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图1. 4S-seq方案概述。步骤A-C：从大肠杆菌培养物中纯化剪切的基因组DNA;步骤D-F：去磷酸化的ssDNA和磷酸化的衔接子的制备;步骤G-J：使用链霉抗生物素蛋白珠纯化标记的ssDNA片段;步骤K：为Illumina测序仪准备文库。

材料和试剂

1.5毫升管（Eppendorf，目录号：30108051）
0.2毫升管（NIPPON GENE CO。，LTD。，目录号：BPB79211）
1000毫升移液器吸头（Sorenson，目录号：34000）
200毫升移液器吸头（NIPPON GENE CO。，LTD。，目录号：FG-302RS）
10毫升移液器吸头（Sorenson，目录号：37660）
TapeStation D1000屏幕胶带（Agilent Technologies，目录号：5067-5582）
14毫升管（CORNING，目录号：352057）
50毫升管（Greiner Bio-One，目录号：227281）
milliTUBE 1 ml AFA纤维（Covaris，目录号：520131）
PCR Clean-up Column
电子。待分析的大肠杆菌菌株
Bacto TM 胰蛋白胨（Thermo Fisher Scientific，目录号：211705）
Bacto TM 酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，目录号：212750）
NaCl（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：192-13925）
适当的抗生素
Milli-Q水
10x PBS（NIPPON GENE CO。，LTD。，目录号：314-90185）
NucleoSpin ®凝胶和PCR清理（MACHEREY-NAGEL，目录号：74069.250）
1. 结合缓冲液NTI
2. 洗涤缓冲液NT3
3. 洗脱缓冲液NE
4. NucleoSpin ®凝胶和PCR清理色谱柱
5. 2毫升收集管
Buffer NTC（MACHEREY-NAGEL，目录号：740654.100）
Qubit TM dsDNA BR Assay Kit（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32850）
双重特异性核酸酶（Evrogen，目录号：EA001）
1. DSN酶
2. DSN存储缓冲区
3. 10x DSN主缓冲区
TapeStation D1000试剂（安捷伦科技，目录号：5067-5583）
0.5 M EDTA（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：311-90075）
Agencourt AMPure XP（BECKMAN COULTER生命科学，产品目录号：A63881）
EtOH（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：054-7225）
蔗糖（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：196-00015）
溶菌酶（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：123-06721）
100 mg / ml RNase A（QIAGEN，目录号：19101）
1M Tris-HCl（pH8.0）（NIPPON GENE CO。，LTD。，目录号：312-90061）
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（NIPPON GENE CO。，LTD。，目录号：312-90221）
FastAP热敏碱性磷酸酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EF0651）
1. FastAP热敏碱性磷酸酶
2. 10x FastAP缓冲区
寡核苷酸
1. Adapter_N8B 5'-GGGAANNNNNNNNTAGGGATAACAGGGTAATAGGAGGA-3'（Eurofins Genomics，定制）
2. 1stAdapter_primer 5'-TCCTCCTATTACCCTGTTATCCCTA-3'（Eurofins Genomics，定制）
T4多核苷酸激酶（T4 PNK）和10x T4 PNK缓冲液（NEW ENGLAND BioLab，目录号：M0201S）
100 mM ATP（TAKARA BIO INC。，目录号：4041）
T4 DNA连接酶和10x T4 DNA连接酶缓冲液（酶学，目录号：L6030-HC-L）
Dynabeads MyOne Streptavidin C1（Invitrogen，目录号：DB65001）
Tks Gflex DNA聚合酶（Gflex）和2x Gflex PCR Buffer（TAKARA BIO INC。，目录号：R060A）
I-Sce I和10x CutSmart缓冲液（NEW ENGLAND BioLab，目录号：R0694S）
SMARTer ThruPLEX DNA-Seq Kit（TAKARA BIO INC。，目录号：RB4674）
（可选）低输入库准备工具包（Clontech Laboratories，Inc。，目录号：634947）
Qubit ssDNA Assay Kit（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：Q10212）
NextSeq 500高输出套件（75次循环）（Illumina，Inc。，目录号：TG-160-2005）
Luria-Bertani肉汤（LB）（见食谱）
TE缓冲液，pH 8.0（见食谱）
裂解缓冲液（见食谱）
80％EtOH（见食谱）
2x结合和洗涤（B＆amp; W）缓冲液（参见食谱）
1x B＆amp; W缓冲区（参见食谱）

设备

200毫升烧瓶（Sansyo Co.，ltd，目录号：82-0086）
移液器（GILSON，目录号：＆nbsp;
数字光度计（TAITEC，目录号：0040889-000
Milli-Q水净化系统（Merck，型号：Direct-Q UV 5
高压灭菌器（TOMY，型号：LSX-300）
离心机（TOMY，型号：MX-307）
孵化器（TAIYO COMPANY CO。，LTD，目录号：2-6795-02）
Covaris TM M220聚焦超声波发生器 TM 仪器（Thermo Fisher Scientific，目录号：4482277）
Qubit 3.0荧光计（赛默飞世尔科技，目录号：Q33216）
加热块（WAKENBTECH CO。，LTD，目录号：WKN-9603）
热循环仪（LifeECO ver2.0）（NIPPON Genetics Co.，Ltd，目录号：TC-96GHbC）
Agilent 2200 TapeStation（Agilent Technologies，目录号：G2965AA）
磁力架为0.2毫升管（NIPPON Genetics Co.，Ltd，目录号：FG-SSMAG2）
用于1.5 ml管的磁力架（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
NextSeq 500仪器（Illumina，Inc。，目录号：SY-415-1001）

软件

bcl2fastq（v.2.18.0.12）（ https：// support。 illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2-fastq-conversion-software.html ）
BWA（v.7.1.1-r1034）（ http://bio-bwa.sourceforge.net ）
Samtools（v.1.2）（ http://samtools.sourceforge.net ）
FastQC（v。0.10.1）（ https://www.bioinformatics.babraham.ac .uk / projects / fastqc / ）

程序

细胞收集
1. 电子。通过挑取单个菌落接种大肠杆菌菌株，并使用14ml管在含有适当抗生素的2ml LB中培养，直到用数字光度计达到600nm的光密度（OD）0.4。
2. 将50微升培养物接种到200ml烧瓶中的50ml含有适当抗生素的LB中，并用数字光度计进行培养直至它们在600nm处达到0.4的OD。
3. 将50ml培养物转移到50ml管中，并通过在4℃下以4,000 离心5分钟收集细胞，然后除去上清液。
4. 用冷冻的1ml PBS（pH8.0）洗涤细胞沉淀两次后，将细胞沉淀重悬于2ml裂解缓冲液中并在37℃下孵育30分钟。
5. 通过在8,000 x g 离心5分钟收集细胞并轻轻去除上清液。
DNA剪切
1. 将细胞沉淀重悬于1ml TE缓冲液（pH8.0）中，并将细胞裂解物转移至milliTUBE 1ml AFA纤维中。
2. 将milliTUBE转移到Covaris TM M220聚焦超声波发生器 TM 仪器中，并进行以下剪切方案[峰值功率（W）：75.0;工作因数（％）：5.0;周期/爆发：200;治疗（秒）：1200;温度（°C）：9.0（最大值），7.0（设定点），5.0（最小值）]将基因组DNA解离成300-400 bp片段。
剪切的基因组DNA的纯化
1. 将总共1 ml剪切DNA溶液的125μl等分试样分配到8个1.5 ml＆nbsp;
  注意：NucleoSpin凝胶的容量有限（≤25μg，50 bp-20 kb）。剪切的基因组DNA的纯化在室温下进行。
2. 将剪切的DNA溶液与250μl结合缓冲液NTC混合。
3. 将NucleoSpin ®凝胶和PCR清洁柱放入2 ml收集管中并装入样品。＆nbsp;
4. 在11,000 x g 下离心30秒。
5. 丢弃流过物并将色谱柱放回收集管中。
6. 将700μl洗涤缓冲液NT3缓冲液加入NucleoSpin ®凝胶和PCR纯化柱中。
7. 在11,000 x g 下离心30秒。
8. 丢弃流过物并将色谱柱放回收集管中。
9. 在11,000 x g 下离心1分钟以除去洗涤缓冲液NT3。
10. 将NucleoSpin ®凝胶和PCR Clean-up柱放入新的1.5 ml管中。
11. 加入20μl洗脱缓冲液NE并在室温（18-25°C）下孵育1分钟。
12. 在11,000 x g 下离心1分钟。
13. ＆nbsp;将所有八种洗脱的DNA溶液汇集到一个新的1.5 ml管中。
双重特异性核酸酶反应
1. 根据制造商的说明，用Qubit TM dsDNA BR测定试剂盒测定纯化的基因组DNA的DNA浓度。
2. 将10x DSN主缓冲液和DSN溶液（最终浓度为0.05 U，1μg纯化的DNA片段）加入纯化的DNA片段中，并将总反应体积调整至200μl。
  注意：dsDNA切割的效率非常高。我们已经证明0.05U足以完全切割2μg的dsDNA（图2）。此外，由于用Qubit ssDNA检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）的荧光染料定量ssDNA可能不是绝对准确的，因此在该方案中，定性评估处理的DNA样品。
  
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  图2. DSN反应效率。来自2μgDNA池（包括70-mer ssDNA）的dsDNA切割反应经过模拟处理或用0.05,0.1或0.3 U的DSN处理，并通过TapeStation进行分析D1000 ScreenTape。
3. 将反应在65°C孵育20分钟，以特异性切割加热块上的dsDNA。
4. 为了灭活DSN反应，加入1.5μl0.5MEDTA（终浓度：5mM）并在室温下孵育5分钟。
5. 加入604.5μlAMSureXP（3.0x）并通过移液混合。
  注意：由于预期富集的ssDNA大小约为100 bp，因此使用更多的AMP来尽可能地恢复全部数量。
6. 在室温下孵育5分钟后，将反应管置于磁力架中2分钟以将珠粒与溶液分离。
7. 从反应管中吸出上清液并丢弃。
8. 分配200μl80％EtOH并在室温下孵育至少30秒。
9. 吸出乙醇并丢弃。
10. 再次重复步骤D7-D8。
11. 从磁力架中取出试管，在室温下孵育5分钟，完全除去EtOH。
12. 加入17μl10mMTris-HCl（pH8.0）并通过移液管混合。
13. 在室温下孵育2分钟。
14. 将反应管放入磁力架中1分钟，以从溶液中分离珠子。
15. 将纯化的产物转移到新的0.2ml管中。
16. DSN处理前后纯化的ssDNA的例子如图3所示。本演示中使用了1微升的样本。
  
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  图3.通过DSN处理ssDNA富集后ssDNA的分布。60μl基因组DNA以300μl的体积使用20 m in 1.5 U DSN，并通过以下方式使反应失活： 5mM EDTA。 TapeStation使用D1000 ScreenTape观察到富集的ssDNA。
ssDNA的去磷酸化
1. 向纯化的ssDNA中加入3μl10xFastAP缓冲液和2μlFastAP，并将总反应体积调节至30μl。
2. 将管转移至热循环仪并在37℃下孵育10分钟。
3. 通过将反应在95℃温育2分钟，使管快速转移到冰上2-3分钟，然后将其转移至室温（产物：50μl[deP-ssDNA]），使去磷酸化的ssDNA溶液失活和变性。）。
  注意：[deP-ssDNA]可在-20°C下保存过夜。
1stAdapter_BIOTEG的磷酸化
1. 结合表1中的以下试剂：
  
  表1.用于衔接子磷酸化的试剂
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2. 将反应在37°C孵育1小时，在95℃下在热循环仪上灭活5分钟，然后转移至室温（产品：5μM[P-Adapter_N8B]）。
  注意：[P-adapter_N8B]可以在-20°C下保存过夜。
L
1. 结合表2中的下列试剂。
  
  表2.用于连接ssDNA和接头的试剂
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2. 将反应在16℃孵育过夜（产品：[连接产物]）
固定化生物素化的ssDNA片段
1. 通过涡旋将Dynabeads MyOne链霉抗生物素蛋白C1珠子重悬于小瓶中。
2. 将25μl珠子（10μg/μl）转移到0.2ml管中。
3. 添加等量的1x B＆amp; W缓冲液并重悬。
4. 将管置于磁力架上1分钟并弃去上清液。
5. 从磁力架上取下试管，将洗过的珠子重悬于25μl1xB＆amp; W缓冲液中。
6. 重复步骤H4-H5两次，总共洗涤3次，并将洗过的珠子重悬于50μl2xB＆amp; W缓冲液（5μg/μl）中。
7. 用1x B＆amp; W缓冲液（产品：[dsDNA-beads]）洗涤珠子。
I-SceI限制性消化以从珠子中释放产物
1. 向[dsDNA-beads]中加入1μlI-SceI和5μl10xCutSmart缓冲液，使体积达到50μl。
2. 在37°C孵育1小时，并将上清液转移到新管中。
3. 加入150μlAMTureXP（3.0x）并用移液管混合。
  注意：片段大小预计大约为100 bp，稍微多一点AMPure用于尽可能多地恢复全部数量。
4. 在室温下孵育5分钟后，将反应管置于磁力架中2分钟以将珠粒与溶液分离。
5. 从反应管中吸出上清液并丢弃。
6. 分配200μl80％EtOH并在室温下孵育至少30秒。
7. 吸出乙醇并丢弃。
8. 再次重复步骤J6-J7。
9. 从磁力架中取出试管，在室温下孵育5分钟，完全除去EtOH。
10. 加入10μl10mMTris-HCl（pH8.0）并通过移液管混合。
11. 在室温下孵育2分钟。
12. 将反应管放入磁力架中1分钟，使珠子与溶液分离。
13. 将纯化的产品转移到新的0.2 ml管中。
文库制备和测序
1. 根据制造商的说明，使用ThruPLEX DNA-seq试剂盒制备文库。
  注意：由于预期接头连接的DNA片段数量较少，因此使用低输入文库制备试剂盒（ThruPLEX DNA-seq Kit）。当然，可以使用其他试剂盒（例如低输入文库制备试剂盒，Clontech Laboratories，Inc。）。使用该协议，我们成功地制备了具有14个循环扩增的文库。
2. 磁带库的质量检查由带有D1000 ScreenTape的TapeStation执行（图4）。
3. 使用NextSeq 500高输出试剂盒（75 bp单端读数）在NextSeq 500仪器上进行测序。
  注意：考虑到适配器的大小，读取长度应为70 bp或更多。对于大肠杆菌基因组，最佳的序列读数是100万。根据分析所需的读取量汇集库。对于NextSeq 500高输出套件（75 bp单端读取），您可以占总数的1％。
  
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  图4.带有14个循环扩增的ThruPLEX最终文库通过TapeStation进行D1000 ScreenTape分析。电泳图谱显示最大值为212 bp的峰。

数据分析

使用bcl2fastq对已排序的原始数据进行解复用。
要评估序列读取质量，请运行FastQC（v.10.1.1）。
使用BWA-MEM将序列读数与参考基因组对齐（v.7.7.1-r1034; Li和Durbin，2009），并使用samtools创建SAM格式文件而不使用未映射的读取（v.1.2）。
除适配器外，4S-seq读数还包含分子标签（5'-GGGAANNNNNNNNTAGGG-3'），此标签序列可用于确定读数是否来自Watson或Crick链。
注意：ssDNA偏斜，表示为（Watson - Crick）/（Watson + Crick），可以通过自定义Perl脚本计算（可从4Spgm.pl获得， https://github.com/nkono/4S-seq ）。图5表示分析管道和输出的示例命令。

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图5. 4Spgm的示例。只需使用参考基因组文件和SAM文件即可获得ssDNA倾斜数据。

食谱

LB
2克Bacto TM 胰蛋白胨（Thermo Fisher SCIENTIFIC）
1g Bacto TM 酵母提取物（Thermo Fisher SCIENTIFIC）
1克NaCl（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
在200毫升milli-Q水中
用高压灭菌器灭菌并加入适当的抗生素后，在室温下储存
TE缓冲区
1毫升1M Tris-HCl（pH 8.0，终浓度10 mM）（NIPPON GENE CO。，LTD）
200μl0.5M EDTA（1 mM终浓度）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
在100毫升Milli-Q水中
在室温下储存
裂解缓冲液
1毫升1M Tris-HCl（pH 8.0，终浓度10 mM）（NIPPON GENE CO。，LTD）
2ml 0.5M EDTA（终浓度10mM）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
2克蔗糖（20％[w / v]终浓度）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
292.2mg NaCl（50mM终浓度）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
20毫克溶菌酶（终浓度200μg/ ml）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
10μl100mg/ ml RNase A（10μg/ ml终浓度）（QIAGEN）
在100毫升Milli-Q水中
使用前新鲜准备
80％（v / v）EtOH
在10毫升Milli-Q水中加入8毫升EtOH（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
在室温下储存
2x B＆amp; W缓冲区
1毫升1M Tris-HCl（pH 7.5，终浓度10 mM）（NIPPON GENE CO。，LTD）
200μl0.5M EDTA（1 mM终浓度）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
11.688g NaCl（最终浓度为2M）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
在100毫升Milli-Q水中
在室温下储存
1x B＆amp; W缓冲区
500μl1MTris-HCl（pH 7.5,5mM终浓度）（NIPPON GENE CO。，LTD）
100μl0.5M EDTA（500μM终浓度）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
5.844g NaCl（1M终浓度）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）
在100μlmilli-Q水中
在室温下储存

致谢

该协议改编自我们已建立的出版物（Kono，等人，，2018）。我们感谢Nozomi Abe和Yuki Takai的技术支持，感谢James Fleming的英语校对。这项工作得到了山形县政府和日本鹤冈市的研究经费的支持。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

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Li，H。和Durbin，R。（2009）。使用Burrows-Wheeler转换进行快速准确的短读取对齐。生物信息学 25（14）：1754-1760。
Mesner，L.D.，Valsakumar，V.，Karnani，N.，Dutta，A.，Hamlin，J.L。和Bekiranov，S。（2011）。人类原始分布的气泡芯片分析在基因组规模上显示出显着的聚类成区域并与转录。 Genome Res 21（3）：377-389。
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