变得非常暗，或者密度降低，则在第10天之前，但不是在第4天之前，放置EBS。根据我们的经验，第8天最理想（见图4）。
  注：通过在15或50毫升的试管中收集带有EBS的介质，在盖尔特涂层板上放置EBS。离开管子2-3分钟，让电子束稳定下来。小心地吸出大部分培养基，并在适当数量的所需培养基中重新使用EBS（12孔板为1毫升，6孔板为2毫升）。在第4-9天，在预热的NMM中用维生素A+20 ng/ml EGF+4 ng/ml bFGF+10μm RA+20 ng/ml T3镀EBS。如果在第10天电镀EBS，则应使用含有维生素A+20 ng/ml EGF+20 ng/ml T3的NMM。
  < BR>
  图4。Brightfield图片显示胚胎体形成（A）和胚胎体细胞在盖尔特涂层板（B）上电镀后的生长。比例尺=500μm。
  < BR>
6. 第10天，将所有培养基切换至预热NMM，维生素A+20 ng/ml EGF+20 ng/ml T3。
7. 从现在起：每隔一天刷新培养基，当细胞达到90%的密度时，用Accutase将其分裂到一个新的盖尔特涂层板上。< BR> 注：传代后将ri加入培养基中，帮助细胞恢复。
8. 在第18天，将培养基改为不含vit a+20ng/ml egf的nmm；如步骤b7所述，保持细胞的新鲜和分裂。
9. 第37天，将培养基改为不含维生素A+5 ng/ml bfgf+5 ng/ml egf+1μg/ml mlaminin+50μg/ml vit c的nmm；如步骤B7所述，保持细胞的新鲜和分裂。
10. 第39天，将培养基改为不含维生素A+5 ng/ml bfgf+5 ng/ml egf+1μg/ml mlaminin+50μg/ml vit c+50 ng/ml noggin的nmm；如步骤B7所述保持细胞的新鲜和分裂。
11. 在第42天，将培养基改为不含维生素A+1μg/ml小鼠层粘连蛋白+50μg/ml维生素C+50 ng/ml诺金的NMM；如步骤B7所述保持细胞的新鲜和分裂。
12. 将opc培养物保存在步骤b11的培养基中直到第65天（见图5）。
  < BR>
  图5。opc分化。在opc分化方案结束时，细胞呈现胶质形态（a，45天），并表达opc标记物，如olig2（b，65天）。比例尺=100μm。
  
  < BR>
神经元opc共培养
1. 在共培养的第1天，移动第37天的神经元并将第65天的opcs固定在顶部：
  1. 取一个新的12孔板。
  2. 用钳子从大鼠星形胶质细胞板上取下第37天的神经元覆盖物，并将其放入一个新的12孔板中（顶部有神经元，因此将覆盖物翻转至星形胶质细胞板上的情况进行比较）。
    注意：由于神经元盖玻片中已经含有涂层，因此无需对新板进行涂层。
  3. 加入1毫升预热的神经胶质细胞共培养基。
  4. 用第65天的OPC做一个盘子。
  5. 取出培养基，用PBS清洗板一次。
  6. 去除PBS，向每个孔（6孔板）添加750μL Accutase。
  7. 将培养板在37°C下培养5-10分钟。
  8. 轻轻敲击，检查细胞是否从培养板上脱落；如果没有，则继续培养。
  9. 当细胞分离时，用预先加热的9毫升DMEM/F12在15毫升试管中收集细胞悬浮液。
  10. 在300x g下旋转5分钟。
  11. 在1毫升预热神经胶质细胞共培养基中再培养细胞。
  12. 取10μl细胞悬液进行细胞计数。
  13. 板4 x 10512孔板上的每个盖片的OPC。
2. 每周更新培养基的一半两次：取出500μl培养基，加入500μl新的预热神经胶质细胞共培养基。
3. 在共培养的第28天，用4%pfa固定细胞15-20分钟，并立即用盖玻片进行免疫染色（见图6）。
  < BR>
  图6。共培养物的免疫染色。（a）显示许多olig2阳性的opcs和mbp阳性的成熟少突胶质细胞有map2阳性的树突。（b）显示少突胶质细胞（MBP阳性）与树突（MAP2阳性）紧密相互作用，比例尺=25μm。
  
  < BR>
免疫染色
1. 用PBS清洗板6 x 5分钟。
2. 拆下PBS。
3. 每口井加入300μl封闭缓冲液。
4. 室温下孵育1h。
5. 拆下阻塞缓冲器。
6. 加入稀释在300μl封闭缓冲液中的一级抗体。
7. 在室温下孵育1h，然后在4℃下过夜。
8. 用PBS清洗6 x 5分钟。
9. 在300μl封闭缓冲液中加入稀释1:1000的二级抗体。
10. 室温下孵育2小时。
11. 用PBS清洗6 x 5分钟。
12. 拆下PBS。
13. 加入1:1000稀释在PBS中的DAPI。
14. 室温下孵育2分钟。
15. 用PBS清洗1个。
16. 将盖玻片和荧光支架G倒置安装在显微镜玻片上。

数据分析

盖玻片可以用OPC成熟标记（例如OLIG2、MBP）和神经元形态学标记（例如MAP2、SMI312）染色。根据我们的经验，对于一个对照系，大约有10%的olig2+细胞，1-2%的mbp+细胞和大约40%的细胞是map2+神经元。注：OLIG2和MBP并不标记所有人类少突胶质细胞系细胞。
单元属性可以通过自动化软件包进行分析，例如Columbus 2.5在线软件（请参见https://www.perkinelmer.com/nl/product/image-data-storage-and-analysis-system columbus有关columbus软件的更多信息，以及图7（例如分析图片）用于分析神经元形态学的算法，可以使用形态学、soma识别和共同定位。更准确地说，基于map2和核染色可以确定每个神经元的树突密度和平均树突密度。基于SMI312染色的类似分析可用于分析轴突密度。
opc成熟度可以通过免疫染色来评估成熟的少突胶质细胞标志物，如mbp。因为不同的细胞系可能以不同的速度生长，并且在少突胶质细胞的产生中有不同的效率，所以最好将MBP阳性的数量与OLIG2阳性的OPC的数量联系起来。
正确的统计分析取决于感兴趣的研究问题。例如，这也取决于培养设置，即，当用来自不同患者和对照系的神经元培养1个对照少突胶质细胞系时，与所有对照/患者少突胶质细胞与对照/患者神经元的组合相比。关于我们如何进行统计分析，请参见Nadadhur等人（2019年）。
< BR>
图7。哥伦布细胞分析的例子。荧光图像可以导入到哥伦布（a）中，哥伦布（a）具有预先编程的设置，以查找细胞核（b）和跟踪轴突（c）。输出包括最大轴突长度、总轴突长度和每个细胞的末端数等参数。

笔记

由于IPSC分化协议中存在一些常见的变异，我们建议在神经元OPC共培养开始之前进行一些质量检查。

通过在分化方案的57-60天左右检测olig2的表达，可以验证opc的正确分化。
在培养的第37天，map2/beta-iii微管蛋白/neun染色可以证实神经元的分化是正确的。如果观察到gfap的表达，建议丢弃培养物，因为胶质细胞污染可能干扰患者和对照ipscs的混合共培养物。更多无神经胶质细胞的神经元培养图像，请参见Nadadhur等人（2017年）。

食谱

神经胶质细胞共培养基
480ml dmem/f12
480ml神经基底膜
10毫升n1补充剂
20毫升B27补充剂
10毫升NEAA
60 ng/ml t3
100 ng/ml生物素
10 ng/ml NT3
1μg/ml盐酸米林
20 ng/ml bdnf
1μm营地
含维生素a的神经维持培养基（nmm）
482毫升DMEM/F12+谷氨酰胺
482毫升神经基底膜
10毫升含维生素A的B27补充剂
5μg/ml胰岛素
5毫升谷氨酰胺
5毫升氮气补充
5毫升NEAA
10毫升钢笔/链球菌
10μmβ-巯基乙醇
不含维生素a的神经维持培养基（nmm）
482毫升DMEM/F12+谷氨酰胺
482毫升神经基底膜
10毫升不含维生素A的B27补充剂
5μg/ml胰岛素
5毫升谷氨酰胺
5毫升氮气补充
5毫升NEAA
10毫升钢笔/链球菌
10μmβ-巯基乙醇
氮气介质
48毫升DMEM/F12，不含L-谷氨酰胺
500μl 100x氮气
500μl非必需氨基酸（10 mM储备）
500μl谷氨酰胺（200 mm库存）
2μg/ml肝素
500μl钢笔/链球菌
nb中等
475毫升神经基底膜
10毫升B27
18毫米HEPES
1.25毫升谷氨酰胺
5毫升钢笔/链球菌
阻塞缓冲区
95毫升PBS
5毫升天然气
300毫米Triton X-100
0.1克牛血清白蛋白
pbs
8g氯化钠
0.1克kcl
1.44克钠2hpo4
0.24克kh2po4
800毫升H2O
plo/mlaminin涂层
1. 加入20 mg/ml PLO和PBS（12孔板0.5 ml；6孔板1 ml）
2. 37℃孵育4小时或O/N
3. 删除plo
4. 用PBS清洗3次
5. 加入20 mg/ml盐酸米拉明（与PLO的用量相同）
6. 在37℃下培养至少2小时或O/N
7. 去氨胺
8. 添加培养基和单元格
盖尔特涂层
1. 用冷DMEM/F12稀释Geltrex 1:1
2. 大等份-80'C
3. 用冷DMEM/F12稀释1:50
4. 加入适量（12孔板0.5ml，6孔板1ml）
5. 在37℃下孵育至至少1小时
6. 去除凝胶剂后，立即加入含有细胞的培养基

致谢

这项研究得到了阿姆斯特丹神经科学和欧盟msca-itn认知网（fp7-people-2013-itn 607508）的资助。V.M.H.由Zonmw Vidi研究基金（91712343）、E-Rare联合呼叫项目（9003037601）和欧洲白质营养协会（ELA）研究基金（2014-012L1）资助。神经元分化方案基于Nadadhur等（2017）的先前研究。opc鉴别协议是基于以色列等（2007）的先前研究。