材料和试剂

移液器吸头
0.22μm1,000ml Stericup（Millipore Sigma，目录号：SCGPU11RE）
0.22μm50ml Steriflip（Millipore Sigma，目录号：SCGP00525）
LS Columns（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-101）
50毫升Falcon锥形管（Corning，目录号：352070）
15毫升CentriStar锥形管（康宁，目录号：430790）
5毫升猎鹰圆底试管（康宁，目录号：352052）
96孔圆底，非TC处理板（Sarstedt，目录号：82.1582.001）
CytoOne未处理的6孔板（USA Scientific，目录号：CC7672-7506）
Falcon70μm细胞染色机（Corning，目录号：352350）
普通和磨砂玻璃载玻片（VWR International，目录号：48312-004）
Foxp3 GFP （B6.Cg-Foxp3tm2（EGFP）Tch / J）小鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：006772）由于胸腺通常较大，最好的T reg P细胞产量来自较年轻（5-6周龄）的雌性小鼠。如果年龄较小的小鼠不可用，较老的小鼠将提供可用的T reg P细胞。然而，恢复的T reg P细胞数量可减少50％，从较年轻的小鼠中获得的数量。
重组人IL-2（R＆amp; D Systems，目录号：202-IL）
抗小鼠CD4（GK1.5）BV786（1：200）（BD Biosciences，目录号：563331）
抗小鼠CD8a（53-6.7）生物素（1：200）（Tonbo Biosciences，目录号：30-0081-U500）
抗小鼠CD25（PC61.5）PerCP-Cy5.5（1：200）（Tonbo Biosciences，目录号：65-0251-U100）
抗小鼠CD73（eBioTY / 11.8）eF450（1：100）（eBioscience，目录号：48-0731-82）
抗小鼠Ter119（Ter-119）生物素（1：200）（BD Biosciences，目录号：553672）
（可选）抗体：
1. 抗CD11b（M1 / 70）生物素（1：200）（Tonbo Biosciences，目录号：30-0112-U500）
2. 抗CD11c（N418）生物素（1：200）（Tonbo Biosciences，目录号：30-0114-U500）
3. 抗-NK1.1（PK136）生物素（1：200）（Tonbo Biosciences，目录号：30-5941-U500）
4. 抗γδTCR（eBioGL3）生物素（1：200）（eBioscience，目录号：13-5711-85）
5. 抗B220（RA3-6B2）生物素（1：200）（Tonbo Biosciences，目录号：30-0452-U500）
链霉抗生物素蛋白APC-eF780（1：200）（eBioscience，目录号：47-4317-82）
生存染料鬼 TM 红780（1：1,000）（Tonbo Biosciences，目录号：13-0865-T100）
链霉抗生物素蛋白微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-048-101）
AccuCheck计数珠（Life Technologies，目录号：PCB100）
叠氮化钠（NaN 3 ）（Ricca Chemical，目录号：7144.8-16）
10x PBS（Fisher BioReagents，目录号：BP399-20）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：BP120-500）
胎牛血清（FBS）（亚特兰大生物制品，目录号：S11150）
RPMI 1640介质（Corning，目录号：15-040-CV）
青霉素 - 链霉素溶液（Corning，目录号：30-002-CL）
L-谷氨酰胺（Corning，目录号：25-005-CL）
MEM Nonessential amino acids（Corning，目录号：25-025-CL）
2-巯基乙醇（MP Bio，目录号：02194705-CF）
HEPES（康宁，目录号：25-060-CL）
丙酮酸钠（Corning，目录号：25-000-CL）
排序缓冲区（参见食谱）
FACS缓冲液（见食谱）
cRPMI（见食谱）

设备

移液器
Sorvall Legend X1R离心机（Thermo Scientific，目录号：75004260）
BD Biosciences LSR II（BD，型号：LSR II）
BD Biosciences FACSAria II（BD，型号：FACSAria II）
MACS Multistand（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）
QuadroMACS分离器磁铁（Miltenyi，目录号：130-090-976）
II级生物安全柜/层流罩
IncuSafe Incubator（Panasonic，产品目录号：KM-CC17T0A）
血细胞计数器（Fisher，目录号：0267110）
冰箱（2-8°C，Kenmore）
松下-80°C VIP Plus冰柜

软件

FlowJo 10（10.5.3）（ https://www.flowjo.com/ ）

程序

T reg P细胞分离
1. 通过CO 2 吸入使小鼠安乐死。
2. 将来自小鼠的thymi收获到6孔板中的5ml分选缓冲液中。测试和重复的条件数决定了每个实验所需的小鼠数。在一个简单的实验中，可以使用1只小鼠，因为这应该提供5-10×10 4 CD25 + 和Foxp3 lo T reg P细胞。
3. 从这一点开始，在干净的生物安全柜中工作。
4. 在磨砂玻片之间机械地解离胸腺或有利的机械解离方法。
5. 通过70μm过滤器将细胞转移到50ml锥形小瓶中。
6. 旋转细胞在350 x g 下，在4°C下旋转10分钟（将thymi保持在50 ml锥形管中）。
7. 将细胞重悬于1ml生物素标记的抗体的消耗混合物中。这种抗体混合物应包括抗CD8（1：200）和抗Ter119（1：200）。然而，可以向该混合物中添加其他任选的耗尽抗体，例如抗CD11b（1：200），抗CD11c（1：200），抗-NK1.1（1：200），抗γδTCR（1：200）。和反B220（1：200）。
8. 在冰上孵育20分钟并盖上盖子以防光照。
9. 加15毫升分类缓冲液;在4℃下，在350 x g 下旋转细胞5分钟。
10. 计数细胞并重悬于Strepavidin微珠鸡尾酒中（在分选缓冲液中稀释至~3,000μl/胸腺的最终体积中每2-3百万个细胞约1μl珠子）。
11. 在4°C孵育20分钟（10分钟后轻轻旋转管搅拌）。
12. 加入10毫升分选缓冲液;在4℃下，在350 x g 下旋转细胞5分钟。
13. 用3ml冷分选缓冲液预冲洗LS柱（1柱/胸腺）。
14. 将细胞重悬于2 ml分选缓冲液中。
15. 将来自单个胸腺的细胞通过过滤器分离到QuadroMACS Miltenyi分离器磁体上的LS柱（图1）。
  
  图1. 体外 T reg P分化测定工作流程的示意图。首先，加工并富集胸腺CD4单阳性（CD4SP）胸腺细胞。对该表面的表面标志物进行染色，然后通过FACS分离每个T reg P.用细胞因子在96孔板中刺激分离的T reg P达预定时间。然后收获这些细胞并通过流式细胞术分析Foxp3和/或CD25的上调。
16. 用3ml冷分选缓冲液洗涤柱3次。
17. 收集15毫升锥形小瓶中未结合的部分;在4℃下，在350 x g 下旋转细胞5分钟。
18. 将细胞合并成一个15毫升的锥形管;应用表面染色混合物[CD4（1：200），活死（1：1,000），CD25（1：200），CD73（1：100）和链霉抗生物素蛋白-APC-eF780（1：200）]。链霉抗生物素蛋白-APC-eF780用于检测用于磁性耗尽的生物素缀合的抗体，包括CD8，Ter119和上述步骤7中包括的任何其他任选的抗体。
19. 在冰上孵育20分钟并盖上盖子以防光照。
20. 加入14毫升分选缓冲液;在4℃下，在350 x g 下旋转细胞5分钟。
21. 将细胞重悬于1 ml分选缓冲液中，通过70μm过滤器将细胞过滤到新的预冷的15 ml锥形中;用分选缓冲液清洗过滤器，使细胞达到合适的最终体积。
22. 在FACS Aria II上设置门，用于分选T reg P细胞，如图2所示。
23. 将CD25 + 和/或Foxp3 lo T reg P细胞收集到单独的5 ml圆底管中，加入1.5 ml Catch缓冲液（1x PBS + 50 ％FBS）。
  
  图2.用于分选T reg P的流式细胞术门控策略 A.用于从CD8 / Ter119中去除T reg P的流式细胞术门控方案胸腺细胞。 DUMP通道含有CD8，Ter119（这些在磁性耗尽期间用生物素缀合的抗体标记，用APC-eF780-缀合的链霉抗生物素蛋白探测）和活死亡。 CD73 + 细胞代表再循环和长期驻留的T reg P和T reg 。因此，分选CD73 - 胸腺细胞确保分析 de novo 发展T reg P. B.CD25 + TregP（上）和Foxp3 lo T reg P（下）的分选后纯度分析。
刺激T reg P细胞
1. 制备刺激培养基（例如：在cRPMI中2U / ml IL-2，终浓度为1U / ml）。
2. 将100μl刺激培养基加入非TC处理的圆底96孔板的每个孔中。
3. 将96孔板置于37°C培养箱中。
4. 用cRPMI填充含有分选的T reg P细胞的5ml圆底管，在4℃下在350℃下旋转细胞5分钟。
5. 在cRPMI中以1-2×10 5个/ ml细胞/ ml重悬细胞。
6. 将100μl细胞加入96孔板中的100μl刺激培养基中（平板1-2×10×2×/×细胞/孔）。
7. 将96孔板置于37℃培养箱中。
8. 孵育24-72小时（我们通常进行这些测定72小时，但可以在较早的时间点观察到CD25和/或Foxp3上调）。
体外 T reg P分化试验分析
1. 向刺激的T reg P的每个孔中加入100μlFACS缓冲液。
2. 在4℃下以350 x g 旋转细胞5分钟。
3. 倒出上清液并加入200μlFACS缓冲液。
4. 在4℃下以350 x g 旋转细胞5分钟。
5. 将细胞重悬于50μl染色混合物[抗-CD4（1：200），抗-CD8（1：200），抗-CD25（1：200），活死亡（1：1,000）]中。
6. 在冰上孵育20分钟并盖上盖子以防光照。
7. 加入200μlFACS缓冲液。
8. 在4℃下以350 x g 旋转细胞5分钟。
9. 将每个样品重悬于FACS缓冲液/计数珠主混合物（190μlFACS缓冲液+10μl计数珠/样品）中。
10. 分析T reg P与成熟T reg 细胞的分化（通常是CD25和Foxp3的共表达）。

数据分析

数据分析在FlowJo 10中进行。
用于定量T reg 分化的门控方案显示在图3中。简言之，淋巴细胞被门控，然后是单峰。对CD4 + ，CD8 /活死 - 单体进行门控并显示CD25和Foxp3的表达。代表性数据可以在图7A，补充图1和补充图7中的Owen 等人（2019）中找到。

图3.刺激3天后分析T reg P的流式细胞术门控方案。单独培养基（左）不能转化T reg P至T reg 细胞，而1U / ml IL-2刺激（右）将T reg P转化为T reg 细胞。珠子用于计算每个样品中产生的T reg 细胞的总数。使用的公式是总细胞数=检测到细胞数x（添加已知珠子数/检测到珠子）。
已公布的结果（Burchill et al。，2008; Lio and Hsieh，2008; Vang et al。，2008; Mahmud et al。，2014 ; Owen et al。，2019）表明成功转化CD25 + 或Foxp3 lo T reg P是通过响应IL-2的CD25和Foxp3的双重表达来表示。然而，我们测试过的其他细胞因子，如IL-4（Owen et al。，2019），已导致产生CD25 + Foxp3 + T reg 细胞和维持CD25 - Foxp3 lo 细胞。有趣的是，IL4刺激CD25 - Foxp3 lo T reg P细胞导致CD25 + Foxp3 <的发展sup> + T reg 细胞表达明显低于CD25的水平，而不是用IL-2刺激观察到的。因此，根据病情，还要考虑CD25 - Foxp3 + 细胞的比例以及CD25和Foxp3的平均荧光强度，如图所示。 Owen et al。（2019）补充图7.

笔记

在我们的手中，T reg P细胞是一个脆弱的群体，非常容易死于细胞。鉴于此，在整个细胞分离方案中的温和处理将从thymi产生更高量的T reg P细胞。
来自1个胸腺的典型产量是~50,000-100,000T reg P，这取决于年龄（理想的5-6周）和性别（具有较大的胸腺的雌性）。
我们为每个测定法制备新的cRPMI，以帮助维持体外 sub P细胞的生存力。
我们最大的成功是使用圆底，非TC处理的96孔板。其他96孔格式导致我们手中的细胞死亡增加。

食谱

分选缓冲液（储存在4°C，~55-60 ml /样品）
1x PBS
2％FBS
2 mM EDTA
FACS缓冲液（储存在4°C，~1 ml /孔）
1x PBS
2％FBS
2 mM EDTA
0.05％NaN 3
cRPMI（过滤灭菌，储存在4°C）
RPMI 1640中等
10％胎儿牛血清
1％青霉素/链霉素
1％L-谷氨酰胺
1％丙酮酸钠
1％非必需氨基酸
10 mM HEPES
50μM2-巯基乙醇

致谢

这项工作得到了来自NIH的R01AI124512（MAF）和免疫学培训基金2T32AI007313（DLO）的支持。该协议改编自Lio和Hsieh（2008）最初发布的方法，并根据我们实验室的研究进行了修改（Burchill et al。，2008; Vang et al。，2008 ; Mahmud et al。，2014; Owen et al。，2019）。

利益争夺

作者声明没有竞争性的财务或非财务利益。

伦理

该方案中的所有动物实验均由明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会（最新的IACUC方案1904-36975A，有效5/16 / 2019-5 / 15/2022）批准。

参考

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Burchill，M.A.，Yang，J.，Vang，K.B.，Moon，J.J。，Chu，H.H.，Lio，C.W。，Vegoe，A.L。，Hsieh，C.S.，Jenkins，M.K。和Farrar，M.A。（2008）。连锁T细胞受体和细胞因子信号传导控制着调节性T细胞库的发展。 Immunity 28（1）：112-121。
Lio，C。W.和Hsieh，C。S.（2008）。胸腺调节性T细胞发育的两步过程。 Immunity < / em> 28（1）：100-111。
Mahmud，SA，Manlove，LS，Schmitz，HM，Xing，Y.，Wang，Y.，Owen，DL，Schenkel，JM，Boomer，JS，Green，JM，Yagita，H.，Chi，H.，Hogquist， KA和Farrar，MA（2014年）。通过肿瘤坏死因子受体超家族共刺激将TCR信号强度与胸腺相结合调节性T细胞的分化。 Nat Immunol 15（5）：473-481。
Owen，DL，Mahmud，SA，Sjaastad，LE，Williams，JB，Spanier，JA，Simeonov，DR，Ruscher，R.，Huang，W.，Proekt，I.，Miller，CN，Hekim，C.，Jeschke， JC，Aggarwal，P.，Broeckel，U.，LaRue，RS，Henzler，CM，Alegre，ML，Anderson，MS，August，A.，Marson，A.，Zheng，Y.，Williams，CB and Farrar，MA （2019）。通过两个不同的发育计划产生胸腺调节性T细胞。 Nat Immunol < / em> 20（2）：195-205。
Tai，X.，Erman，B.，Alag，A.，Mu，J.，Kimura，M.，Katz，G.，Guinter，T.，McCaughtry，T.，Etzensperger，R.，Feigenbaum，L。， Singer，DS和Singer，A。（2013）。 Foxp3转录因子对发育调节性T细胞具有促凋亡和致死性，除非被细胞因子存活信号抵消。 Immunity 38（6）：1116-1128。
Vang，K.B.，Yang，J.，Mahmud，S.A.，Burchill，M.A.，Vegoe，A.L。和Farrar，M.A。（2008）。 IL-2，-7和-15，但不是胸腺基质淋巴细胞素，多余地控制CD4 < sup> + Foxp3 + 调节性T细胞发育。 J Immunol 181（5）：3285-3290。