材料和试剂

常用列表

通用列表1.粘合PCR板箔
粘合式PCR板密封件
过滤吸管头
刻度无菌移液管
副膜
试剂盒，100毫升无菌聚苯乙烯
1.5和2毫升微管
15ml锥形管
50ml锥形管
96孔PCR板
96孔PCR板，踢脚
Bacto胰蛋白胨（Thermo Fisher Scientific，目录号：16299741）
cacl2（sigma-aldrich，目录号：c1016）
DNase Away表面去污剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：7010PK）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐（DPBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8662）
乙醇99.5%分析级（赛默飞世尔科学公司，目录号：12634800）
GelReD核酸凝胶染色（生物素，目录号：41003）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：50046）
优质脱氧核苷酸三磷酸盐（DNTPS）（Promega，目录号：U1335）
异丙醇PA（VWR83442）
milli-q水
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
NACO3（默克密理博，产品目录号：1063920500）
NAHCO3（默克密理博，目录号：1063290500）
无核酸酶水（桥根，目录号：129114）
核自旋96-PCR清除试剂盒（Macherey Nagel，目录号：7406584）
RNase Away表面去污剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：7000TS1）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：93442）
Trizma Base（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
盐酸特里兹马（Sigma-Aldrich，目录号：T3253）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
超纯琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：16500500）
酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，目录号：15815488）
100 bp DNA梯（Thermo Fisher Scientific，目录号：15628019）
100ml无菌聚苯乙烯盆
10x TBE（粉末）（赛默飞世尔科学公司，目录号：AM9864）
98%硫酸（VWR，Catalog number：1.00748.2500）

细胞受体单元克隆单细胞种类细胞收藏
1. 40微米细胞strainer（Corning，Catalog number：431750）
2. 热鱼科学，目录编号：Y00147
3. GIBCO PBS（10X），PH 7.2（Fisher Scientific，Catalog Number：11514526）
4. 核糖核酸酶抑制剂（Promega，Catalog number：n2511）
5. 病人B细胞
6. 70%乙醇（无核水）
单细胞反向转录
1. Nonidet NP40 or tergitol solution（Sigma-Aldrich，Catalog number：NP40 s）
2. Random Hexamer Primer（RHP）Mix（Sigma-Aldrich，Catalog number：11034731001）
3. 核糖核酸酶抑制剂（Promega，Catalog number：n2511）
4. 反转录酶试剂盒（热鱼科学，编目编号：18080085）
5. 70%乙醇（无核水）
免疫球蛋白可变区域基因放大
1. Hotstarttaq plus DNA聚合酶试剂盒（Qiagen，Catalog number：203609）&NBSP；
2. Sequencing and PCR primers（see a HREF=“https://os.bio-protocol.org/attached/file/20190827/supplementary file appendix.docx“target=”“ublank”>appendix
3. 70%乙醇（无核水）
基因特异性PCR
1. Gene-specific primers（见appendix）
2. Hotstarttaq plus dna聚合酶试剂盒（qiagen，catalog number：203609）
3. 70%乙醇（无核水）
产品的限制性酶消化
1. AGEI-HF（NEB，Catalog number:R3552L）&NBSP；
2. BSIWI-HF（NEB，Catalog number:R3553S）&NBSP；
3. SALI-HF（NEB，Catalog number:R3138S）&NBSP；
4. XHOI-HF（NEB，Catalog number:R0146s）&NBSP；
5. 70%乙醇（毫升水）
Ligation of PCR products to cloning expression vectors
1. Human IGH Linearized Plasmid vector with cloning sites for agei and sali（gift from Hedda Wardemann and Eric Meffre）&NBSP；
2. 人乙型肝炎线性质粒载体的克隆位点和乙型肝炎（来自Hedda Wardemann和Eric Meffre的礼物）
3. 人IG线性质粒载体与Agei和XHOI克隆位点（Gift from Hedda Wardemann and Eric Meffre）
4. Qiaquick凝胶萃取试剂盒（qiagen，catalog number：28704）
5. 快速连接酶试剂盒（NEB，catalog number：m2200l）
6. 70%乙醇（毫升水）
dh5α细胞的转化
1. 塑料培养皿（100 mm x 15 mm）（Fisher Scientific，目录号：S33580A）
2. 氨苄西林（Sigma-Aldrich，目录号：A5354）
3. 细菌学琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A5306）
4. 一次性细菌细胞撒布器和接种环
5. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
6. 亚克隆效率DH5α活性细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：18265017）
7. 70%乙醇（以毫微克水计）
  < BR>
插入检查PCR
1. 瓊脂平板
2. Gotaq G2 DNA聚合酶（Promega，目录号：M7848）
3. 插入check-pcr引物（可在附录中找到）
4. 测序引物（可在附录中找到）
5. 70%乙醇（以毫微克水计）
  < BR>
质粒微制备
1. 氨苄西林（Sigma-Aldrich，目录号：A5354）
2. LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3552）
3. Qiaprep Spin Miniprep Kit（Qiagen，目录号：27106）
4. 70%乙醇（以毫微克水计）
  < BR>
单克隆抗体的探索性筛选小规模生产单克隆抗体（30ml培养基）
1. 康宁-厄伦迈耶培养瓶（125毫升）（西格玛-奥尔德里奇，目录号：CLS431143）
2. 0.22μm真空过滤装置（康宁，目录号：431096）
3. 0.22μm注射器过滤器
4. expi293电池（Thermo Fisher Scientific，产品目录号：A14528）
5. expi293表达介质（Thermo Fisher Scientific，目录号：A1435101）
6. OpTyPro无血清培养基（SFM）（Telo Fisher科学，目录号：12309019）
7. PEI-MAX 40K转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（多科学，目录号：24765-1）
8. 红色素B（西格玛-奥尔德里奇，目录号：198269）
9. 70%乙醇（以毫微克水计）
  < BR>
单克隆抗体的纯化
1. Bio-Spin一次性色谱柱（Bio-Rad，目录号：732-6008）
2. Amicon Ultra 4 ml 50 kDa MWCO离心装置（微孔，目录号：UFC805008）
3. Zeba旋转脱盐塔7k MWCO 5 ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：89892）
4. 0.22μm低蛋白结合注射器过滤器（Millipore Millex GV，目录号：SLGV013SL）
5. 蛋白G琼脂糖4快速流动抗体纯化树脂（GE Lifesciences，目录号：17061805）
6. 70%乙醇（以毫克水计）
7. 0.1 M甘氨酸（pH 3.0）（见配方）
8. 1米Tris（pH 8.0）（见配方）
  < BR>
纯化单抗的igg浓度评估
1. 康宁96-半井区透明平底聚苯乙烯高粘结微孔板（康宁，目录号：3690）
2. 3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物（Sigma-Aldrich，目录号：t0440）
3. 70%乙醇（以毫克水计）
4. 牛血清白蛋白（SMA）奥德里奇（目录号：A7906）
5. 山羊f（ab）2抗人igg f ab（jackson免疫研究，目录号：109-006-097）
6. hrp结合山羊f（ab）2抗人igg-fc-γ特异性（jackson免疫研究，目录号：109-036-008）
7. 人类igg全分子（jackson免疫研究，目录号：009-000-003）
8. 0.5 m h2so4（见配方）
  < BR>
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳<强> >
1. 螺栓4-12%双Tris Plus蛋白质凝胶（Thermo Fisher Scientific，目录号：NW04122box）
2. 螺栓十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液（4x）（Thermo Fisher Scientific，产品目录号：b007）
3. 螺栓甲酯磺酸盐（mes）-十二烷基硫酸钠（sds）运行缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：b000202）
4. 螺栓样品还原剂（10x）（Thermo Fisher Scientific，产品目录号：b009）
5. 见Blue Plus2预染色蛋白质标准（Thermo Fisher Scientific，目录号：LC5925）
6. 赛默飞世尔科学目录号LC6065
  < BR>
多反应性和控制elisa
多反应性elisa
1. 牛血清白蛋白（SMA）奥德里奇（目录号：A7906）
2. 脱氧核糖核酸钠盐，来自鲑鱼试验（Sigma-Aldrich目录号：D1626）
3. hrp结合f（ab）2抗人igg-fc-γ特异性（jackson免疫研究，目录号：109-036-008）
4. 人胰岛素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：19278-5ml）
5. 来自大肠杆菌的脂多糖（sigma-aldrich，目录号：l6525-1mg）
6. NUNC-免疫TM微孔TM96-微孔板，高结合（NUNC，目录号：442404）
7. TMB基板（Sigma-Aldrich，目录号：t0440）
8. 0.5 m h2so4参见配方）
< BR>
抗Bovine serum albumin（BSA）/塑料和兔IgG ELISA
1. 牛血清白蛋白（SMA）奥德里奇（目录号：A7906）
2. 染色纯兔IgG（Jackson免疫研究，目录号011-000-003）
3. hrp结合兔f（ab）2抗人igg-fc-γ特异性（jackson免疫研究，目录号：309-036-008）
4. 丙二醛（mda）改性牛血清白蛋白（医学院，目录号：20p-md-bs102）
5. 分子生物学级BSA（NEB，目录号B9000S）
6. 0.5 m h2so4（见配方）
  < BR>
瓜氨酸特异性单克隆抗体筛选抗α烯醇化酶1和组蛋白4 elisa
1. 康宁？96井半区透明平底聚苯乙烯高粘结微板（康宁，目录号：3690）
2. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma Aldrich，目录号：A7906）
3. 碳酸盐缓冲液（见配方）
4. hrp结合山羊f（ab'）2抗人igg-fc-γ特异性（jackson免疫研究，目录号：109-036-008）
5. 肽（表7）
6. 参考文献（ACPA+RA血清样品池）
7. RIA缓冲液（见配方）
8. TMB基板（Sigma-Aldrich，目录号：t0440）
9. 0.5 m h2so4（见配方）
  < BR>
抗cit纤维蛋白原、cit波形蛋白和cit纤维蛋白多肽elisa
1. Pierce Streptavidin涂层高容量板（Thermo Fisher Scientific，目录号：15500）
2. 生物素化肽（表7）
3. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma Aldrich，目录号：A2153）
4. hrp结合f（ab）2抗人igg-fc-γ特异性（jackson免疫研究，目录号：109-036-008）
5. 参考文献（ACPA+RA血清样品池）
6. TMB基板（Sigma-Aldrich，目录号：t0440）
7. RIA缓冲液（见配方）
8. 缓冲液（见配方）
9. 0.5 m h2so4（见配方）
  < BR>
抗环瓜氨酸肽第二代（ccp2）elisa
1. 免疫扫描ccplus临床试验（欧洲诊断，目录号：ra-96plus）
< BR>
用于深入功能分析的单克隆抗体的大规模表达
质粒maxipreps
1. lb琼脂平板
2. 225ml带刻度的锥形离心管（VWR，目录号：89218-286）
3. 氨苄西林（Sigma-Aldrich，目录号：A5354）
4. purelinktmhipure质粒dna maxiprep试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：k21017）
5. 70%乙醇（以毫克水计）
6. lb培养基（见配方）
  < BR>
大规模生产单克隆抗体（400-3200毫升细胞悬液）
1. 康宁-厄伦迈耶培养瓶（1 L）（Sigma-Aldrich，目录号：CLS431147）
2. 225ml带刻度的锥形离心管（VWR，目录号：89218-286）
3. 0.22μm注射器过滤器
4. expi293电池（Thermo Fisher Scientific，产品目录号：A14528）
5. expi293表达介质（Thermo Fisher Scientific，目录号：A1435101）
6. OpTyPro无血清培养基（SFM）（Telo Fisher科学，目录号：12309019）
7. PEI-MAX 40K转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（多科学，目录号：24765-1）
8. 红色素B（西格玛-奥尔德里奇，目录号：198269）
9. 70%乙醇（以毫微克水计）
  < BR>
从单克隆抗体上清液中评估igg浓度参考材料和试剂B中的“纯化单克隆抗体的IgG浓度评估”
< BR> 从大规模表达中纯化单克隆抗体
1. Slide-A-Lyzer G2透析盒，10K MWCO 30-70毫升（Thermo Fisher Scientific，目录号：88254）
2. Zeba旋转脱盐塔7k MWCO 5 ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：89892）
3. PD-10列，空（GE Healthcare，目录号：17-0435-01）
4. Labmate PD-10缓冲罐（GE Healthcare，目录号：18-3216-03）
5. 0.22μm低蛋白结合注射器过滤器（Millipore Millex GV，目录号：SLGV013SL）
6. 蛋白G琼脂糖4快速流动抗体纯化树脂（GE Lifesciences，目录号：17061805）
7. 0.1 M甘氨酸（pH 3.0）（见配方）
8. 1米Tris（pH 8.0）（见配方）
  < BR>
纯化单抗的igg浓度评估
参考材料和试剂B中的“纯化单克隆抗体的IgG浓度评估”
< BR> SDS-PAGE
参阅材料中的“SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳”和Reagents B
< BR> igg聚集试验
1. 0.22μm瓶顶真空过滤器（康宁，目录号：431096）
2. 20%乙醇（以毫克水计）
3. 70%乙醇（以毫微克水计）
  < BR>
内毒素检查本方案本部分无特殊材料和试剂。
< BR> 瓜氨酸特异性Elisas与滴定曲线参考材料和试剂中的“瓜氨酸特异性单克隆抗体筛选”b
< BR> ccp2酶联免疫吸附试验参考材料和试剂B中的“抗环瓜氨酸肽第二代（CCP2）酶联免疫吸附试验”

设备

常用列表

适用于1.5和2毫升微管的离心机（Sigma Laborzentrifugen GmbH，目录号：10020）
适用于225毫升试管、50毫升试管和96孔PCR板的离心机（Sigma Laborzentrifugen GmbH，目录号：10475）
酶联免疫吸附法读板器（分子装置，目录号：加384）
酶联免疫吸附板清洗机（帝肯，目录号：16029011）
适用于1.5和2毫升微管的加热块
微波炉（漩涡）
移液管控制器（Thermo Fisher Scientific，目录号：10759754）
精密秤（Sartorius，目录号：AY511）
蛋白质凝胶电泳池（BIO RAD实验室，目录号：1656001）
真空歧管（Promega，目录号：A2291）
真空歧管（Qiagen，目录号：19413）
真空泵（Promega，目录号：A6722）
涡流（Thermo Fisher Scientific，目录号：15547335）
< BR>

b细胞受体单细胞克隆
1. 琼脂糖电泳凝胶槽（热费雪科学，目录号：）；
2. 电泳电源（vwr，目录号：700-0448）
3. 凝胶DOC电泳仪（BIO RAD实验室，目录号：1708195）
4. 适用于96孔PCR板的热板（BioER技术，目录号：CHB-202）
5. 多管涡流（VWR，目录号：58816-116）
6. 适用于96孔PCR板的PCR冷却器（Thermo Fisher Scientific，目录号：10192281）
7. 适用于96孔PCR板的PCR热循环器（应用生物系统，目录号：435965）
8. 排序服务（例如，，内部或外部提供者）
9. 37°C培养箱（Heraeus，目录号：26066010）
10. 37°C振荡培养箱（Infors HT，目录号：S-000123637）
  < BR>
单克隆抗体的探索性筛选
1. 图书计数室（Thermo Fisher Scientific，目录号：10628431）
2. CO2摇床（HT信息，目录号：S-000117022）
3. 光学显微镜（蔡司，目录号：451487）
4. 轨道管旋转器（ABDOS生命科学，目录号：E11280）
  < BR>
用于深入功能分析的单克隆抗体的大规模表达
1. Real Explorer 10仪器（或同等产品；GE Healthcare Life Sciences）
2. 浓缩SEC 650柱10 x 300 mm，24 ml（Bio-Rad，目录号：7801650）
3. 管辊式混合器（Sigma-Aldrich，产品目录号：Z675148）

软件

国际免疫遗传学信息系统（imgt/v-quest），一个用于可变区域和结构域的免疫球蛋白（ig）和t细胞受体（tr）核苷酸序列的自由序列比对软件。此集成对齐工具将germline和重新排列的输入序列与imgt参考序列（imgt/v-quest参考目录）进行比较。
Unicorn软件版本5.2（GE Healthcare Life Science）。

程序

为重组抗体管道工作（图1）。
< BR>
图1。人单克隆抗体生产流水线。eln：电子实验室笔记本。

b细胞受体单细胞克隆
1. 收集单细胞分类细胞（约5小时）
  1. 根据你验证的流式细胞术方法处理细胞和组织并分类B细胞。
  2. 将黑色单个B细胞放入96孔PCR板中，该板含有10 m的分类缓冲液（表1）。
  3. 立即用粘合的PCR板箔覆盖每个板，向下旋转板并将其放在干冰上，直到细胞分选完成。如果不立即用于下面描述的步骤，请将这些板存放在-80-C冷冻柜中，直到进一步使用。
    < BR> 表1。细胞分选试剂准备
    < BR>
2. 单细胞反转录（约3小时）
  1. 在冰上解冻单个分选B细胞的平板，并在移除粘附的PCR板箔之前向下旋转。
  2. 每口井小心地加入6毫升随机六聚体底漆（RHP）混合物（表2）。用粘合的PCR板密封件盖住板并向下旋转。
  3. 在68摄氏度的温度下，将板转移到热板上1分钟，然后放回冰上或PCR冷却器上。
  4. 小心地移除粘合的PCR板密封件，并向每个孔添加14毫升RT混合物（表2）。
  5. 用一个新的胶粘PCR板封条盖住模板，在42-OC下进行5分钟的逆转录，25-OC下进行10分钟的逆转录，50-OC下进行60分钟的逆转录，95-OC下进行5分钟的逆转录。
  6. 在进行pcrs之前，cdna可以立即使用或储存在-80-c下。
    < BR> 表2。反转录试剂制备
    < BR> 注意：
    1. 在开始本节中的所有步骤之前，务必用乙醇、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶去除去污溶液清洁PCR罩或实验室工作台和实验室移液管。
    2. 单细胞裂解和cdna合成在用于细胞分类的原始平板中进行，从而将交叉污染的风险降至最低。
    3. 当计算所需的每种试剂的体积时，加入试剂体积过量的10%（例如，对于96孔PCR板，计算105孔），以便所有的孔都被正确填充。
    4. 在使用单电池时，必须高度注意；即使在电池板上交谈也会造成污染。小心地拆下粘合的PCR板密封件以避免飞溅也是非常重要的。
    5. 在-80°C下保存cDNA，直到进一步使用。
      < BR>
3. 免疫球蛋白可变区基因扩增（约2天）
  1. 制备重链、lambda和kappa链PCR主混合物，用于表3中所述的3个分离管中的第一个PCR。靶基因片段都以引物的名称在附录中指明。
  2. 小心地将每个PCR主混合物1的38μL添加到相应的孔和板（重、卡帕或lambda）中，然后小心地将3μL的cDNA添加到每个孔中。用粘合的PCR板密封件盖住并向下旋转。
  3. 在95°C下进行第一次PCR 15分钟；在95°C下进行50个循环30秒，在58°C（Ig/Igκ）或60°C（Igλ）下进行30秒，在72°C下进行55秒；在72°C下进行10分钟。
  4. 准备第二次PCR的PCR主混合物，如表3所示。
  5. 小心地将37μl PCR主混合物2添加到板的每个孔中，然后小心地将3.5μl第一PCR产物添加到每个孔中。用粘合的PCR板密封件盖住。
  6. 在95°C下进行第二次PCR 15分钟；在95°C下进行50个循环30秒，在58°C（Ig/Igκ）或60°C（Igλ）下进行30秒，在72°C下进行45秒；在72°C下进行10分钟。
  7. 通过运行2%琼脂糖凝胶检查第二PCR产物的大小，并使用UV透射器可视化DNA带。第二次PCR的预期大小为：Ig k为510 bp，Igλ为405 bp，Ig为450 bp（图2）。
  8. 按照制造商的说明，使用PCR清洗试剂盒纯化第二批PCR产品。
  9. 使用附录
    中所述的相应引物对纯化的第二个PCR产物进行排序 < BR>
    图2。代表性的琼脂糖凝胶图为IgH（450 bp）、Ig -（405 bp）和Igκ（510 bp）可变区基因的扩增，从单个人B细胞扩增。<强> L L: 100 bp DNA梯状。
    < BR> 表3。第一次和第二次PCR的PCR混合
    < BR> 注意：
    1. 当计算所需的每种试剂的体积时，加入试剂体积过量的10%（例如，对于96孔PCR板，计算105孔），以便所有的孔都被正确填充。
    2. 为确保主混合料不受污染，请准备每个主混合料，使其具有足够的体积，以便有一个缓冲控制。
    3. 重链、lambda和kappa链的PCR始终在单独的板中执行。
    4. PCR产品可立即使用或储存在-20°C下，直到进一步使用。
      < BR>

单克隆抗体的探索性筛选

小规模生产单克隆抗体（孵化约8天）
1. 将1.27μg总质粒dna与每1 ml转染细胞悬液混合。一半为重链（0.635μg/ml细胞悬液），一半为轻链（0.635μg/ml细胞悬液）。我们推荐30毫升培养基，其中19μg轻链和19μg重链DNA用于初步筛选。
2. 在PEI- MAX中称量并溶解在OptiPRO无血清培养基（SFM）中，使工作溶液（100μg/ml）和无菌过滤通过0.22μm的过滤器，每毫升细胞悬液需要0.05毫升的工作液进行转染。
3. 将expi293细胞的浓度调整为2.5 x 106细胞/ml，将等分细胞悬液调整到标记细胞培养摇瓶中，并将摇瓶放入培养箱（8%co2、37°C和125转/分的眼眶摇瓶）。
4. 将optipro-sfm中的pei-max工作液加入到含有dna质粒（0.05ml/ml细胞悬液）的试管中。通过短暂的旋涡混合并在室温下孵育10分钟。
5. 将optipro-sfm培养基中的混合dna质粒/pei-max逐滴加入细胞悬液中。
6. 尽快把烧瓶放回培养箱。
7. 在37°C，125转/分下培养6天。
8. 培养后，将细胞悬液倒入50毫升试管中。
9. 室温下，在840x g下离心30分钟。
10. 慢慢倒入新的50毫升试管中，倒出上清液。细胞颗粒不应被破坏。
11. 将上清液在10000x g室温下离心20分钟。
12. 通过0.22μm注射器过滤器过滤igg。
注意：
1. 转染前一天，将expi293细胞在expi293表达培养基中稀释至1.8x 106细胞/ml.
2. 对表达来说，最关键的是expi293细胞处于良好的生长期，并且具有较高的活力。
3. 在转染前，务必对所有试剂和质粒制剂进行无菌过滤。
4. 始终使用新制备的PEI-MAX工作溶液。
5. 在6天的培养过程中，无需传代细胞或更换培养基。
6. 在无菌条件下过滤上清液。
7. 上清液中的lgg在4℃下稳定几周，但建议尽快纯化。
单克隆抗体纯化（约2天）
1. 旋涡蛋白g琼脂糖4快速流动珠和大力摇瓶。向含有DPB的50ml试管中加入足够的100μl/样品的珠子。
2. 在840x g室温下离心10分钟，洗涤珠子。用吸管取上清液，然后用同样的程序再次离心。在dpbs中重新消耗蛋白质g，使每个样品的总体积达到400μl。
3. 在含有上清液的每个试管中加入400μl蛋白质g。
4. 将含有上清液和蛋白质g的试管在4℃下以25转/分的速度培养至少14小时。
5. 孵育后，在840x g室温下离心20分钟。同时，制备含有100μl 1 m Tris（pH 8.0）的2 ml微管。
6. 丢弃上清液而不破坏颗粒。在底部留下约1毫升的上清液和珠子。
7. 在剩余的上清液中重新悬浮小球，并转移到空的生物自旋色谱柱。
8. 用2毫升dpbs清洗蛋白g柱三次。
9. 将生物旋转色谱柱的底部用吸墨纸吸干，以去除多余的液滴。
10. 将1毫升过滤后的0.1 M甘氨酸（pH 3.0）加入到生物自旋色谱柱中的蛋白G树脂中，将IgG洗脱到2毫升Eppendorf管中。立即与中和缓冲液（1 m Tris，pH 8.0）混合。
11. 使用Zeba Spin 5 ml离心脱盐柱将缓冲液改为PBS。
12. 拆下Zeba旋转柱的底部封盖，将柱放入一个15毫升的收集管中，并在1000x g下离心，丢弃流经的液体并将柱更换到收集管中。
13. 向柱中加入2.5毫升无菌dpbs。在1000x g下离心，并丢弃流经的液体。再重复此步骤两次。
14. 吸干塔底以除去多余的液体。将设备转移到新的收集管。将洗脱的igg部分涂在zepa旋转柱的树脂顶部。
15. 离心并保留含有缓冲交换igg的流动通道。丢弃旋转柱。
16. 缓冲液交换后，用280nm的纳米滴吸光度测量蛋白质浓度，如果浓度小于100μg/ml，按照制造商的说明，使用Amicon超离心装置（4 ml MWCO 50 kDa）将IgG浓缩至100-200μl。
17. 在缓冲液交换和可能的igg浓度后，在无菌条件下通过0.22μm低蛋白结合过滤器过滤igg制剂。
18. 抗体如下：一种可用于Eelas和SDS-PAGE凝胶，并在4℃保持无菌；一种应冷冻保存在80℃下的长期保存。
注意：
1. 不要在任何涉及蛋白g珠的离心过程中使用制动器，即使在旋转结束时轻微的断裂也会导致珠子起毛，使上清液难以清除。
2. 在开始之前，确认洗脱甘氨酸缓冲液与1 M Tris混合将产生pH值7。如果没有，则调整用于中和的Tris的体积。
3. 抗体处于低ph值的时间应该最小化，以便快速工作。当您开始抗体纯化时，确保洗脱后，立即通过罩下的0.22μm过滤器将缓冲液交换至PBS和无菌过滤器，然后保存。
纯化单克隆抗体的igg浓度评估（约1天）
1. 用f（ab’2抗人igg fab（dpbs中为2μg/ml）在1/2区域板上涂抹，50μl/孔，在4℃下过夜。
2. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
3. 用100μl/孔1%bsa在dpbs中封闭，室温下孵育1-2小时。
4. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
5. 加入50μl/孔的标准品（人igg1-kappa 200 ng/ml于第一孔中，然后分八步进行1/2稀释至1.5 ng/ml，用0.1%bsa在dpbs中稀释）。
6. 加入50μl/孔纯化的单克隆抗体，用0.1%牛血清白蛋白稀释。使用纳米滴280nm吸光度的初始浓度确定所需的近似稀释系数。
7. 室温下孵育1-2小时。
8. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
9. 将二级抗体（hrp结合f（ab）2抗人igg-fc-gamma-spec）在dpbs中稀释1:20000，在20%之间稀释0.05%。
10. 加入50μl/孔的二级抗体，室温孵育1h。
11. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
12. 加入50μl/孔的tmb底物，在黑暗中培养7-10分钟。
13. 通过添加50μl/孔的0.5 m h2so4停止反应。
14. 在450 nm处读取板，参考过滤器650 nm（图6）。
注意：
1. 这是一种非常敏感的酶联免疫吸附试验，所以稀释时要小心。不得使用小于5μl的溶液稀释样品和标准溶液。
2. 总是保留两个威尔斯作为空白。
< BR>
图6。igg-elisa数据示例。a.igg-elisa的标准曲线。b.显示吸光度数据和igg浓度计算的表格。简单地说，一条直线拟合到标准曲线上，并用于从不同稀释样品的吸光度外推浓度值。只有在标准曲线线性范围内的吸光度才能给出准确的计算（这里用橙色突出显示）。igg原液的最终浓度是通过乘以稀释因子来计算的。可手动或使用elisa阅读器软件进行计算。*真正的浓度值表示两个浓度值的平均浓度。在调整稀释之前。< BR> < BR>
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（约3小时）
1. 对于每个还原条件，制备并标记含有5μl LDS样品缓冲液（4x）和2μl样品还原剂（10x）的还原条件试管。
2. 在相应的试管中加入每种抗体3μg。用无核酸酶水（如有必要）将最终体积调整至20μl。在还原和非还原条件下运行所有IGG。
3. 将样品放在加热块中，在70°C下放置10分钟。
4. 从加热块中取出样品，并迅速将其旋转。
5. 将凝胶放入罐中，用1X MES SDS运行缓冲液填充腔室。
6. 添加样品和梯子（例如，见蓝色Plas2预染色梯子）到凝胶。
7. 让电泳进行大约40分钟（取决于电压设置）。
8. 把凝胶取出，把两块塑料板分开。
9. 使用凝胶刀切割凝胶周围。
10. 将凝胶在水中冲洗两次，每次5分钟。
11. 用简单的蓝色安全剂加热凝胶，在微波炉中加热30秒。
12. 用水冲洗凝胶5次，每次两次。
13. 让凝胶在水中至少停留1小时，最好是过夜。
注：重链产生的频带在50至60 kDa之间，轻链在25至30 kDa之间（图7）。
< BR>
图7。纯化的单克隆抗体的SDS-PAGE凝胶图像的例子。<强/ >纯化抗体在4-12%双TIS加蛋白凝胶上使用MES-SDS缓冲液（还原）（红色）和非还原（非红色）条件下运行。重链和轻链条带的分子量在抗体和抗体之间略有不同，但重链条带的分子量通常在50-60kDa之间，轻链条带的分子量在25-30kDa之间。值得注意的是，一些acpa单抗在vh或vl区域携带n-连接糖基化，这将导致还原凝胶上的大小变化或双带。糖基化存在的正确评估可以通过与内糖苷酶的平行处理来进行（与内糖苷酶相比，pngase f；数据未显示）。考马斯蓝染色显示蛋白条带。
< BR>
多反应性和控制Elisas（约1天）
多反应性elisa
1. 在平板上涂上1μg/ml的双链DNA、胰岛素和脂多糖，50μl/孔，在4℃下放置一夜。
2. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
3. 用100μl/孔的1%牛血清白蛋白在dpbs中阻断，并在室温下培养至少1h。
4. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
5. 将50μl/孔单克隆抗体（5μg/ml）加入DPBS中1/3稀释后的第一孔中。
6. 室温下孵育1h。
7. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
8. 将二级抗体（hrp结合f（ab）2抗人igg-fc-gamma-spec）在dpbs中稀释1:20000，在20%之间稀释0.05%。
9. 加入50μl/孔的二级抗体，室温孵育1h。
10. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
11. 加入100μl/孔的tmb底物，在黑暗中培养7-10分钟。
12. 加入100μl/孔的0.5 m h2so4
13. 在450 nm处读取板，参考滤波器650 nm（图8）。
  < BR>
  图8。显示由dsdna、lps和胰岛素反应性测试的多反应性elisa示例的图表。灰色线表示阳性mabs。黑线代表阴性单克隆抗体。虚线表示正反应性的OD 450截止值。ed38：高阳性多反应对照抗体（绿线）；jb40：低阳性多反应对照抗体（蓝线）；mgo53：阴性对照抗体（红线）。
  < BR>
注意：
1. 三种不同的对照抗体可包括在多反应性elisas中：mgo53（非反应性）、jb40（弱反应性）和ed38（高反应性）（分蘖等，2008年；agmon-levin等，2014年）。
2. 当抗体识别出三种分析抗原中的至少两种时，它们被认为是多反应的。
<强> >抗牛血清白蛋白（BSA）/塑料、抗丙二醛修饰的牛血清白蛋白（MDA）和IgG抗兔IgG ELISAs < <强> Br/>
1. 在1个1/2面积的平板上涂上3μg/ml的BSA和丙二醛-BSA（每个抗原在同一平板上有6个柱），在4℃下在1个平板上涂上5μl/ml的兔IgG。
2. 用DPBS 0.05%吐温20清洗板1个。
3. 用3%牛血清白蛋白150μl/孔在dpbs中封闭，室温下孵育1h。
4. 用DPBS 0.05%吐温20清洗板1个。
5. 加入50μl/孔的单克隆抗体（5μg/ml），在1%牛血清白蛋白中稀释。包括兔血清IgG包衣威尔斯作为对照，以产生两倍稀释系列开始在每片约1:1000稀释。
6. 室温下孵育1.5h。
7. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3 x。
8. 将二级抗体[hrp结合兔f（ab'）2抗人igg-fc-gamma-spec]1:10000稀释在1%牛血清白蛋白中。
9. 加入50μl/孔的二级抗体，室温孵育1h。
10. 用PBS 0.05%吐温20洗涤4 x。
11. 每孔加入50μl TMB底物，在黑暗中孵育10分钟。
12. 通过添加50μl/孔的0.5 m h2so4停止反应。
13. 在450 nm处读取板（图9）。
  < BR>
  图9。igg anti-（bsa）/plastic、-mda-bsa和-rabbit igg elisa数据示例。此图显示了用于筛选与bsa/plastic、mda-bsa或rabbit igg结合的单克隆抗体的elisa板设置。在这个例子中，使用正系统性红斑狼疮患者血清池作为IgG抗MDA反应的阳性对照参考物（此处稀释1:100被设置为100个反应单位[Ru]／ml），并且使用含有RA患者血清池的阳性RF IgG作为阳性对照REF。兔IgG表面的ERENCE样品（这里稀释1:500设为100 ru/ml）。可通过将线性或对数线拟合到标准曲线，并从吸光度值推断相对反应性（单位：ru/ml）来确定用于elisa运行之间比较的mab反应性。
  < BR>
注意：
1. 重要的是要在同一个培养皿中检测所有与其他抗原平行结合的牛血清白蛋白单克隆抗体，以确保我们保持合理的培养时间和标准曲线。
2. bsa分析主要捕获与塑料表面结合的多反应性抗体。
3. 丙二醛-牛血清白蛋白测定可用于鉴定丙二醛修饰的蛋白质自身抗体，但丙二醛和牛血清白蛋白（或兔IgG）均呈阳性的克隆体被认为是多反应性的。
4. 兔igg-elisa可捕获具有类风湿因子活性的抗体，但也可对非结构或聚集的igg产生假阳性。
5. 在牛血清白蛋白分析或任何其他对照抗原中显示结合的单克隆抗体不被视为瓜氨酸特异性抗体。
  < BR>
瓜氨酸特异性单克隆抗体筛选（约1天）
抗α烯醇化酶1 elisa
1. 将瓜氨酸和精氨酸肽（表7）涂抹在pH值为9.6，50μl/孔的碳酸盐缓冲液中，在4°C下过夜。
  < BR> 表7。筛选瓜氨酸肽
  < BR>
2. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
3. 用100μl/孔1%bsa在dpbs中封闭，室温下孵育1-2小时。
4. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
5. 包括一个积极的RA血清池作为标准，产生两倍稀释系列开始在大约1:250稀释在每一个板块。
6. 向精氨酸和瓜氨酸涂层板中加入50μl/孔（一式两份）经RIA缓冲液稀释的单克隆抗体（5μg/ml）。
7. 室温下孵育1-2小时。
8. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
9. 在ria缓冲液中稀释二级抗体（hrp结合f（ab'）2抗人igg-fc-γ谱）1:10000。
10. 加入50μl/孔的二级抗体，室温孵育1h。
11. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
12. 加入50μl/孔的tmb底物，在黑暗中孵育10分钟。
13. 通过添加50μl/孔的0.5 m h2so4停止反应。
14. 在450 nm处读取板，参考滤波器650 nm（图10）。
注意：
1. 所有反应性样品至少在3个独立实验中进行分析。
2. 每一个板，您应该有一个标准曲线的池ACPA +RA血清样品作为对照和标准化的反应性。
3. 从5μg/ml开始重新运行瓜氨酸反应性单克隆抗体，然后进行2倍稀释至0.15 ng/ml，以生成稀释曲线。
4. 所有经鉴定的瓜氨酸反应性单克隆抗体均应使用大规模表达和质量控制的IgG批次进行确认（在SDS-PAGE上经验证为纯度高、质量好、无聚集或内毒素）。
  < BR>
  图10。抗CEP-1 ELISA数据的例子。< /强> A.使用阳性RA参考血清样品的CEP-1 ELISA标准曲线（在此稀释1:120被设置为333个活性单位（AU）/ml）。b.显示5μg/ml igg下cep-1 elisa的acpa阳性（蓝条）和阴性单克隆抗体的数据。通过将一条直线拟合到标准曲线，并从吸光度值推断出相对反应性（单位：au/ml），可以对用于elisa运行之间比较的mab反应性进行鉴定。
< BR> 抗cit纤维蛋白原、cit波形蛋白和cit纤维蛋白多肽elisa
1. 用DPBs 0.05%吐温20清洗涂有Streptavidin的板2 x。
2. 将50μl/孔的瓜氨酸和精氨酸肽（表7）涂敷在TBE缓冲液中，室温下放置1h。
3. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
4. 包括一个阳性RA血清池作为对照，以产生在每个板上大约1:250稀释开始的两倍稀释系列。
5. 向精氨酸和瓜氨酸涂层板中加入50μl/孔（一式两份）经RIA缓冲液稀释的单克隆抗体（5μg/ml）。
6. 室温下孵育1-2小时。
7. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
8. 在ria缓冲液中稀释二级抗体（hrp结合f（ab）2抗人igg-fc-γ特异性）1:10000。
9. 加入50μl/孔的二级抗体，室温孵育1h。
10. 用DPBS 0.05%吐温20清洗3个板。
11. 加入100μl/孔的tmb底物，在黑暗中培养10-15分钟。
12. 通过添加100μl/孔的0.5 m h2so4停止反应。
13. 在450 nm处读取板，参考滤波器650 nm（图11）。
  < BR>
  图11。抗CIT FIB 573（AA563-5863）ELISA数据的例子。< /强> A.使用阳性RA参考血清的CIT FIB 573 ELISA的标准曲线[在此稀释1:80被设置为333个活性单位（AU）/mL]。b.显示5μg/ml igg下cit-fib 573 elisa的acpa阳性（蓝条）和阴性单克隆抗体的数据。通过将一条直线拟合到标准曲线上，并从吸光度值推断出相对反应性（单位：au/ml），可以对两次酶联免疫吸附试验之间的比较进行mab反应性鉴定。
  < BR>
注意：
1. 所有反应性样品应至少在三个独立的实验中进行分析。
2. 每个板，应使用ACPA+RA血清样品池的标准曲线作为对照，并用于反应性的标准化。
3. 以5μg/ml的浓度重新运行瓜氨酸反应性单克隆抗体，然后用2倍稀释至0.15 ng/ml，以生成稀释曲线。
4. 所有已鉴定的瓜氨酸反应性单克隆抗体应使用大规模表达和质量控制的IgG批次进行确认（在SDS-PAG上验证具有高纯度和高质量，且无聚集或内毒素）。
抗ccp2 elisa（约3h）
按照制造商的说明（图12），以5μg/ml的浓度，使用免疫扫描ccplus临床检测igg，执行抗ccp2 elisa检测。
< BR>
图12。抗ccp2 elisa数据示例。a.ccpulus elisa的标准曲线。b.显示ccpulus elisa的acpa阳性（蓝色条）和mabs阴性的数据。按照制造商对血清样品的指示，在AU／ml中对5μg/ml单克隆抗体CCP反应性进行鉴定。< BR> < BR>

用于深入功能分析的单克隆抗体的大规模表达

质粒maxipreps（孵化约3天）
1. 将来自mabs重链和轻链丙三醇储存的细菌在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂板上清晰地划线，并在37℃下培养过夜。从mab的每一链中提取一个菌落，然后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml lb培养基中。6-8小时，将培养物扩展至含有100μg/ml氨苄西林的500 ml lb培养基中，并在37℃下过夜，以225转/分的速度振荡。
2. 孵育后，如前所述制备甘油储备，并在4000x g下离心10分钟使细菌颗粒化，并丢弃上清液。
3. 将30毫升平衡缓冲液（EQ1）直接注入过滤筒，过滤筒插入PureLink Hipure Maxi柱。使柱中的溶液通过重力流排出。
4. 将含有rnase a的10ml再悬浮缓冲液（r3）加入细胞颗粒中，轻轻摇动颗粒，直到细胞悬浮液均匀。
5. 加入10毫升裂解缓冲液（L7）。通过倒置加盖的管轻轻混合，直到混合物均匀。不要涡流。
6. 将试管在室温下培养5分钟。不要超过5分钟。
7. 加入10ml沉淀缓冲液（N3）。立即通过倒置试管进行混合，直到混合物均匀。不要涡流。
8. 将沉淀的裂解液移入色谱柱。让裂解液通过重力流过滤柱。向柱中加入10ml洗涤缓冲液（w8），使其通过重力流。
9. 丢弃内滤筒。用50毫升洗涤缓冲液（W8）清洗色谱柱。在缓冲器排干后丢弃流过的油。
10. 在Hipure过滤柱下放置一根50毫升的无菌试管。向柱中加入15ml洗脱缓冲液（e4）。让溶液通过重力流排出。丢弃列。洗脱管含有纯化的DNA。
11. 使用可随试剂盒购买的DNA沉淀装置或离心机沉淀DNA：向洗脱液中添加10.5毫升异丙醇。充分混合，并在12000x g下离心管，在4°C下离心30分钟。丢弃上清液，并向颗粒中添加5 ml 70%乙醇（以毫质量水为单位）。在12000x g下离心管10分钟，在4°C下。去除上清液并风干颗粒。
12. 向纯化的dna中加入500μl te缓冲液。
13. 测量dna质粒的浓度。
14. 在-20℃下保存质粒dna。
15. 在继续大规模表达之前对质粒进行测序（ab-sense引物）。
注意：
1. purelink试剂盒可以换成另一种高纯度质粒制备试剂盒。根据表达所需的质粒数量，将试剂盒大小从midi调整为maxi或mega。
2. 确认再悬浮缓冲液（R3）含有核糖核酸酶A，且在裂解缓冲液（L7）中未形成沉淀。
3. 对maxiprep质粒进行测序，确保序列质量高。maxipreps将是所有后续研究的起点。
大规模生产单克隆抗体（400-3200毫升细胞悬液）（培养约8天）
1. 在转染前的2-3代中增加培养基体积，以达到所需的细胞悬浮液的正确体积。
2. 在转染前一天，将expi293细胞调整到expi293表达培养基中1.8x 106细胞/ml的浓度。
3. 将1.27μg总质粒dna与每毫升转染细胞悬液混合。一半为重链（0.635μg/ml细胞悬液），一半为轻链（0.635μg/ml细胞悬液）。对于大规模生产，我们表达400-3200毫升培养基。
4. 称取pei-max，溶于optipro-sfm培养基中，制成工作液（100μg/ml），无菌滤过0.22μm，每ml细胞悬液需0.05ml工作液转染。
5. 在expi293表达培养基中将细胞浓度调整为2.5x 106cells/ml。将细胞悬液等分到其各自标记的烧瓶中，并将烧瓶放入培养箱（8%co2、37°C和125转/分在轨道振动筛中）。
6. 在optipro-sfm培养基中加入pei-max工作液。旋涡，室温下孵育10分钟。
7. 将optipro sfm培养基中的混合dna质粒/pei-max逐滴加入细胞悬液中。
8. 尽快把烧瓶放回培养箱。
9. 在37°C，125转/分下培养6天。
10. 培养后，将细胞悬液倒入225ml锥形离心瓶中。
11. 室温下，在840x g下离心30分钟。
12. 慢慢倒入50毫升试管，倒出上清液。细胞颗粒不应被破坏。
13. 室温下，将上清液在10000x g下离心20分钟以去除细胞碎片。
14. 用0.22μm过滤器过滤至新无菌瓶。
注意：
1. 始终使用新制备的PEI-MAX工作溶液。
2. 滴加pei-max/质粒混合物，同时通过旋转烧瓶小心地混合细胞悬浮液是很重要的。尽快将装有转染细胞的烧瓶放回培养箱。
3. 在无菌条件下过滤上清液。
4. 上清液可在4°C下保存数月。
单克隆抗体上清液igg浓度评估（约1天）
在继续纯化步骤之前，按照前面描述的方案评估细胞上清液中的igg浓度。
从大规模表达中纯化单克隆抗体（约3天）
1. 旋涡蛋白g琼脂糖4快速流动珠和大力摇瓶。将每个样品的足够蛋白质g添加到含有dpbs的50ml试管中。
2. 用igg-elisa的浓度计算上清液中igg的大致总量，并用该量计算要使用多少蛋白质g。蛋白质G的结合能力高达20毫克每毫升树脂。
3. 在840x g室温下离心10分钟，洗涤珠子。用移液管取上清液，加入相同体积的DPB，然后用相同的程序再次离心。
4. 在适当体积的dpbs或样品上清液中再悬浮小球，并将小球添加到含有抗体的上清液中。
5. 将装有细胞培养上清液和蛋白g珠的烧瓶放在滚筒（60转/分）上，在4℃下孵育过夜（至少14小时）。
6. 孵育后，将装有上清液和珠子的瓶子放在4℃的工作台上一段时间，让珠子沉到烧瓶底部。
7. 让几乎所有的上清液通过色谱柱。收集并保存4°C下的流过部分，以评估剩余的IgG。留下少量上清液和珠子。
8. 将剩余的上清液和蛋白g珠一起加入柱中。
9. 在装有珠子的瓶子里加入一些聚对苯二甲酸丁二醇酯，以便把剩下的珠子转移到色谱柱上。
10. 用30ml dpbs清洗三次。
11. 吸干色谱柱的底部以去除通过液滴的多余流动，并将色谱柱放置在50毫升试管的顶部。
12. 根据上清液中约总igg计算洗脱缓冲液0.1 m甘氨酸（pH3.0）的体积，以在洗脱抗体悬浮液中达到约1.5 mg/ml的浓度。根据洗脱体积计算中和缓冲液的体积（1 m Tris（pH 8.0））（约100μl Tris/ml甘氨酸）。立即中和洗脱的igg，转动试管混合。
13. 根据洗脱单抗的体积，使用zeba旋转脱盐柱（见小规模纯化）或slide-a-lyzer透析盒将缓冲液改为pbs进行储存。对于透析，将盒式磁带脱水2分钟并应用洗脱的IgG，在RT下透析至3-4L DPB（从10x稀释）2小时，转移至新的DPB（3-4L），然后在4°C下进行过夜透析（总透析体积应为透析样品体积的300倍）。
14. 用0.22μm过滤器过滤纯化的抗体。
注意：
1. 抗体处于低ph值的时间应尽可能缩短。
2. 当您开始抗体纯化时，确保洗脱后，立即将缓冲液交换到PBS和罩下的无菌过滤器。
3. 蛋白g sepharose 4快速流动是实验室通用抗体捕获的首选方法。它的结合能力约为20毫克/毫升树脂。
4. 在开始抗体纯化之前，混合100μl 1 m Tris和1 ml 0.1 m甘氨酸，用滤纸检查pH值（应为pH 7），如果pH值过高或过低，应调整1 m Tris的量。
5. 大型抗体制剂的长期储存温度应为-80℃。
纯化单抗的igg浓度评估（约1天）
在继续进行纯化步骤之前，按照前面描述的方案评估细胞上清液中的igg浓度。
SDS-PAGE（约3小时）
按照前面描述的方案在SDS-PAGE上评估IgG的纯度和质量。
igg聚集试验（约1天）
1. 在_kta fplc系统上用30ml mili-q水和50ml dpbs以0.5ml/min的流速平衡尺寸排除柱（bio-rad enrich sec 650）。
2. 用Milli-Q水清洗注射器内部。
3. 将10μg的igg1单克隆抗体吸入注射注射器（最大100μl），将注射器放入固定器中，插入注射孔。
4. 以缓慢和连续的运动注入样品。
5. 以1.0毫升/分钟的流速运行样品。样品在20毫升紫外线稳定后注入到柱上。程序在总共60毫升后停止；单体IgG的保留时间约为12.5毫升。
6. 样品完成后，用大约30毫升Milli-Q水、30毫升20%乙醇（Milli-Q水）以0.5毫升/分钟的流速清洗柱。
注意：
1. 所有样品和缓冲液在注入_kta前应通过0.22μm过滤器过滤，如果样品体积太低而无法过滤，则应在13500x g下离心3分钟。
2. 将注射器保持在注射位置，直到注射完成。
3. 为避免细菌生长、污染和柱性能差，请始终使用新制备的缓冲液。
4. 始终注意气泡。
内毒素检查（约3小时）
用于功能研究的所有较大的单克隆抗体制备都应使用鲎试剂（lal）试验检测lps污染。
瓜氨酸特异性指数与滴定曲线（约1天）
对所有大规模igg批次的瓜氨酸肽重复所有elisa，以确认结合，并从5μg/ml开始进行滴定实验（图13）。
< BR>
图13。elisa中瓜氨酸特异性单抗与cep-1（a）、cit-fib 36-52（b）和cit-vim 60-75（c）肽表面结合的滴定曲线示例 < BR>
ccp2酶联免疫吸附试验（约4小时）
参见步骤B7

食谱

ria缓冲液（ph 7.6）
10克牛血清白蛋白
20.4克氯化钠（350毫米）
10ml 1 m三氯化氢（pH7.6）
10毫升Triton X-100
10毫升10%十二烷基硫酸钠
调节ph
Milli-Q水（高达1000毫升）
注意：在使用前，请将缓冲液保存在-20°C下。
碳酸盐缓冲液（pH 9.6）
1.59克NaCo3
2.93克NaHCO3
调节ph
Milli-Q水（高达1000毫升）
注意：将本溶液保存在室温下。
10倍tbs（ph值8.0）
24.2 g Tris碱
80克氯化钠
调节ph
Milli-Q水（高达1000毫升）
注意：将本溶液保存在室温下。
缓冲区
1汤匙（用10汤匙的Milli-Q水配制）
20之间的0.05%
0.1%牛血清白蛋白
0.5 m h2so4
在1000毫升蒸馏水中稀释27.2毫升98%硫酸
注意：将本溶液保存在室温下。
0.1 m甘氨酸（pH 3.0）
7.5g甘氨酸
调节ph
Milli-Q水（高达1000毫升）
0.22μm过滤器，室温保存
1米Tris（pH 8.0）
121 g Tris碱
调节ph
Milli-Q水（高达1000毫升）
注意：将本溶液保存在室温下。
lb中等
10克巴豆胰蛋白胨
5g氯化钠
5g酵母提取物
Milli-Q水（高达1000毫升）
注：高压灭菌并在室温下储存此溶液。

致谢

这项工作由KNUT和爱丽丝华伦伯格基金会、欧洲研究理事会（授予250167）、创新药物倡议支持的BTCUE计划（授予115142-2）、瑞典风湿病协会、古斯塔夫五世国王80年基金会和瑞典医学研究所支持。理事会。

相互竞争的利益

作者没有利益冲突。

工具书类

Agmon Levin，N.，Damoiseaux，J.，Kallenberg，C.，Sack，U.，Witte，T.，Herold，M.，Bossuyt，X.，Musset，L.，Cervera，R.，Plaza Lopez，A.，Dias，C.，Sousa，M.J.，Radice，A.，Eriksson，C.，Hultgren，O.，Viander，M.，Khamashta，M.，Regenass，S.，Andrade，L.E.，Wiik，A.，Tincani，A.，Ronnelid，J.，BloCh，D.B.，Fritzler，M.J.，Chan，E.K.，Garcia d e la Torre，I.，Konstantinov，K.N.，Lahita，R.，Wilson，M.，Vainio，O.，Fabien，N.，Sinico，R.A.，Meroni，P.和Shoenfeld，Y.（2014年）。评估细胞抗原自身抗体（称为抗核抗体）的国际建议。ann rheum dis73（1）：17-23。

Amara，K.，Steen，J.，Murray，F.，Morbach，H.，Fernandez Rodriguez，B.M.，Joshua，V.，Engstrom，M.，Snir，O.，Iselsson，L.，Catrina，A.I.，Wardeman，H.，Corti，D.，Meffre，E.，Klareskog，L.和Malmstrom，V.（2019年）。收回：类风湿关节炎患者关节源性b细胞产生的单克隆igg抗体对瓜氨酸化自身抗原识别具有强烈的偏向性。j exp-med216（1）：245。

Harre，U.，Georges，D.，Bang，H.，Bozec，A.，Axmann，R.，Ossipova，E.，Jakobson，P.J.，Baum，W.，Nimmerjahn，F.，Szarka，E.，Sarmay，G.，Krumbholz，G.，Neumann，E.，Toes，R.，Scherer，H.U.，Catrina，A.I.，Klareskog，L.，Jurdic，P.和Schett，G.（2012年）。人抗瓜氨酸波形蛋白自身抗体诱导破骨细胞生成和骨丢失。J Clin Invest122（5）：1791-1802.

克里希那穆提，A.，约书亚，V.，哈吉·亨斯沃德，A.，金，T.，孙，M.，维瓦尔，N.，伊特伯格，A.J.，恩格斯特罗姆，M.，费尔南德斯·塞尔奎拉，C.，阿马拉，K.，马格努森，M.，维格布拉德，G.，卡托，J.，吉门内斯·安德拉德，J.M.，泰森，K.，拉佩基，S.，伦德伯格，K.，卡特里娜，S.B.，雅各布森，P.J.，斯文森，C.，马尔Mstrom，V.，Klareskog，L.，Wahamaa，H.和Catrina，A.I.（2016年）。类风湿关节炎相关自身抗体介导骨丢失的新型趋化因子依赖性分子机制的鉴定。ann rheum dis75（4）：721-729。

Krishnamurthy，A.，Ytterberg，A.J.，Sun，M.，Sakuraba，K.，Steen，J.，Joshua，V.，Tarasova，N.K.，Malmstrom，V.，Wahamaa，H.，Rethi，B.和Catrina，A.I.（2019年）。瓜氨酸化控制树突状细胞向破骨细胞的转化。j免疫学202（11）：3143-3150。

Lloyd，K.A.，Steen，J.，Amara，K.，Titcombe，P.J.，Israelsson，L.，Lundstróm，S.L.，Zhou，D.，Zubarev，R.A.，Reed，E.，Piccoli，L.，Gabay，C.，Lanzavecchia，A.，Baeten，D.，Lundberg，K.，Mueller，D.L.，Klareskog，L.，Malmstróm，V.和Grónwall，C.（2018年）。可变域N-连接糖基化和负表面电荷是单克隆ACPA的关键特征：对B-细胞选择的影响。欧洲免疫学杂志48（6）：1030-1045。

Neovius，M.，Simard，J.F.，Askling，J.and Group，A.S.（2011）。nationwide prevalence of rhematod arthritis and penetration of disease-modiffying drugs in Sweden.em>Ann Rheum dis70（4）：624-629.

Nielen，M.M.，Van Schaardenburg，D.，Reesink，H.W.，Van d e Stadt，R.J.，van d e r Horst-Bruinsma，I.E.，d e Koning，M.H.，Habibuw，M.R.，Vandenbroucke，J.P.and Dijkmans，B.A.（2004）。specific automatibodies precede the symptoms of rhematod arthritis：A study of serial measurements in blood donors.em>arthritis rheum

Rantapaa-Dahlqvist，S.，De Jong，B.A.，Berglin，E.，Hallmans，G.，Wadell，G.，Stenlund，H.，Sundin，U.and Van Venrooij，W.J.（2003）。Antibodies against cyclic citrullinated肽和IGA hreumatoid factor predict the development of rhematod arthritis.Arthritis Rheum48（10）：2741-2749。

Sokolov，J.，Johnson，D.S.，Lahey，L.J.，Wagner，C.A.，Cheng，D.，Thiele，G.M.，Michaud，K.，Sayles，H.，Reimold，A.M.，Caplan，L.，Cannon，G.W.，Kerr，G.，Mikuls，T.R.and Robinson，W.H.（2014）。大黄素因子作为类风湿关节炎中抗体抗体的潜在因素。

Steen，J.，Forsström，B.，Sahlström，P.，Odowd，V.，Israelsson，L.，Krishnamurthy，A.，Badreh，S.，Mathsson Alm，L.，Compson，J.，Ramsköl d，D.，Ndlovu，W.，Rapecki，S.，Hansson，M.，Titcombe，P.J.，Bang，H.，Mueller，D.L.，Catrina，A.I.，GröWallsk，D.，Niklovu，W.，Rapecki，Klareskog，L.and Malmstrom，V.（2019）。>recognition of amino acid catures，rather than specific proteins，by human plasma cell-derived monoclonal antibodies to post translationally modified proteins in rhematod arthritis.em9

Tiller，T.，Meffre，E.，Yurasov，S.，Tsuiji，M.，Nussenzweig，M.C.and Wardemann，H.（2008）。>efficient generation of monoclonal antibodies from single human b cells by single cell-pcr and expression vector cloning.em>j immunol methods329（1-2）：112-

Titcombe，P.J.，Wigerblad，G.，Sippl，N.，Zhang，N.，Shmagel，A.K.，Sahlström，P.，Zhang，Y.，Barsness，L.O.，Ghodke-Puranik，Y.，Baharpoor，A.，Hansson，M.，Israelsson，L.，Skriner，K.，Niewold，T.B.，Klareskog，L.，Svensson，C.I.，Amara，Mörboor，M.，Mussell.，201，M.pathogenic citrulline-multispecific b cell receptor clades in rhematoid arthritis.em>arthritis hreumatol70（12）：1933-1945.

Wardemann，H.，Yurasov，S.，Schaefer，A.，Young，J.W.，Meffre，E.and Nussenzweig，M.C.（2003）。Predominant Automotibody Production by early Human B cell precursors.em science301（5638）：1374-1377.

Wigerblad，G.，Bas，D.B.，Fernades-Cerqueira，C.，Krishnamurthy，A.，Nandakumar，K.S.，Rogoz，K.，Kato，J.，Sandor，K.，Su，J.，Jimenez-Andrade，J.M.，Finn，A.，Bersellini Farinotti，A.，Amara，K.，Lundberg，K.，Holmdahl，R.，Jakobsson，P.，Malmsv，Koklaring，A.，Finn，ANsson，C.I.（2016）。Autontibodies to citrullinated proteins induce joint pain independent of炎症经由Chemokine-dependent mechanism.em Ann Rheum Dis75（4）：730-738/>。