材料和试剂

15厘米培养皿（康宁，目录号：351058）
无RNase移液器吸头
载玻片（ThermoFisher，目录号：3011-002）
1.5 ml低粘附无RNAse微量离心管（USA Scientific，目录号：1415-2600）
50毫升锥形离心管（Corning，目录号：352098）
15毫升锥形离心管（康宁，目录号：352097）＆nbsp;
＆nbsp;无RNase20μl过滤嘴（Rainin，产品目录号：RT-20F）
＆nbsp;无RNase200μl过滤嘴（Rainin，产品目录号：RT-200F）
无RNase1,000μl过滤器吸头（Rainin，目录号：RT-1000F）
无RNase的一次性血清移液器（Corning，目录号：EF20361E）
不含RNAse的一次性颗粒杵（带管）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-141-368）
Caenorhabditis elegans （100只幼小动物）
rpl-22 -3xHA plasmid（Addgene，目录号：122203）
FseI和AscI限制酶（New England Biolabs，目录号：R0588，R0558）
液氮
1,2-二庚酰基-sn-glycero-3-phosphocholine（DHPC; Avanti，目录号：850306P）
Dynabeads Protein G（赛默飞世尔科技，目录号：10004D）
＆nbsp;单克隆抗HA抗体，纯化，克隆HA-7（Sigma-Aldrich，目录号：H3663-200UL）
1 M MgCl 2 （Ambion，目录号：9503G）
2 M KCl（Ambion，目录号：9604G）
无核酸酶H 2 O（1 L：Ambion，目录号：4387936; 100 ml：Ambion，目录号：9939）
RNAse Zap（Ambion，目录号：AM9782）
RNAsin RNAse抑制剂（Promega，目录号：N2515）
完整的迷你，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂（罗氏，目录号：4693124）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D9779-5G）
环己酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：C7698-5G）
Igepal Ca-630（NP-40）（Sigma-Aldrich，目录号：I8896-50ML）
四甲基环丁砜（与Absolutely RNA Nanoprep Kit一起使用）（Sigma-Aldrich，目录号：T2209-100G）
绝对RNA Nanoprep试剂盒（安捷伦，目录号：400753）。试剂盒包括β-巯基乙醇（BME）。
核糖核苷钒配合物（VRC）（New England Biolabs，目录号：S1402S）
1 M HEPES，pH 7.3（Thermo Fisher Scientific，目录号：J16924AE）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：494437）
乙醇（与Absolutely RNA Nanoprep Kit一起使用）（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
C的标准实验室试剂。线虫维持，分子克隆和转基因
次氯酸钠溶液（Fisher，目录号：SS290-1）
富含蛋白胨的线虫生长培养基（NGM）板（见食谱）
液体NGM（不含琼脂的标准NGM）（见食谱）
100 mg / ml放线菌酮（见食谱）
300 mM DHPC原料（见食谱）
均质缓冲液（库存）（见食谱）
含有新鲜原料的均质缓冲液（见食谱）
150 mM KCl洗涤缓冲液（原液）（见食谱）
含有新鲜成分的150 mM KCl洗涤缓冲液（参见食谱）
350 mM KCl洗涤缓冲液（原液）（参见食谱）
含有新鲜成分的350 mM KCl洗涤缓冲液（参见食谱）

设备

移液器
-80°C冰箱
台式微量离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：75002411或同等产品）
台式离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：75004504或同等产品）
用于1.5 ml微量离心管的Dynamag-2磁架（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
Dynamag-15磁架，适用于15 ml锥形管（可选; Thermo Fisher Scientific，目录号：12301D）
Nanodrop One分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：ND-ONE-W）＆nbsp;
可通往电源插座的冷藏室或冰箱（4°C）
镊子（精细科学工具）
高压灭菌器
C的标准实验室设备。线虫维持，分子克隆和转基因

程序

注意：此协议假定基本熟悉 C。 elegan s 维护和转基因。

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图1.所描述协议的工作流程。该协议包含几个步骤，每个步骤都在正文中详细描述。

制备在感兴趣的细胞中表达标记的核糖体的转基因系
1. ℃。线虫 TRAP需要在感兴趣的细胞中表达标记的核糖体亚基（ rpl-22 -3xHA cDNA）（图2）。使用标准分子克隆技术，产生具有任何目的细胞特异性启动子的启动子:: rpl-22 -3xHA质粒。
  可通过Addgene获得驱动血清素能神经元中RPL-22-3xHA表达的tph-1p :: rpl-22 -3xHA表达质粒。在该质粒中， tph-1 启动子侧翼为5'FseI位点和3'AspI位点，因此可以容易地用FseI / AscI限制性消化交换另一种选择的启动子。
  
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  图2. rpl-2 2 -3xHA表达载体的示意图。可以通过扩增目标细胞特异性启动子来替换启动子。用5'FseI限制性位点和3'AscI限制性位点进行PCR。
2. 将启动子:: rpl-22 -3xHA质粒注入成虫中，使用启动子:: GFP作为共注射标记，以产生携带染色体外阵列的转基因株系。
  1. 以通常用于启动子的正常浓度的一半（如果已知）注射质粒以降低其他组织中脱靶表达的可能性。
  2. 使用在与 rpl-22 构建体相同的启动子下驱动GFP表达的质粒作为唯一的共注射标记消除了 rpl-22 的脱靶表达的可能性。作为质粒重组的结果，在其他组织中。
3. 通过UV整合一条线并回交5x以去除背景突变。我们通常基于共注射标记物表达选择转基因系，但是如果需要也可以进行抗HA免疫染色或免疫印迹分析。我们没有尝试使用染色体外阵列或MosSCI插入的转基因动物进行TRAP，但这些可能有效。
将年龄相同的动物培养到适当的发育阶段。
1. 倒入15厘米富含蛋白胨的NGM板，让它们在室温下干燥过夜。这些平板允许强大的细菌生长，可以支持非常密集的线虫培养。
2. 种子富含蛋白胨NGM板（每种条件一个），含1ml OP50并使其干燥。将OP50尽可能多地滴在板面上，但不要将其展开。
3. 在每个平板上挑选100只年轻的成年动物并使它们生长3天，直到在平板上有许多成年后代和卵。我们通常准备四个平行板以回收足够的动物用于单细胞TRAP（150,000只动物;见下文）。
4. 用6ml M9洗涤每个平板，并将动物转移到带有血清移液管的15ml锥形管中。为漂白同步动物，加入3毫升漂白剂和1毫升5N氢氧化钠，然后偶尔翻转5分钟，直到成年动物破碎。
5. 在室温下以1,300小时离心1分钟以沉淀卵，在不干扰沉淀的情况下吸出溶液，并用10ml M9洗涤。重复洗涤2次并重悬于少量M9中。
6. 从上述步骤获得的卵可直接接种在新接种的富含蛋白胨的平板上。我们将从一个漂白的15cm平板回收的所有卵子放到一个新接种的富含蛋白胨的15cm NGM平板上。
  注意：由于担心发育停滞会影响基因表达，我们通常会避免接种被捕L1。然而，如果省略L1饥饿，动物并不是完全同步的。如果需要完美同步，我们建议包括这个L1饥饿步骤。
7. 允许蠕虫在20°C的温度下生长到所需的发育阶段。接种后大约60小时，动物将到达成年期。确保动物在实验当天不会饿死，除非这是实验设计的一部分。
在环己亚胺存在下洗涤，冷冻和裂解动物
1. 至少提前一天，准备液体NGM，均质缓冲液和洗涤缓冲液（参见食谱）。液体NGM可以在室温下储存，均质化和洗涤缓冲液在4℃下稳定一个月。
2. 在收获当天，将新鲜试剂（DTT，蛋白酶抑制剂，RNasin和VRC）加入等分试样的匀浆缓冲液（每个板1ml）中。
3. 准备环己酰亚胺原液，并将原料加入下列溶液中，终浓度为0.8 mg / ml（125倍稀释）：液体NGM（每板20ml），匀浆缓冲液（每板10 ml），均质缓冲液和新鲜试剂（1每板ml）。请注意，放线菌酮是危险的，应采取适当的预防措施。
4. 使用RNase ZAP彻底清洁您的工作站，设备和手套。
5. 将纸板插入物放在冰桶底部的微量离心管冷冻箱中，并从插入物中的研钵/研杵中放置不含RNase的管（每个板6个管）（图3）。
  
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  图3.研磨冷冻颗粒的设置照片。用液氮填充冰桶和锥形管。在微量离心管中冷却研杵并用它研磨冷冻样品。要冷却样品，使用镊子夹住微量离心管，并用它将液态氮从锥形管转移到样品中。
6. 将液氮加入冰桶中，加入无RNase的试管和桶底。不要将桶装满管子的高度;仅添加足够的额外液氮以冷却管的外部并防止管中的液氮蒸发。
7. 用10ml液体NGM +环己酰亚胺清除每个平板上的蠕虫，并用血清移液管将它们转移到15ml锥形管中。注意不要在洗涤过程中破坏细菌的草坪，以免将多余的细菌转移到试管中。
8. 在室温下以1,300 x g 旋转30秒，吸出溶液，然后用10ml液体NGM +环己酰亚胺洗涤蠕虫。
9. 在1,300 x g 下旋转30秒，抽吸溶液，然后用10ml匀浆缓冲液+环己酰亚胺洗涤蠕虫，并将溶液转移到新鲜的15ml锥形管中。
10. 在1,300 x g 下旋转30秒，吸出溶液，并加入1ml含有环己酰亚胺和新鲜试剂的均化缓冲液。
11. 使用不含RNase的移液器，将蠕虫悬浮液滴入装有液氮的无RNase管中，将蠕虫悬浮液均匀地分成五个管。在第六根管中放一小滴，稍后用于估算蠕虫的浓度。当与液氮接触时，蠕虫悬浮液将立即成珠并冻结。您无需记录这些液滴的体积，因为这将在后续步骤中进行估算。
  注意：在所有液氮蒸发或倒掉之前，不要关闭管。
12. 将管存放在-80°C。
估算蠕虫浓度
1. 为了估计蠕虫浓度，解冻额外的冷冻蠕虫管，然后将其稀释10倍，并将10μl移液到玻璃载玻片上。＆nbsp;
2. 计算Droplet中存在的蠕虫数量。＆nbsp;
3. 重复此2 x并计算平均值以估计每个冷冻样本中每μl的蠕虫数。
使用不含RNase的杵研磨冷冻的蠕虫颗粒
1. 如前所述，将液氮添加到带有纸板插入物的无RNase冰桶中。用液氮填充50毫升无RNase的锥形管作为储库（图3）。
2. 将研杵浸入装有液氮的无RNase微量离心管中，冷却研杵。＆nbsp;
3. 从-80°C冰箱中取出一根管子并将其放入桶中。用研杵彻底研磨样品，确保其保持冷冻状态，并将其研磨成细粉。每当样品开始轻微融化时，将液氮倒在其上再次冷却。
  注意：
  1. 最简单的方法是用镊子将无RNase的微量离心管浸入液氮容器中，然后将其倒在样品上。也持续冷却杵。
  2. 这个过程可能需要一段时间;要有耐心并继续冷却样品，确保样品不会解冻。避免过度腐蚀，因为这可能会破坏管子或导致样品飞出管子。＆nbsp;
  3. 重复每个试管，直到所有样品都磨成粉末。＆nbsp;
  4. 将管放回-80°C进行储存。在进行免疫沉淀步骤之前，样品可以在-80℃下储存数周。
库存缓冲剂准备
在进行免疫沉淀之前至少一天制备液体NGM，匀浆缓冲液，150mM KCl洗涤缓冲液和350mM KCl洗涤缓冲液原液。均质缓冲液和洗涤缓冲液可在4°C下储存长达一个月
进行免疫沉淀
1. 使用RNAse Zap彻底清洁您的工作站和所有设备。所有以下步骤都应在冰上进行，使样品保持冷却。＆nbsp;
2. 通过将蠕虫粉稀释到冷的均质化缓冲液（加入所有新鲜成分）至8蠕虫/μl的浓度并将其转移至15ml锥形管中来解冻。基于所用提取物的总体积，我们估计我们用于单细胞类型下拉的典型起始材料是~150,000只动物（通常从几个平板汇集）。确保样品保持冷却以防止RNA降解。
  注意：
  1. 使用少量已知体积的匀浆缓冲液将蠕虫粉轻轻重悬于每个微量离心管中。将所有粉末转移至15 ml管后，用血清移液管测量置换量，确定加入管中的粉末量，然后加入额外的均质缓冲液，使溶液浓度正确。
  2. 这种稀释非常重要，高浓度的动物可导致大量RNA降解，可能是由于内源性RNA酶。＆nbsp;
3. 将1/10体积的10％NP-40和1/9体积的300mM DHPC加入15ml管中。在冰上孵育10分钟，偶尔倒置。＆nbsp;
4. 将溶液转移至无RNase的微量离心管中，并在4℃以15,000xg旋转12分钟。将上清液转移到新管中，然后再次离心，将上清液汇集到新鲜的15ml无RNase锥形管中。＆nbsp;
5. 在离心样品的同时，在150mM KCl洗涤缓冲液中洗涤蛋白G珠。将1ml 150mM KCl洗涤缓冲液加入150μl珠子中（每IP;如果预先清除则每IP使用300μl珠子），用磁架收集珠子，吸出洗涤缓冲液，并重复2次。＆nbsp;
6. （可选）为了预先清除裂解液，将150μl经洗涤的蛋白G珠加入裂解液中，并在4°C旋转30分钟，然后用磁架收集珠子并转移澄清的上清液到一个新鲜的15毫升锥形管。我们通常在对单个细胞执行TRAP时应用此步骤，但在对大量细胞执行TRAP时（例如，在泛神经元TRAP期间）已跳过它。
7. 此时收集100μl“输入”样品，并与Agilent Absolutely RNA Nanoprep Kit中的100μl裂解缓冲液混合。根据试剂盒方案，确保已将β-巯基乙醇（BME）添加到裂解缓冲液中。涡旋，让其在室温下静置10分钟，再次涡旋，然后在-80℃下储存。＆nbsp;
8. 向预先澄清的裂解液中加入3.5μl单克隆抗HA抗体，并在4°C旋转30分钟。对于大量细胞（泛神经元TRAP），我们使用了10μl抗体。＆nbsp;
9. 向裂解液中加入150μl蛋白G珠，并在4°C旋转30分钟。＆nbsp;
10. 将15 ml锥形管放在磁架上，收集100μl“流穿”样品，并以与“输入”材料相同的方式处理。该样品对于检查在与抗体和珠子孵育期间是否存在任何RNA降解是有价值的。
11. 用350mM KCl洗涤缓冲液洗涤两次，每次轻轻颠倒管子，然后将其放在磁架上以吸出上清液。将珠子重悬于350mM KCl洗涤缓冲液中，并转移至干净的无RNA酶的微量离心管中。用350 mM KCl洗涤缓冲液再次洗涤，置于磁架上，吸出上清液（总共应将珠子用350 mM KCl洗涤缓冲液洗涤4次。）
12. 通过加入100μl裂解缓冲液和BME（来自Agilent Absolutely RNA Nanoprep Kit）洗脱RNA，涡旋，让样品在室温下静置10分钟，偶尔搅拌。将试管放在磁架上，用新鲜的冷冻无RNase微量离心管收集液体，并储存在-80°C。洗脱后可丢弃珠子。
RNA纯化
使用Agilent Absolutely RNA Nanoprep Kit按照试剂盒方案纯化RNA，包括柱上DNA酶处理。对于输入样品，典型的RNA浓度（通过nanodrop测量）为30-200 ng /μl，对于10μl体积的IP样品，典型的RNA浓度为4-10 ng /μl。

数据分析

通过在Agilent Bioanalyzer芯片（纳米或微微，取决于浓度）上运行输入，流穿和IP样品来检查RNA降解。 RNA完整性数（RIN）值应大于7.5以进行，并且大于8.5的值在经验丰富的手中是典型的。我们发现，无论输入的质量如何，IP样本都可以显示相对较低的RNA降解，因此要特别注意输入和流通质量，以确保程序顺利进行并且IP样本具有代表性。
通过RT-qPCR定量阳性对照基因。用带有随机六聚体的Superscript II试剂盒逆转录RNA，以产生用于qPCR的cDNA样品。对于低RNA量，我们还使用Nugen Ovation RNA扩增系统v2进行RT反应。使用该cDNA的2倍稀释液进行qPCR。我们使用 cdc-42 和 unc-37 作为普遍表达的对照基因， rab-3 和 tag-168 作为泛神经元基因。在进行RNA测序之前，确保您看到IP样品中已知基因相对于输入的富集。＆nbsp;

笔记

制备和分析RNA-seq数据集的细节超出了本协议的范围，但我们通常使用Takara SMART-Seq超低输入RNA试剂盒制备文库，以便在Illumina平台上进行测序。
我们和其他实验室已经发现标准的oligo-dT引发不足以从 C中消耗核糖体RNA。线虫图书馆。然而，我们通常恢复足够的非rRNA读数以具有足够的测序深度以用于大多数目的（每个文库大约2000万个非rRNA读数）。＆nbsp;

食谱

富含蛋白胨的线虫生长培养基（NGM）
1. 每1升NGM，加入2升或更大的锥形瓶中：
  22克琼脂
  20克蛋白胨
  3克NaCl
  975毫升H 2 O
2. 高压灭菌，允许冷却至55°C，并添加：
  1毫升1M CaCl 2
  1毫升1M MgSO 4
  25毫升1M KPO 4
  乙醇中1 ml 5 mg / ml胆固醇
3. 每15厘米培养皿倒50毫升，并完全固定。反转储存在4°C
M9解决方案
3克KH 2 PO 4
6g Na 2 HPO 4
5克NaCl
悬浮于1L H 2 O和高压灭菌器中冷却后，加入1ml无菌1M MgSO 4
液体NGM（不含琼脂的标准NGM）
1. 每1升液体NGM，加入加盖的瓶子：
  2.5克蛋白胨
  3克NaCl
  975ml H 2 O.
2. 高压灭菌，允许冷却至55°C，并添加：
  1毫升1M CaCl 2
  1毫升1M MgSO 4
  25毫升1M KPO 4
  在乙醇中加入1ml 5mg / ml胆固醇
3. 在室温下储存
100mg / ml环己酰亚胺
1. 将500μl甲醇加入50mg环己酰亚胺中。
2. 每天新鲜，不要存放
300 mM DHPC原液
1. 将1.38ml无核酸酶的H 2 O加入到200mg DHPC中，并使≥100mg。 60分钟完全重新悬浮
2. 储存在4°C至一个月
均质缓冲液（库存）
1. 从100ml无核酸酶的H 2 O瓶中取出9ml
2. 补充：
  1毫升1M HEPES，pH 7.3（最终浓度10 mM）
  7.5ml 2M KCl（最终浓度150mM）
  0.5ml 1M MgCl 2 （5mM最终浓度）
3. 储存在4°C至一个月
均质缓冲液含有新鲜成分
加入10毫升均质缓冲液原液：
5μl1M DTT（0.5 mM最终浓度）
RNA酶抑制剂中含有100μlRNAs（注意，这比洗涤缓冲液浓度更高）
0.5毫升核糖核苷钒配合物（VRC）
10μl100mg/ ml环己酰亚胺（100μg/ ml最终浓度）
注意：我们在液体NGM中使用更高浓度的环己酰亚胺（0.8 mg / ml终浓度），并在冷冻当天应用于活体动物的均质缓冲液。然后，我们在随后的裂解和免疫沉淀步骤中使用较低浓度的环己酰亚胺（100μg/ ml终浓度）。
1蛋白酶抑制剂片剂
150 mM KCl洗涤缓冲液（原液）＆nbsp;
1. 从100ml无核酸酶H 2 O瓶中取出19ml
2. ＆nbsp;添加：
  1毫升1M HEPES，pH 7.3（最终浓度10 mM）
  7.5ml 2M KCl（最终浓度150mM）
  0.5ml 1M MgCl 2 （5mM最终浓度）
  10毫升10％NP-40（1％最终浓度）
3. 储存在4°C至一个月
含有新鲜成分的150 mM KCl洗涤缓冲液
加入10 ml 150 mM KCl洗涤缓冲液原液：
5μl1M DTT（0.5 mM最终浓度）
RNA酶抑制剂中含有10μlRNAs
10μl100mg/ ml环己酰亚胺（100μg/ ml最终浓度）
注意：在使用前准备好。
350 mM KCl洗涤缓冲液（原液）＆nbsp;
1. 从100ml无核酸酶的H 2 O瓶中取出29ml
2. 补充：
  1毫升1M HEPES，pH 7.3（最终浓度10 mM）
  17.5ml 2M KCl（350mM最终浓度）
  0.5ml 1M MgCl 2 （5mM最终浓度）
  10毫升10％NP-40（1％最终浓度）
3. 储存在4°C至一个月
含有新鲜成分的350 mM KCl洗涤缓冲液
加入10 ml 350 mM KCl洗涤缓冲液原液：
5μl1M DTT（0.5 mM最终浓度）
RNA酶抑制剂中含有10μlRNAs
10μl100mg/ ml环己酰亚胺（100μg/ ml最终浓度）
注意：在使用前准备好。

致谢

我们感谢Cori Bargmann，Eric Schmidt，Ivo Spiegel和Myriam Heiman在制定该协议的早期阶段提供帮助。我们还要感谢Max Heiman关于 C中有效的环己酰亚胺浓度的讨论。线虫。霍华德休斯医学研究所支持该项目的早期阶段。 I.G.M.得到了JPB博士后奖学金的支持。 S.W.F.感谢JPB基金会，PIIF和PNDRF的支持。

利益争夺

没有利益冲突或竞争利益。

参考

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Heiman，M.，Schaefer，A.，Gong，S.，Peterson，JD，Day，M.，Ramsey，KE，Suarez-Farinas，M.，Schwarz，C.，Stephan，DA，Surmeier，DJ，Greengard， P.和Heintz，N。（2008）。 CNS细胞类型分子鉴定的转录分析方法。细胞 135（4）：738-748。
Heiman，M.，Kulicke，R.，Fenster，R.J.，Greengard，P。和Heintz，N。（2014）。通过翻译核糖体亲和纯化（TRAP）进行细胞类型特异性mRNA纯化。 Nat Protoc 9（6）：1282-1291。＆nbsp;
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Rhoades，J.L.，Nelson，J.C.，Nwabudike，I.，Yu，S.K.，McLachlan，I.G.，Madan，G.K.，Abebe，E.，Powers，J.R.，Colón-Ramos，D.A。和Flavell，S.W。（2019）。 ASIC调节控制觅食行为的肠道5-羟色胺能神经元的食物反应。 Cell 176：85-97.e14。
Roy，P.J.，Stuart，J.M.，Lund，J。和Kim，S.K。（2002）。 Caenorhabditis elegans中肌肉表达基因的染色体聚类。自然 418：975-979。
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Takayama，J.，Faumont，S.，Kunitomo，H.，Lockery，S.R。和Iino，Y。（2010）。中味觉感觉神经元对的单细胞转录分析Caenorhabditis elegans 。 Nucleic Acids Res 38：131-142。