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图1。用[125i]阿米洛利标记牛心脏smps的示意图

材料和试剂

1.5毫升螺旋盖微管（Watson，目录号：139-115-112C）
1.5毫升微管（安全锁管，Eppendorf，目录号：0030120086）
吸管头（Gilson）
膜过滤装置（Amicon Ultra，100 kDa，Merck Millipore，目录号：UFC510096）
反相高效液相色谱柱（Cosmosil 5C18-MSII，4.6 mm x 200 mm，Nacalai Tesque）
薄层色谱板（默克密理博，目录号：1.05554.0001）
保鲜膜
阿米洛利锡前体（A21a，1.0 mm乙醇，图1a，合成过程在UNO等中描述，2019年）
[125i]nai（无载体，2000 ci/mmol，Perkin Elmer，目录号：NEZ033A）
氯胺T（Wako Pure Chemicals，目录号：032-02182）
亚硫酸氢钠（NaHSO3，Wako Pure Chemicals，目录号：198-01371）
牛亚软骨颗粒（SMPS）
注：
1. smps是线粒体内膜的内外囊泡。
2. 线粒体是从牛心脏分离出来的，如别处所述（Smith，1967）。
3. SMPS是在先前描述的方案（Matsuno Yagi和Hatefi，1985）的基础上，使用含有0.25 M蔗糖、1.0 m m琥珀酸钾、1.5 mm atp、10 mm mgcl2、10 mm mncl2和10 mm tris/hcl（pH7.4）的超声培养基制备的，然后进行超离心。在使用前，将其储存在含有250 mm蔗糖和10 mm三氯化三钠（pH7.4）的缓冲液中，温度为-80°C。
TISP> TM双TIS蛋白凝胶（4-16%预制凝胶，THE Fisher Fisher，目录号：BN1004BOX）
NativepageTM运行缓冲和阴极缓冲添加剂（Thermo Fisher，目录号：分别为BN2001和BN2002）
Serva Blue G（CBB G-250，Serva，目录号：35050.01）
n-十二烷基-d-β-麦芽糖苷（DDM，多津，目录号：D316）
甘油（Wako Pure Chemicals，目录号：075-00616）
乙醇（Wako Pure Chemicals，目录号：057-00456）
甲醇（Wako纯化学品，目录号：137-01823）
乙酸（Wako纯化学品，目录号：017-00251）
蔗糖（Wako Pure Chemicals，目录号：192-00017）
mgcl2（六水，wako纯化学品，目录号：135-00165）
NaCl（Wako纯化学品，目录号：195-01665）
Ponceau S（Nacalai Tesque，目录号：28322-72）
Tricine（Dojin，产品目录号：GB05）
SDS（Wako Pure Chemicals，目录号：191-07145）
硫醇（Wako Pure Chemicals，目录号：137-06862）
Tris（Wako Pure Chemicals，目录号：011-20095）
丙烯酰胺（Wako纯化学品，目录号：011-08015）
双丙烯酰胺（Wako纯化学品，目录号：134-15081）
尿素（Wako纯化学品，目录号：219-00175）
银染试剂盒（Wako Pure Chemicals，目录号：291-50301，与MS兼容）
三氟乙酸（TFA）
NADH（东方酵母，产品目录号：4432万）
标签缓冲区（见配方）
4x BN页样本缓冲区（见配方）
洗脱缓冲液（见配方）
4x sch_gger样品缓冲液（见配方）
10倍阴极缓冲液（见配方）
10x阳极缓冲器（见配方）
AB-3混合物（见配方）
3X凝胶缓冲液（见食谱）
1.0 m kpi缓冲液，ph值7.4（见配方）
DSDS PAGE凝胶配方（见食谱）

设备

皮皮特曼（吉尔森）
-80°C冷冻柜（PHC，型号：MDF-DU300H）
高效液相色谱系统（Shimazdu，型号：LC-10AS）
微型离心机（Chibitan，Merck Millipore，型号：XX42CF0RT）
γ计数器（眼镜蛇TMII，帕卡德）
真空离心蒸发器（孔眼，型号：CVE-2200）
生物成像分析仪（分别为FLA-5100或台风FLA-9000、富士胶片或GE Healthcare）
成像板（BAS IP MS 2040E，GE Healthcare）
涡流混合器（一体式，型号：Trio TM-1N）
热块（一体式，型号：MYBL-10）
长波紫外线灯（UVP，黑色，型号B-100AP，配有100W灯泡，365纳米）
电洗脱器（Bio-Rad，型号：422）
凝胶干燥器（BIO RAD，型号5853，配备水工真空泵）
凝胶电泳仪和玻璃板（ATTO，AE-6500，8×9厘米，用于小型凝胶格式）

软件

图像分析软件，如Multi-Gauge或ImageQuant（分别为富士胶片或GE Healthcare）

程序

光活性[125i]阿米洛利的制备（以[125i]pra5为例）
1. 将锡前体A21A（1.0 mm，20μl）的乙醇溶液制备在1.5 ml螺旋盖微管中。
2. 添加[125i]nai（1 mci，2000 ci/mmol，10μl）。
  注：[125i]nai应在通风室中处理，直到反应被nahso3
3. 通过添加水性氯胺T（3.0 m m，在1.0 m kpi缓冲液中，pH值7.4，10微升）开始反应。
  注：氯胺T水溶液应为每次实验新鲜制备。
4. 旋涡并使管子向下旋转。
5. 将混合物在室温下孵育10分钟。
6. 加入5%（w/v）亚硫酸氢钠水溶液（10微升）使反应停止。
7. 用手动进样口将混合物的整个体积（~50微升）注入高效液相色谱（循环体积应大于100微升）。信用证条件如下：
8. 每30秒（约400微升）收集一次分数。
9. 取3微升样品，分别用γ计数器（2微升）和放射薄层色谱（1微升）评估各组分的放射性和纯度（见图2）。
10. 将含有[125i]pra5（frs）的分数合并。图2中的8和9），并通过真空离心蒸发器将样品浓缩至约50微升。
  注意：不要完全干燥样品。
11. 用乙醇将[125i]pra5的浓度调整为1 mci/ml。
12. 将样品储存在4°C（[125i]阿米洛利作为乙醇溶液稳定至少2个月）。
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  图2。反相高效液相色谱法纯化光活性[125i]pra5。将含有粗[sup>125i]pra5的混合物应用于c18柱。用10%甲醇/0.01%水性tfa（0-10分钟）冲洗柱去除盐，然后用90%甲醇/0.01%水性tfa（10-20分钟）等比例洗脱[125i]pra5。洗脱液每隔30s分馏一次，并将每个分馏液中的2微升小份转移到ria管中，使用γ计数器测量放射性（保留时间：10-17.5min）。a.高效液相色谱图中的放射性分布。放射化学产率从最初的[125i]nai约为70%。b.所收集组分的薄层色谱分析。以10%甲醇/氯仿为流动相，在薄层色谱板上分析样品（1微升）。在成像板上曝光1h，并用生物成像分析fla-5100进行分析。
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牛脱脂乳粉的交联[sup>125i]pra5
1. 在1.5毫升微管中，将牛SMPS悬浮液加入标记缓冲液（2.0-4.0毫克/毫升，100-200微升）。
2. 添加浓度为5-10nm的[125i]pra5。
  注：乙醇浓度应低于~3%。
3. 室温下孵育10分钟。
4. 加入50μm NADH，然后孵育5分钟。
5. 用长波紫外线灯在冰上照射10分钟，距离光源10厘米（图3）。
6. 在最终浓度为1.0%的条件下，加入10%（w/v）ddm使交联反应猝灭。
7. 将混合物在冰上孵育1h。
8. 添加4x bn页样本缓冲区。
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  图3。牛脱脂乳粉的光亲和标记装置。含脱脂乳粉的1.5毫升Eppendorf试管在冰上开盖放置。它们在离光源约10厘米的距离处紫外线照射10分钟。为了有效标记，样品的体积应为100-200微升/管。< BR> < BR>
用pra5标记的蛋白质的鉴定
1. 蓝色本征（bn）page和电洗脱分离配合物i（sch_gger，2006）
  1. 添加5%Serva Blue G（CBB G-250）。CBB/DDM比率应按重量调整为1/4。
  2. 将样品加载到4-16%BN预制凝胶（100-200μg蛋白/阱）中。
  3. 开始电泳（100伏，15毫安，持续1小时）。
  4. 增加电压为200 V（15毫安），并继续电泳直到前面染料到达凝胶底部。
  5. 用剃刀刀片切除复杂的I型环。
    注意：不要固定BN凝胶。不包括任何未染色（或染色不良）凝胶。只切除复杂I波段的心脏。
  6. 根据制造商的协议组装电洗脱器。
  7. 用洗脱缓冲液填充玻璃管和洗脱液，将凝胶片放入管内（4-5凝胶片/管）。
  8. 在10毫安/玻璃管中洗脱蛋白质，在冷藏室中过夜。
    注：如果洗脱成功，凝胶片变为无色。
  9. 按照制造商的方案收集洗脱蛋白（我们建议用50-100微升0.5%十二烷基硫酸钠洗涤透析膜以溶解沉淀蛋白）。
  10. 用Amicon Ultra 0.5（100 kDa截止值）将收集的溶液浓缩至适当体积（50-100微升）。
  11. 将样品保存在-80°C直至使用。
2. 用双SDS-PAGE分离复合I亚单位（DSDS-PAGE，RAIS等，2004；Wittig，2006）
  1. 将4x sch_gger样品缓冲液加入电洗脱分离的络合物i中。
  2. 将混合物在40℃下孵育1h。
    注意：不要煮沸样品，因为复合物I聚集了一些疏水亚基。
  3. 在电压为30 V（40 mA）的第一尺寸SCH-Guer-SDS凝胶（10% T，3% C，含有6 M尿素，4%层凝胶，表1）中分离复合的I蛋白。
  4. 当样品完全进入凝胶时，将电压增加至100 V，并继续电泳直到染料前端到达凝胶底部。
  5. 切除第一维凝胶条并在含有100毫米TrIS/HCl（pH 2）的酸性缓冲液中孵育30分钟，然后将条固定在两个玻璃板之间（参见图4A、4B和4C）。
  6. 倒入第二维度丙烯酰胺混合物（16%t，3%c，表1）并用水覆盖（见图4d）。
  7. 聚合后，向下推下第一层凝胶条，使两种凝胶粘在一起（见图4E）。
  8. 用丙烯酰胺混合物（16% T，3% C，表1）填充间隙，其中含有150毫米TrIS/HCl（pH 7.4）和痕量SeraBlue G（间隔胶，参见图4F）。
  9. 以30伏（40毫安）的电压开始第二次双向电泳。
  10. 当样品完全进入第二凝胶时，电压可以增加到150 V。
3. 银染色和放射自显影
  1. 用合适的方法固定和染色银凝胶（严＜EM＞等＜E/EM＞2000）或市售银染试剂盒。
  2. 用传统平板扫描仪扫描银染凝胶。
  3. 将凝胶放置在凝胶干燥器之前，将凝胶在含有3%甘油、40%甲醇和10%乙酸的溶液中平衡30分钟。
  4. 用凝胶干燥器在65℃下干燥凝胶3小时。温度应缓慢升高[约1°C/min（“梯度模式”）]。
  5. 凝胶完全干燥后，用保鲜膜覆盖凝胶，然后将其暴露在成像板上12-24小时。
  6. 利用生物成像分析仪分析放射性标记蛋白的迁移模式，并与银染蛋白的迁移模式进行比较（典型结果如图5所示）。
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    图4。DSDS PAGE的第二维凝胶的制备。< /强> A切除第一维凝胶条。小心地将凝胶条放入含有酸性缓冲液的15毫升猎鹰管中。在室温下将凝胶孵育30分钟。c.将玻璃条固定在两块玻璃板之间。将二级丙烯酰胺混合物倒入，在丙烯酰胺凝胶混合物聚合后，用MIL-LH＜2＜/Sub＞O. E.覆盖，将凝胶条推下，使两种凝胶粘在一起。f.移除MIL-LQ，然后用间隔胶填充间隙。< BR> < BR>
    图5。应用[sup>125i]pra5.a.复合物i的bn-page分离。在[416%BN凝胶]上分离[SUP＞125＜/SUP> I] PRA5标记的SMPS。如别处所述（Muraiet al，2009；Shiraishiet al，2012），通过NADH/NBT系统的活性染色鉴定复合I带，并进行电洗脱。大约100微克SMPS蛋白质被装载到每个孔中。b.通过DSD页解析复杂I。用BN-PAGE和电洗脱纯化的[SUP> 125 I] PRA5标记的复合物I，在10%维SCH型GuGER型三萜凝胶（10% T，3% C含有6 M脲）上分离，随后在16% SaωGGER型凝胶（16% T，3% C）上进行第二次分离。2D凝胶经银染（左侧）和放射自显影（右）。[125i]pra5的标记提供了两个与49kda和psst亚单位相对应的放射性点，这两个亚单位都包含复合物i的醌/抑制剂结合囊（hirst 2013和sazanov 2015）。这些斑点通过质谱和western blotting鉴定（Shiraishi等，2012）。我们注意到，ADP/ATP载体（AAC）的蛋白斑点中有微弱的放射性，这是用络合物I纯化的。I的凝胶图像与参考图7C中所用的凝胶图像相同（UNO＜EM＞等＜/EM＞2019）。

食谱

标记缓冲液（用于牛脱脂奶粉的紫外线照射）
250毫米蔗糖
50毫米关键绩效指标（pH值7.4）
1毫米mgcl2
4x bn页样本缓冲区
200 mm双Tris/HCl（pH 7.2）
200毫米氯化钠
40%（w/v）甘油
0.004%（w/v）胭脂红
洗脱缓冲液（用于络合物i的电洗脱）
25毫米三角线
7.5 mm双Tris/HCl（在4°C下调整pH值7.0）
4x sch_gger样品缓冲液（用于tricine页）
150毫米Tris/HCl（pH 7.0）
12%（w/v）十二烷基硫酸钠
30%（w/v）甘油
6%（w/v）巯基乙醇
0.05%（w/v）Serva蓝色G
10x阴极缓冲液（用于Sch_gger型SDS-PAGE）
1.0米Tris
1.0米Tricine
1% SDS
10x阳极缓冲液（用于Sch_gger型SDS-PAGE）
1.0 m Tris/HCl（pH 8.9）
AB-3混合物（49.5%T，3%C，用于Sch_gger型SDS-PAGE）
48%丙烯酰胺
1.5%双丙烯酰胺
3X凝胶缓冲液（用于SCH-Guer-SDS-PAGE）
3.0 m Tris/HCl（pH 8.45）
0.3%十二烷基硫酸钠
1.0 m kpi缓冲液，ph值7.4
将k2hpo4（12.1 g，69.5 mmol）和kh2po4（4.1 g，30.4 mmol）溶于100 ml蒸馏水中。
DSDS PAGE凝胶组合物（SHC-Guger-SDS-PAGE）（表1）
< BR> 表1。sch_gger型sds凝胶的制备（用于两种阿托微凝胶）

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致谢

确认本协议改编自Uno等。（2019年）。这项研究得到了JSPS Kakenhi的支持（批准号JP26292060和JP18H02147给H.M.，批准号JP18K05458给M.M.）。涉及放射性同位素技术的实验在京都大学放射性同位素研究中心进行。

相互竞争的利益

作者声明他们与本文内容没有利益冲突。

工具书类

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