材料和试剂

移液器吸头（Jet Biofil，目录号：PMT950200）
15毫升管（TrueLine，目录号：TR2011）
60毫米培养皿，无菌（Jet Biofil，目录号：62060-60）
24孔板，无菌（Corning，Costar，目录号：CLS 3524-100EA）
玻璃巴斯德吸管（Thermo Fisher，目录号：1367820A）（图1e-g）
橡胶灯泡（Thermo Fisher，目录号：1951F15）（图1h）
金刚笔（XGE，用于切割玻璃巴斯德吸管）（图1d）
1毫升转移移液管，无菌（Jet Biofil，目录号：25001）＆nbsp;
注射式过滤器（PTFE，0.22μm，30 mm，无菌）（Jet Biofil，目录号：29525）
显微镜载玻片（CITOTEST，目录号：70179000）
显微镜盖玻片（24 x 50 mm）（CITOTEST，类别编号：10212450C）
8-10周龄的成年C57BL / 6J小鼠
甘氨酸（Sangon Biotech，目录号：A610235，储存温度：室温）
磷酸盐缓冲盐水（PBS，Sigma-Aldrich，目录号：P5368-10PAK，储存温度：室温）
Triton X-100（Sangon Biotech，产品目录号：A600198，储存温度：室温）
Tween-20（Sangon Biotech，目录号：A100777，储存温度：室温）
马血清（短期储存：4°C;长期储存：-20°C）（Thermo Fisher，目录号：16050122）
胎牛血清（短期储存：4°C;长期储存：-20°C）（Trinity，目录号：010101）
GibcoTM丙酮酸钠100 mM溶液（Life Technologies，目录号：11360070，储存温度：4-8°C）
Gibco TM 青霉素 - 链霉素，液体（Life Technologies，目录号：15140-122，储存温度：4-8°C）
乙二胺四乙酸（EDTA，Solarbio，目录号：E8040，储存温度：4-8°C）
Gibco TM Dulbecco改良Eagle培养基（Life Technologies，目录号：C11995500BT，储存温度：4-8°C）
牛血清白蛋白（无IgG，无蛋白酶，Jackson ImmunoResearch，目录号：000-001-162，储存温度：4-8°C）
具有DAPI的Fluoroshield TM（Sigma-Aldrich，目录号：F6057，储存温度：4-8℃）
一抗抗MyoD（Sigma-Aldrich，目录号：M6190，储存温度：4-8°C）
一抗抗Pax7（小鼠）（Developmental Studies Hybridoma Bank，目录号：pax7，储存温度：4-8°C）
二抗：
1. 山羊抗兔IgG2a Alexa Fluor ® 488（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-21131,4-8°C）
2. 山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor ® 546（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-21123,4-8°C）
胶原酶1型（Worthington Biochemical，目录号：LS004194，储存温度：-20至-30°C）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148，储存温度：4-8°C）
山羊血清（Thermo Fisher，目录号：31872，储存温度：-20至-30°C）
EDTA（Solarbio，目录号：E8040）
鸡胚提取物（C3999，Biomol）
洗涤介质（见食谱1）
胶原酶溶液（见配方2）
4％多聚甲醛（见配方3）
文化媒体（见食谱4）
阻塞缓冲区（见第5条）

设备

移液器（Thermo scientific，Finnpipette F3）
手术器械（包括一把剪刀和一把剪刀和一把镊子）（图1a，1b和1c）
细胞培养罩（AIRTECH，型号：BSC-1004IIA2）
小鼠解剖表
4°C冰箱
离心机（Thermo Fisher，目录号：75002420）
水浴（DK-8AX）
立体显微镜（Mshot，OLYMPUS SZ61）
加热垫（DeiuxeHeart Mat，型号：MDH10）
CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：371）
激光扫描共聚焦显微镜（Carl Zeiss，型号：LSM 700）

程序

准备
1. 用未稀释的切割和粘贴移液器（图1e）涂抹移液管到小弯曲（图1f）和大（图1g）马血清。
2. 用未稀释的马血清涂覆两个6-cm细胞培养皿（每个培养皿2ml）和24孔板（每孔400μl）直至覆盖整个底部，然后在细胞培养基下孵育1分钟。培养罩，然后将马血清转移回原管并储存在4°C的冰箱中。＆nbsp;
3. 揭开平板并在细胞培养罩下风干1小时。
4. 最好在实验的同一天涂上盘子。＆nbsp;
5. 将水浴的温度设定为37°C。
6. 准备洗涤介质（按照配方1，然后将其保存在37°C水浴中）。通常，50 ml洗涤介质足以从一个EDL肌肉中分离出200个肌纤维。
7. 制备大肠杆菌胶原溶液（按照配方2，然后将其保持在37℃水浴中）。每个EDL在15ml管中需要~1ml稀释的胶原溶液（终浓度：0.2％w / v）。
8. 解冻4％多聚甲醛（遵循配方3）。
9. 插上加热垫。
  
  图1.用于EDL肌肉解剖和肌纤维分离的仪器。 a。镊子; b。剪刀; c。精细剪刀; d。钻石笔; e。玻璃巴斯德吸管; f。小弯曲移液管; g。大型移液器; h。橡胶灯泡。
EDL肌肉解剖（视频1）

视频1.分离EDL肌肉的程序。本视频由广东省微生物研究所根据广东省动物保健微生物研究所的指导制作，并经广东省微生物研究所动物研究伦理委员会批准。根据议定书[GT-IACUC 201704071]。
1. 用CO 2 麻醉实验小鼠。
2. 切开脚踝下方的皮肤。
3. 沿着内腿切开皮肤。
4. 拉起皮肤露出肌肉筋膜和髌骨（图2A）。
5. 用镊子敲打胫骨前肌（TA）肌肉筋膜。
6. 切除膝盖上的股外侧肌，暴露并切断TA和趾长伸肌（EDL）肌肉的起源（图2B）。
7. 用细剪刀剪断肌腱（图2C）。轻轻拉起肌腱，将TA肌肉与骨骼分开，露出整个身体的EDL肌肉（图2D））。
8. 通过剪断下踝的三分之二切割EDL肌腱，使用镊子的一个尖端轻轻地分开EDL肌肉（图2E）。
9. 将EDL肌肉置于带有预热胶原酶溶液的15 ml管中，置于37°C水浴中孵育60至80分钟，直至肌纤维松散但未卷曲小鼠）。
10. 在步骤B1-B9之后解剖其他EDL肌肉。
  
  图2.分离EDL肌肉的程序。此处呈现的图片（A）去除皮肤后的TA肌肉，（B）TA和EDL肌肉的起源，（C）TA肌肉的远端肌腱B. Patella; c.EDL肌肉的肌腱; d.TA肌肉的肌腱; e.TA肌肉的起源; f。（D）去除TA肌肉后的EDL肌肉，（D）EDL肌肉。 EDL肌肉的起源; g.TA肌肉的肌腱。
单肌纤维隔离（视频2）

视频2.将肌纤维与EDL肌肉隔离的程序。该视频是根据广东省动物保健微生物研究所的指导方针在广东省微生物研究所制作的，并经动物研究伦理委员会批准。根据方案GT-IACUC 201704071的微生物学。
1. 将消化的EDL肌肉转移至马血清涂覆的6cm培养皿中，其中加入5ml预热的洗涤介质，使用制备的大玻璃巴斯德吸管。
2. 用右手握住培养皿调整培养皿的位置。连续冲洗EDL肌肉，沿长轴旋转，直到加热垫上的6厘米培养皿。肌纤维自然地从EDL肌肉中释放出来。
3. 重复步骤C1和C2，使肌纤维的数量符合您的要求。许多肌纤维在释放时符合肌纤维的状况，并使用一个小的弯曲玻璃巴斯德吸管将其转移到24孔的井中在1小时内收集肌纤维。
4. 在加入500μl培养基之前，用500μl洗涤培养基洗涤每个孔三次（遵循配方4）。
5. 将24孔板置于37℃的CO 2 培养箱中。
固定术
1. 当肌纤维培养0/24/48 / 72-h或其他不同的指定时间长度时，尽可能多地去除培养基（留下最少量的培养基以避免肌纤维暴露在空气中）。
2. 在室温下用500μl4％PFA固定肌纤维10分钟。
3. 吸出固定缓冲液，加入500μl50mM甘氨酸孵育10分钟，在室温下淬灭固定。
4. 在免疫染色前，固定的肌纤维可以储存在4°C的冰箱中长达一周（图3）。
  
  图3.培养0/24/48/72 h后分离的单个肌纤维的图像。比例尺=100μm。
免疫染色
1. 用在PBS中稀释10分钟的Triton X-100（0.5％v / v）渗透肌纤维，然后在PBS中洗涤5分钟3次。
2. 制备封闭缓冲液作为配方5.将封闭缓冲液以16,000 x g 离心10分钟，以防从山羊血清中接收任何残留物。在室温下用400μl封闭溶液孵育纤维1小时。
3. 与含有Pax 7（1：100）或MyoD（1：300）一抗的200μl封闭缓冲液在4°C孵育过夜。
4. 在与一抗孵育后，用含有0.5％吐温20的PBS洗涤肌纤维3次，每次5分钟，以除去任何未结合的抗体。
5. 在室温下与含有适当二抗（1：500）的200μl封闭缓冲液孵育1小时，避光。
6. 与第二抗体孵育1小时后，每次用含有0.5％吐温20的PBS洗涤5分钟洗涤3次。
7. 将每根纤维转移到载玻片上并排出剩余的液体。
8. 盖上盖玻片并在成像前将玻片干燥至少10分钟。用含DAPI的封固剂安装载玻片。
9. 在荧光显微镜下观察肌纤维并捕获免疫染色肌纤维的图像（图4）。
  
  图4.在T0,24,48和72小时收获的单个肌纤维培养物的代表性图像。将具有卫星细胞或簇的单个肌纤维固定并用针对Pax7或MyoD的抗体进行免疫染色。红色用于Pax7 <紫色用于MyoD + 卫星细胞。蓝色用于细胞核。比例尺=100μm。

数据分析

在T0处每个肌纤维上的Pax7 + 卫星细胞的平均数量是6-8并且MyoD +

笔记

用马血清涂布板时避免气泡。
不要让镊子或剪刀接触EDL肌肉。
当使用弯曲的塑料滴管转移肌肉纤维时，应沿肌纤维的一端穿入单一的肌纤维，以避免咬住肌肉。
转移肌纤维时，将喷嘴插入液位以下，以防止肌肉纤维暴露在空气中。
覆盖玻璃单时应避免气泡。

食谱

洗涤媒体
DMEM补充：
10％胎牛血清
2％丙酮酸钠
1％青霉素 - 链霉素
2 mM EDTA
通过0.2μm过滤器过滤溶液（可选，去除血清中的任何碎片）
胶原酶溶液
DMEM补充0.2％1型胶原酶
4％多聚甲醛
1. 将4克多聚甲醛粉末溶于100毫升PBS中。＆nbsp;
2. 将溶液加热至65℃直至多聚甲醛完全溶解
3. 通过0.2μm过滤器过滤溶液并储存在-20°C
文化媒体
DMED补充20％胎牛血清
1％鸡胚提取物
1％青霉素 - 链霉素
通过0.2μm过滤器过滤溶液
阻塞缓冲区
PBS补充：
3％BSA
0.5％吐温20
5％山羊血清（在阻断程序之前加入）

致谢

这项工作得到了“GDAS”科技发展项目（批准号2018 GDAS CX-0806）对谢立伟的支持。
作者贡献： LW.X.设计了实验并收集了本研究的资助.LW.X.，SJ.C。，HR.D。和XP.Y.开发并优化了该方法。 SJ.C收集并分析了数据.SJ.C起草了手稿和LW.X.校对手稿。

竞争利益

作者声明不存在财务或研究利益冲突。

道德

C57BL / 6J小鼠在广东微生物研究所（GDIM）的SPF动物设施中以12/12黑暗光照周期饲养，可自由获取食物和水。动物协议由动物保护用途委员会提供。 GDIM（许可＃：GT-IACUC201704071）。

参考

由Bekoff，A。和Betz，W。（1977a）维护的分离的成年大鼠肌肉的特性。在组织培养中。 J Physiol 271（2）：537-547。
Bekoff，A。和Betz，WJ（1977b）。从神经支配获得的分散肌纤维的生理特性和分化的成年大鼠肌肉。 J Physiol 271（1）：25-40。
Bischoff，R。（1986）。培养中完整肌纤维上肌肉卫星细胞的增殖。 Dev Biol 115（1）：129-139。
Collins，CA，Olsen，I.，Zammit，PS，Heslop，L.，Petrie，A.，Partridge，TA and Morgan，JE（2005）。来自成人肌肉卫星细胞生态位的细胞的干细胞功能，自我更新和行为异质性。细胞 122（2）：289-301。
Danoviz，ME和Yablonka-Reuveni，Z。（2012）。骨骼肌卫星细胞：背景和在原代培养系统中分离和分析的方法。 Methods Mol Biol 798：21-52。
Gallot，YS，Hindi，SM，Mann，AK和Kumar，A。（2016）。隔离，文化和单个肌纤维染色。生物方案 6（19）：e1942。
Lim，CL，Ling，KH和Cheah，PS（2018）。分离，培养和免疫染色单肌纤维：研究卫星细胞行为的改进方法。 J Biol Methods 5（1）：e87。
Mauro，A。（1961）。骨骼肌纤维的卫星细胞。 J Biophys Biochem Cytol 9：493-495。
Pasut，A.，Jones，AE和Rudnicki，MA（2013）。个人的隔离和文化myofibers和来自成年骨骼肌的卫星细胞。 J Vis Exp （73）：e50074。
Rosenblatt，JD，Lunt，AI，Parry，DJ和Partridge，TA（1995）。养殖卫星生活单肌纤维外植体细胞。体外细胞生物学动物 31（10）：773-779。