材料和试剂

移液器吸头
聚碳酸酯过滤器（例如，PC 25 mm5μm，Whatman 110613）
微量离心管（例如，Axygen，目录号：3110451）
冰
96孔板 - 黑色（例如，SPL，细胞培养板，PS，96孔，黑色，目录号：30496）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）＆nbsp;
氯化钠（例如，Merck，目录号：105404）＆nbsp;
蔗糖（例如，AMRESCO，目录号：0335）
CHAPS（3-（3-胆酰胺丙基） - 二甲基氨基-1-丙磺酸盐）（Sigma-Aldrich，目录号：C9426）
二硫苏糖醇（DTT）（Bio-Rad，目录号：1610611
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：154938）
Fluorogenic metacaspase底物，Ac-VRPR-AMC，Mw = 725.85＆nbsp; （BACHEM，目录号：4048494），储存于-20°C
7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）标准品（Sigma-Aldrich，目录号：A9891），Mw = 175.18
Pierce TM BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo，目录号：23225）
液氮＆nbsp;
5x Lauber缓冲液（见食谱1）
1 M AMC标准库存（参见配方2）
3 M荧光metacaspase底物，Ac-VRPR-AMC（见食谱3）
工作溶液（Fluorogenic metacaspase aubstrate）（见食谱4）

设备

移液器
冰桶＆nbsp;
钳子
-20°C冰柜
-80°C冰箱
超细胞破碎剂（例如，Sonic Dismembrator，Fisher Scientific，Waltham，MA）
微量离心机（例如，Thermo Heraeus Pico 17 Microcentrifuge，Thermo Fisher，目录号：75002410）
涡旋（例如，Labnet，型号：VX100涡旋混合器，目录号：S-0100）
微孔板读数器配备荧光检测功能，动力学读数和摇动选项（例如，Synergy4 BioTek，Winooski，VT）

程序

细胞提取物的制备（用于细胞收集和体积参见注释1和2）
1. 准备1x Lauber缓冲液（参见配方1）。
2. 向细胞中加入1000μl1xLauber缓冲液（注3）。＆nbsp;
3. 将管放在一桶冰中。
4. 超声处理每个样品30秒（短脉冲）。重复此步骤4次（每个样本4 x 30秒）（注4）。＆nbsp;
5. 在室温下离心，最大速度（14,000 x g ），持续5分钟。
6. 将500μl上清液转移到含有5μlDTT（1M）的新管中，置于冰上立即测定或储存在-80℃下备用。管中剩余的样品可以储存在-80°C备份和总蛋白质浓度分析。
标准的制定（注5）
使用表1作为指导，通过使用两倍稀释来制备一组标准品。
1. 准备1 M AMC的库存（参见配方2）。＆nbsp;
2. 准备15管。
3. 每管添加稀释剂（1x Lauber缓冲液）。＆nbsp;
4. 向管1中加入1μlAMC标准储备液（1M）至终浓度为1,000μM。
5. 涡旋管并从管1中取出500μl至管2（2倍稀释），因此在管2中最终浓度为500μM，涡旋管并从管2中移出500μl至管3，至终浓度为管内250μM3。对所有管重复此操作。管号15仅使用1x Lauber缓冲液（0μM）。
表1.稀释AMC标准品的制备
装载板（表2）
1. 应包括在该测定中的其他对照是a）样品空白（无底物）b）底物空白（无细胞裂解物，底物空白将确保底物不随时间自发降解）和c）DMSO对照（因为它使用）作为溶剂）。总反应体积必须保持恒定，因此可以使用1x Lauber缓冲液代替通常由细胞裂解物或底物试剂占据的体积。
2. 准备足以用于所有样品，标准品和基质空白的底物（1mM）的工作溶液（WS）（参见配方4）。
3. 根据表2中列出的内容和数量以及图1中的表格计划示例加载96孔板。＆nbsp;
4. 盖上盖子，然后转到读板器（注6）。
  
  表2.装载板所需数量和内容的说明
  
  图1. 96孔板样品，标准品和对照加载计划示例。标准样品; SB-样品空白; S-样本;副涂料 - 基材坯料; DMSO-二甲基亚砜。
5. 读板器
  在此通过连续监测2-3小时的释放来进行底物裂解（AMC的释放）。或者，可以通过在规定时间（30-40分钟）后测量AMC来执行终点分析，但建议首先连续监测以确保所选时间在反应的线性阶段内。
  阅读下一个参数板：
  1. 温度：室温。
  2. 动力学：2-3小时，每10分钟读数。
  3. 混合：在每次读取之前，所有孔应混合（中等混合，5秒）。
  4. Ex：380nm，Em：460nm。
计算
1. 标准曲线计算：
  准备标准曲线图（荧光单位[FU]对标准浓度）并计算标准曲线方程。例如，见表3和图2。
  
  表3.针对不同AMC标准浓度获得的荧光单位（FU）的示例。仅读取标准管7-15（注5）。
  
  图2.从AMC浓度（μM）的荧光读数获得的AMC标准曲线示例
2. 样本计算：
  1. 如果背景控制（样品空白或基质空白）给出实质性读数，则应从实验结果中减去这些值。减去从样本结果读取中读取的样本空白。
  2. 使用标准曲线方程插入在标准方程中获得的样品荧光值，以获得AMC浓度（表4）。
  3. 在图表上绘制数据（AMC浓度与时间的关系）（图3）。
  4. 对于每个样本，计算从线性时间点获得的斜率。这是浓度随时间变化的指标（μMAMCmin -1 ）。
  5. 将斜率（μMmin -1 ）乘以过滤体积并除以重新悬浮体积（加入1x Lauber缓冲液）（表5）。
  6. 蛋白质标准化：建议将每个动力学速率标准化为其总蛋白质量。这也将允许在不同样本之间进行比较。可以从剩余样品中确定蛋白质浓度（参见步骤A6）。细胞裂解物的蛋白质含量可以使用蛋白质测定分析来估算，该分析与Lauber缓冲液中存在的洗涤剂相容，其中不添加DTT（例如，Pierce TM BCA蛋白质测定试剂盒）。
  7. metacaspase活性率（底物速率的切割）的最终单位是μMAMCmin -1 。如果将结果标准化为mg L -1 蛋白，则最终单位为μmolAMCmg mg蛋白 -1 min -1 （单位方程参考注7，单位等式1）。＆nbsp;
  8. 平均从3个技术重复中获得的3个结果（表5）。＆nbsp;
  表4.样品1获得的FU的实例（3个技术样品重复1a，1b和1c），10分钟。时间间隔，总反应时间为110分钟，插入后得到的值FU在标准曲线方程（μMAMC）中。
  
  表5.获得斜率后的数据计算示例。斜率（μMAMCmin -1 ）乘以过滤体积（ml）并除以重新悬浮量（ml）用于标准化。建议归一化为生物量（例如，蛋白质）。然后对技术重复进行平均，得到metacaspase活性的最终结果，表示AMC释放min -1 mg蛋白 -1 的速率。
  
  图3.从样品1和样品2获得的曲线示例，表示AMC浓度（μM）随时间的变化。 3条曲线代表每个样品的3个技术读数（1a，1b和1c）或2a，2b和2c）。＆nbsp;

笔记

通过过滤收集细胞：只有当细胞分离的其他方式（例如，离心）适合时，才需要过滤过程。对于过滤过程，请按照以下步骤操作：
1. 在聚碳酸酯过滤器上过滤细胞（对于 Trichodesmium 5-10μM孔径）。
  过滤量取决于样品来源和协调。对于 Trichodesmium （~1-5μg/ ml -1 总蛋白质）的密集培养物，过滤100-200ml。对于天然海洋样品，浓度较低（约0.02μgml-1总蛋白质）应过滤2,000-4,000 ml。过滤量可能因不同的细胞而异;应进行特定测试以验证过滤量。
2. 将过滤器插入微量离心管中。
3. 用液氮快速冷冻过滤器。使用镊子将管子浸入液氮中约15秒。＆nbsp;
4. 摇动管子或轻轻涡旋直到细胞从过滤器中释放出来，然后将过滤器从管子中取出。
5. 继续超声处理步骤（步骤A4）。
  有关我们实验期间 Trichodesmium 样品采集的更多信息，请参阅Spungin等，2016,2018和2019。
在液氮中冷冻样品后，样品可以在-80℃下储存直至进一步分析。对于长期储存，建议进行缓冲液添加和细胞提取的下一步骤，然后将样品储存在-80°C。＆nbsp;
建议研究不同的细胞收缩，以确保在测定过程中不会发生饱和效应。悬浮液的量可以根据细胞浓度而改变，因此建议使用1,000μl，但如果检测到低浓度的细胞，则降低悬浮液体积。＆nbsp;
当超声处理加热样品时，每个样品每次超声处理至少间隔10-15秒。让样品在每个超声波轮之间停留在冰上。＆nbsp;
由于metacaspase活性率可能在不同生物体或不同细胞浓度下有所不同，因此标准曲线的范围应适合活性率的范围（通过样品中的metacaspase活性释放的AMC底物的量）。因此，具体测试合适的标准范围是很重要的。对于分析，我们在管7-15中使用标准品（浓度范围在0到15.6μM之间。但是，应该进行测试以确保适当的范围）。
反应在室温下瞬间发生，因此在加载板后应立即读取荧光。
metacaspase活性率（底物速率的切割）的最终单位是μMAMCmin -1 。如果将结果归一化为mg L -1 蛋白，则最终单位为μmolAMCmg mg蛋白 -1 min -1 （单位方程1）。

食谱

1. 5倍Lauber缓冲区
50mM HEPES（5.96g，100ml DDW）
100 mM NaCl（2.92 g，100 ml DDW）
10％蔗糖（100克DDW中50克）
0.1％CHAPS（0.5克，100毫升DDW）
10 mM DTT（1 ml Lauber缓冲液中10μl1M DTT，最终浓度为10 mM DTT） - 对于metacaspase活性测定，制备5x Lauber缓冲液，不含DTT（在测定过程中加入DTT，见步骤A6））
准备1x Lauber缓冲液：用DDW稀释5x Lauber缓冲液1：4。
1 M AMC标准库存
7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）标准品（Sigma）

准备1 M的库存：
对于1 M AMC原液，添加0.175 mg至1 ml DMSO
分成等分试样并储存在-20°C
3 M荧光metacaspase底物，Ac-VRPR-AMC（BACHEM）
管中量：1毫克= 0.001克

准备3毫克的库存：
对于3 mM底物原液，添加460μlDMSO至库存重构后，等分并冷冻（-20℃）。储备溶液在-20°C下可稳定长达6个月
工作溶液（Fluorogenic metacaspase aubstrate）
对于测定，我们使用1 mM的工作溶液，因此稀释测定所需的量：1：2与1x Lauber缓冲液

致谢

这项工作得到了美国 - 以色列双边科学基金会（BSF）拨款2008048给予IBF和KDB，以色列科技部和科学和技术高级理事会（HCST）的合作赠款 - 法国国际金融论坛和GIF资助号。 1133/2011到IBF。该方案根据我们以前的研究进行了调整和修改（Spungin et al。，2018和2019）。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

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