材料和试剂

材料
1. 无菌6和10厘米细菌培养皿（非粘性塑料）（康宁，目录号：351007和351029）
2. 移液器吸头（0.5-10μl，10-100μl，100-1,000μl）
3. 无菌15和50毫升猎鹰管
4. 封口膜
5. 70μm细胞过滤器过滤器（VWR，目录号：732-2758P）
6. 24 x 32 mm盖玻片（VWR，MenzelGläser，目录号：630-2873）
7. 软铅笔型刷（任何软刷类型都没有太强的毛发，可能刺穿/损坏PDMS表面，其中制造微流体设备。刷子，来自典型的硬件/便利店，直径为2 5毫米工作效果最好，不需要实验室级别。尼龙/合成毛发不是问题。）
8. 防水标记，带有精细（1毫米）或非常细（0.3毫米）的尖端
生物材料
1. 来自小鼠胚胎干细胞的运动神经元
2. 来自人多能干细胞的运动神经元
试剂
1. 70％乙醇
2. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
3. PBS（Thermo Fisher，目录号：14190136）
4. Poly-L-ornithine，0.01％溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A-004-C）
5. 纤连蛋白，1 mg / ml溶液（Sigma-Aldrich，目录号：F1056）
6. 层粘连蛋白，1 mg / ml溶液（Sigma-Aldrich，目录号：L2020）
7. TrypLe Express（赛默飞世尔，目录号：12604021）
8. Neurobasal（Thermo Fisher，目录号：21103049）
9. 带有GlutaMAX的DMEM / F12（Thermo Fisher，目录号：31331028）
10. B27补充，定制（Thermo Fisher，目录号：0080085SA）
11. 青霉素/链霉素（Thermo Fisher，目录号：15140122）
12. GlutaMAX补充剂100x（Thermo Fisher，目录号：35050061）
13. 2-Mercaptoethanol（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
14. 抗坏血酸，100mg粉末（Sigma-Aldrich，目录号：A4403），通过将粉末溶解在2.84ml无核酸酶的dH O O中制备200mM储备溶液。
15. Y-27632,10mg粉末（Tocris，目录号：1254），通过将粉末溶解在3.12ml无核酸酶的dH 2 O中制备成10mM储备溶液。
16. LDN-193189二盐酸盐，10mg粉末（Tocris，目录号：6053），通过将粉末溶解在2.09ml DMSO中制备成10mM储备溶液，然后在DMSO中制备1mM工作原液（1:10稀释）
17. SB-431542,10mg粉末（Tocris，目录号：1614），通过将粉末溶解在2.60ml DMSO中制备成10mM储备溶液
18. CHIR-99021,10mg粉末（Tocris，目录号：4423），通过将粉末溶解在7.16ml DMSO中制备成3mM储备溶液
19. DAPT，10mg粉末（Tocris，目录号：2634），通过将粉末溶解在2.31ml DMSO中制备成10mM储备溶液
20. SAG，1mg粉末（Tocris，目录号：4366），通过将粉末溶解在4.08ml DMSO中制备成500μM储备溶液
21. 全部反式视黄酸，50mg粉末（Sigma-Aldrich，目录号：R2625），通过将粉末溶解在1.66ml DMSO中制备100mM储备溶液，然后制备1mM工作原液（1 ：在DMSO中稀释100倍
22. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
23. 牛血清白蛋白（BSA），7.5％dPBS溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A8412）
24. 胶质衍生的神经营养因子（GDNF），10μg粉末（Peprotech，目录号：450-10），通过将粉末溶解在含有0.1％BSA的1ml dPBS中制备成10μg/ ml储备溶液
25. 脑源性神经营养因子（BDNF），10μg粉末（Peprotech，目录号：450-02），通过将粉末溶解在含有0.1％BSA的1ml dPBS中制备成10μg/ ml储备溶液
26. RNase-inhibitor（Takara，目录号：2313A）
27. DTT（SuperScript II逆转录酶试剂盒的一部分，Thermo Fisher，目录号：18064071）
28. 不含核酸酶的dH 2 O（Thermo Fisher，目录号：10977-035）
29. 37％甲醛溶液（Merck Millipore，目录号：818708）
30. 鼠标MN培养基（参见食谱）
31. N2培养基（见食谱）
32. B27培养基（见食谱）
33. 人类EB培养基（见食谱）
34. 裂解/收获解决方案（见食谱）

设备

玻璃烧杯（500毫升）
无菌镊子（Dumont，目录号：11251-20，或其他类似标准尺寸的镊子）
移液器（0.5-10μl，10-100μl，100-1,000μl）
磁力搅拌器
无菌层流罩
加湿培养箱（37°C，5％CO 2 ）
吸气器
标准神经元装置（Xona MicrofluidicsTM，SND 75/150/450/900）
低速轨道振动筛（Elmi-tech，DOS-20S）
例如Laxco LMI-3000或Carl Zeiss PrimoVert。任何类似的设置都很好。）

倒置明场显微镜（放大倍率需要20倍！

软件

R（ https://www.r-project.org ）
RStudio开源版，美国马萨诸塞州波士顿（ https://www.rstudio.com ）

程序

微流体装置的储存和清洗
来自Xona MicrofluidicsTM（标准神经元器件）的具有任何沟槽长度的商业微流体装置可以存储在dH 2 O中并且多次使用。
注意：器械的沟槽长度可能会影响轴突与树突的比例，这些比例可以穿过相对的腔室，也可能影响器械中培养时间的长度。对于小鼠神经元，我们使用150个器械对于人类运动轴突，我们使用具有450μm沟槽的装置。长度为0.3μm的沟槽并且在培养的7天期间看到大部分轴突被回收。
1. 将装置置于具有500ml 1％Triton X-100的dH 2 O的玻璃烧杯中2小时，并使用磁力搅拌器保持装置搅拌。
2. 之后将设备转移到dH 2 O.使用软刷轻轻清洁微槽表面和设备的腔室。
3. 每次在新鲜的dH 2 O中洗涤3×10分钟以除去Triton X-100的任何残留物。然后，在70％乙醇中的无菌装置至少10分钟。
  注意：洗涤程序可以随时进行，设备可以在70％乙醇中储存，以备不时之需。在涂层程序启动当天启动设备附件（下图）。
微流体装置附着于细胞培养表面
1. 使用无菌镊子从70％乙醇中取出微流体装置，让装置在无菌层流罩中风干20分钟。使用吸气器除去残留的乙醇。
  注意：在此阶段设备完全干燥非常重要，因为任何剩余的液体都会对设备连接产生负面影响，并可能导致后期泄漏。
2. 将4滴4μldH2 O置于无菌的10cm细菌培养皿中（图1A）。
3. 将无菌玻璃盖玻璃（32 x 24 mm，厚度＃1或＃1.5）放在水滴顶部，以确保盖玻片不会在餐具内移动（图1B）。
4. 使用设备背面（凹槽上方）（凹槽上方）（凹槽上方）轻轻施力如果所有凹槽位于同一焦平面并因此连接到盖子上，则标记可用作驴子的主题。以这种方式连接的设备至少稳定四周。细胞将在一个角落附着防水标记物附着在玻璃表面上，以确定装置未来的左右方向。该装置形成细胞的“天花板”，并为轴突产生凹槽。盖玻片。
注意：＆nbsp;
1. 设备也可以直接放置在组织培养级塑料盘中（即，直接放在塑料上，没有盖玻片）。设备的最终设置（步骤B4）。然而，成像目的，将它们放在玻璃盖玻片上是有益的。
2. ＆nbsp;除了此处描述的PDMS设备外，Xona Microfluidics TM 还提供用于细胞培养的预粘合设备（XonaChips）。虽然这些设备与普通设备相同，但它们不是最适合重复使用，可以使用常规设备（SND150）。对于预粘合设备，可以跳过附加步骤（程序B）。
  
  图1.在10 cm培养皿中设置4个微流体装置。 A.首先，将4滴4μldH 2 O均匀分布在10 cm培养皿中。 B.安装盖玻片时，将一个微电流装置的特征面朝下放在每个盖玻片上，轻轻按下滴液玻璃盖玻璃的顶部，在盖玻片和塑料盘之间形成水封。 C.在一个10厘米的盘子中最终设置四个设备。如果需要，可以进行其他设备布置（就餐具尺寸而言）。＆nbsp;
在微流体装置中涂覆表面
第1天：
1. 主表面涂层由dH 2 O中的0.001％聚-L-鸟氨酸组成。每个装置制备0.5ml溶液。
2. 如果没有发生这种情况，请使用带有1 ml移液器吸头的吸气器，将液体吸入每个装置的两个底部孔中。顶部。不要吸入所有液体。
3. 在右上角和左上角与右上角之间添加不同的体积，顶部凹槽和顶部右侧，右上角和右上角。
4. 在室温下将涂层保持过夜并使其避光（例如，抽屉效果良好）。
第2天：
1. 使用1x PBS洗涤设备两次。洗涤，从孔中吸出涂层，然后将PBS加入孔中，底部75μl，然后顶部150μl。
2. 第二层涂层由2μg/ ml纤连蛋白和5μg/ ml层粘连蛋白在PBS中的溶液组成。以与第一层相似的方式添加最后一层涂层 - 参见步骤C2-C4。
小鼠胚胎干细胞运动神经元的规格通常，分化的良好起点是干细胞的10cm培养皿，融合度为约70-80％。细胞总是保持在37℃和5％CO 2 的潮湿培养箱中。 br /> 第1天：
1. 预热的TrypLE Express用于在37°C（即，2 ml用于6 cm培养皿，4 ml用于10 cm培养皿）中在管中解离。此外，预热管8ml DMEM / F12-GlutaMAX（或任何其他基于MEM的普通介质）。
2. 添加TrypLE Express以启动解离。
3. 当细胞倒圆并从培养皿中取出时，使用移液管将它们完全分离在TrypLE Express中，然后将所有物质转移到预热的DMEM管中。
4. 在室温下以200 x g 旋转4分钟。
5. 去除上清液并将细胞重悬于1ml小鼠MN培养基（配方1）中并计数。
6. 将细胞置于细菌（非粘附）培养皿中，密度为0.5至1.5百万个细胞/ ml（细胞数量依赖于细胞系，需要进行测试），并以30 rpm的速度放置在低速轨道振荡器上在孵化器中过夜。
第2天：
1. 要更换EB上的培养基，将整个培养基（包括EB）移液到管中。让EB下沉约2分钟并除去上清液。重新吸收EBs将1ml新鲜培养基放入新培养皿中。
第3-6天：
1. 更换为新鲜小鼠MN培养基，补充100 nM全 - 反式 - 维甲酸（RA）和500 nM平滑激动剂（SAG）。重复4天，见表1.
  
  表1.小鼠多能干细胞分化运动神经元的因素
第7天::
1. 在连续4天图案化后，细胞准备解离并接种到微流体装置中（见下文）。
来自人多能干细胞的运动神经元的规格
通常，分化的良好起点是10 cm的干细胞培养皿，融合度约为70-80％。细胞总是保持在37°C和5％CO 2的加湿培养箱中。 < br /> 第1天：
然而，最后，以0.5M-0.75M细胞/ ml的密度重悬细胞在人EB培养基中（该密度可以与EB日相同）。补充第1天人类EB媒体，其中包含第1天所需的因素（概述见表2）：
5μMY-27632（ROCK抑制剂）
200 nM LDN-193189
40μMSB-431542
3μMCHIR-99021
200μM抗坏血酸

表2.运动神经元从人多能干细胞分化的因素

第2-10天：
每隔约24小时进行一次每日培养基更换，并记录每天的相应因素（表2）。
注意：虽然协议的RA-SAG阶段（第3-10天），但并非绝对要求媒体更改遵循24小时间隔，并且必要时（但不推荐）可以省略一天的媒体更改。但是，至关重要的是，前两天的双SMAD抑制（使用SB-431542和LDN-193189）是48小时而不是更短。
第10天：
细胞准备分离成种子流体装置（见下文）。
细胞解离和播种准备
1. 将EB转移到无菌的15 ml Falcon试管中，让EB沉到底部1-5分钟，然后吸出剩余的培养基。
2. 将1ml预热（37°C）TrypLE Express加入含有EB的Falcon试管中，解离需要10-20分钟，具体取决于EB的大小。
3. 每隔5分钟轻轻搅动EB，方法是轻拍管或用1 ml移液管轻轻上下移液。注意：如果您在TrypLE Express中5分钟后第一次用EB暂停，请不要将它们吸移到移液器吸头中，因为它们位于内部内侧的尖端。在暂停中稍微激动。
4. 加入9毫升预热的DMEM稀释1毫升的TrypLE Express。一旦EB开始分解，上下移液相当明显地大约10次以完成解离。
5. 通过70μm细胞过滤器过滤器过滤所得悬浮液以除去未分布的团块/碎片，然后在室温下以200 x g 旋转4分钟。
6. 计数细胞。将沉淀重悬于1ml DMEM / F12-GlutaMAX（或任何其他基于MEM的MEM介质）中。
7. 将密度调节至每μl2.5×10 4个细胞的最终浓度（这将确保随后每个微流体装置接种总共1×10 5个细胞）将细胞重新悬浮在所需量的培养基中（即），将1ml细胞悬浮液转移到Eppendorf管中，再以200 xg 旋转4分钟。 >，每2.5 x 10 4个细胞1μl。在此阶段，细胞应重悬于最终培养基中，对于人细胞，这是具有第10天因子的B27培养基（参见表10）。 2），对于小鼠细胞，这是具有第7天因子的小鼠MN培养基（参见表1）。
  如何，强烈建议添加抗坏血酸和营养因子（以及人体细胞的ROCK抑制剂）以提高电镀后的存活率在微流体装置的受限环境中。
8. 准备最后足够的介质以填充所有设备（每个设备0.5毫升）。最后，设备将保持介质卷，如图2所示。
9. 加入营养因子使浓度增加到50 ng / ml。“取所需量的培养基（见图2）”对轴突室（顶部和底部孔）转移到新管中的营养因子浓度越高。轴突“侧面将改善整个微槽的轴突募集。
  
  图2.播种时微量流体装置中的培养基体积和营养因子浓度。请注意，人类和小鼠MN之间的神经营养因子的体细胞浓度不同。轴突穿过微槽进入表面后对于小鼠和人来说，两侧的因子浓度均等于10ng / ml。
细胞播种
1. 通过抽吸开始从设备上去除涂层（从10厘米的盘子一次带有四个设备）。＆nbsp;
2. 将4μl培养基（含有50 ng / ml BDNF / GDNF）加入轴突侧的腔室中。移液器靠近左上方的腔室入口（图2中的方向，见图3A中的照片）并允许资本力将液体吸入腔室。
3. 一旦将细胞接种在室中，将装置放入培养箱中并使细胞附着约15-20分钟。
4. 一旦细胞出现附着在细胞上，细胞在检查细胞并附着在孔上后放置在装置上10分钟。孵化器过夜。
  注意：
  1. 如果发生这种情况，我们建议仅向所有孔中添加40μl培养基（每侧保持正确的培养基类型）偶尔细胞即使在15分钟后也不能很好地附着，可能部分是由于隔室之间的流动。这样，流量最小，蒸发也不会成为问题。然后将这样的单元格再保持一小时，最后将介质添加到图2中的推荐量。
  2. 除了此处描述的所有内容外，如表2所述，每天在培养基中保持相应的因子。营养因子（BDNF / GDNF）浓度
    有一个体细胞室，轴向室在最初的几天内接受营养因子梯度（见下文）。
    
    图3.将细胞接种到微流体室和代表性显微照片中。 A.可以将介质/细胞添加到微流体装置的腔室中的角度的示例照片。虚线表示腔室的位置在轴突室和体细胞室中的良好培养物的显微照片，其中可见神经元胞体簇。
培养设备
1. 将神经元接种到微流体装置后，每天更换培养基以确保营养因子梯度保持完整。可以使用明视野显微镜来跟踪轴突生长。
  注意：更换培养基时，不要将培养基从培养室中吸出，因为这样会正式清除所有细胞/轴突，只更换孔中的培养基。
2. 一旦看到轴突穿过几个微槽进入轴突区室（即> 10个带轴突的凹槽），可以去除营养因子梯度，并且两个隔室都可以接收参见图3B，获得具有生长轴突的微流体装置的成功显微照片。
用于RNA测序的室间收获
1. 准备裂解/收获溶液。每个微流体装置准备~70μl溶液，或者好像只收集一个隔室（最终推荐的溶解体积为50μl用于体细胞室，10μl用于轴突补体）确保最终溶液中存在更高浓度的RNA，这有助于下游应用。
2. 裂解溶液（参见食谱）由无核酸酶dH 2 O的2％Triton X-100溶液组成。首先，将该溶液在冰上冷却，然后补充：
  每100μl含0.5μlRNase抑制剂（终浓度0.2 U /μl）
  RNase抑制剂酶活性所需的1 mM二硫苏糖醇（DTT）
  注意：在准备和使用过程中，始终将裂解液保持在冰上。
3. 准备无核Eppendorf管。根据收集的样品标记，并在冰上预冷。
4. 在收集后立即将干冰准备好快速冷冻收获的样品。
5. 如果在轴突样品的下游生物信息学分析中检测到体细胞污染，则可以针对任何交叉竞争的体细胞仔细检查这些图像。
6. 首先用预热（37°C）PBS洗涤两个隔室一次。使用至少100μlPBS。
7. 从轴突孔中取出PBS，并在腔室顶部加入10μl裂解液，就好像接种细胞一样。
8. 将溶液转移到制备的Eppendorf管中并快速 - 等待10秒，然后在底部孔中上下移液~5x，并从室底部提取尽可能多的溶液（可以>10μl）。在干冰上冻结。
9. 再次向轴突侧添加至少100μlPBS。
10. 对于体细胞侧重复上述步骤I7和I8，但是使用50μl裂解液。当提取溶液时，尝试尽可能多地提取（>50μl）。在干冰上快速冷冻。
11. 收集和快速冷冻后，用于RNA测序的样品可以在-80℃下储存直至进一步使用。
注意：有关无RNA提取的RNA测序文库制备的详细说明，方案和试剂，请参见Nichterwitz等，2018。生成轴向和体细胞测序文库，标准实验室实践与成为相关使用经过RNAse / DNAse认证的一次性用品和经过分子生物学等级认证的试剂。考虑专用工作站（工作台）和代表隐私的热循环仪，即保持样品冷（4°C）和表面清洁。由于每个设备的材料（RNA）数量少，与单个细胞的材料相容，我们采用了Smart-seq2协议，这是一种用于单细胞转录组学的既定方法。简要说明，样本很快从第一步开始使用oligo-dT引物和模板开关LNA-oligo使-80℃和10μl轴突裂解物（5μl体树突裂解物）进行逆转录。此时，cDNA的质量和数量可以通过生物分析仪使用dsDNA高灵敏度来测量。最后，标记了cDNA文库（Nextera XT Kit，Illumina）和带有Illumina指数的条形码，用于RNA测序。

图4.使用Axon-seq进行RNA测序的典型生物分析仪图。轴突cDNA样品与体细胞树突样品相比具有明显的特征。
为了染色目的将细胞固定在装置中
1. 从孔中取出所有培养基，用PBS清洗两个隔室。
2. 添加甲醛时，在介质更换过程中使用的所有孔中保持相似的体积（参见图2）。随后的流体通过隔室和微槽。
3. 让设备在室温下固定30分钟。
4. 用PBS洗涤3次，处理甲醛废物。
5. 将设备储存在PBS中（所有孔中约200μl）直至进一步使用。如果在几天内未使用，请用封口膜包裹10 cm培养皿。
  注意：在进行所需的染色方法（免疫细胞化学/ FISH / RNAscope）之前，需要将设备与10cm塑料盘中的盖玻片一起移除。
6. 使用1毫升移液器，在盖玻片的边缘周围添加一条细线H 2 O.这将失去表面并使其在几秒/分钟后漂浮。

数据分析

生物信息学质量控制

在进行RNA测序后，应进行生物信息学质量控制（QC）步骤以排除具有（痕量）体细胞污染的轴突样品。
注意：以下是使用编程语言R（R核心团队，2018）进行的生物信息学QC的简化版本。更深入的生物信息学知识和R以下是排除任何受躯体污染的样本的一般指南。
1. 确保将RNA测序数据处理为计数表（原始读取计数）和具有标准化值的RPKM表（每千位基因读数的每千碱基读数）。
2. 为了执行此操作，应从计数表中提取每个样本的总计数（=映射读数），以及排除具有太少的映射读数或检测到的基因的样本的基因总数。计数。
3. 排除少于2.5 x 10 5个映射读数的样本。
4. 排除任何计数少于2,500个基因的样本。
在这个一般的QC之后，可以检查数据是否有轴突样本的躯体污染。简而言之，有四个指标需要调查：
轴突样本中检测到的基因数量
2D可视化图（PCA / umap）
相关热图中的样本相关性
基于所有表达基因（或子集）的分层聚类
1. 受到体细胞污染的样本将在轴突样本中进行，绘图将作为点图。作为粗略的指导线，轴突样本包含超过8,000个基因。调查此分布中的任何异常值。检测到的基因数量。
2. 使用基本R函数 prcomp ，或者包 umap （Konopka，2018），绘制样本的2D可视化（ prcomp <的前2个主要成分< ，或 n_components = 2 u map ）。调查图。通常，轴突和体细胞样本将在2D空间中强烈分离。朝向体细胞样品（图5）。
3. 使用基本R函数 corr ，基于所有表达的基因计算样本之间的相关性。可以使用来自包含所有表达基因的函数 pheatmap 将该相关矩阵绘制为热图。通常，轴突样本与体细胞样本具有低相关性。然而，争用样本将与所有体细胞样本具有增加的总体相关性。
4. 在 pheatmap （Kolde，2019）中，可以基于数据集中的所有表达基因生成具有相应分层树聚类的热图。其中聚类通常被划分为不同的聚类，区分聚类以分析样本用soma样品。
  
  图5.示例PCA图显示污染样品向体细胞样品的移动。它们还增加了每个样品检测到的基因数量。
请注意，需要为每个测量设置截止值，排除样品的决定取决于污染的严重程度。
使用这四个测量，人们可以了解可能受到污染的样品。

食谱

小鼠MN培养基（500毫升）
240毫升Neurobasal
240毫升DMEM / F12-GlutaMAX
10毫升B27补充，定制（库存50倍，添加完整的补充瓶）
5毫升青霉素/链霉素
5毫升GlutaMAX补充剂
0.91毫升2-巯基乙醇
N2培养基
1瓶（500毫升）DMEM / F12-GlutaMax
5毫升N2补充剂（库存100倍，添加完整的补充瓶）
5毫升青霉素/链霉素
B27中等
1瓶（500毫升）Neurobasal
10毫升B27补充，定制（库存50倍，添加完整的补充瓶）
5毫升青霉素/链霉素
人类EB培养基
N2介质和B27介质的50/50混合物（上图）
裂解/收获溶液（每个微流体装置约70μl）
2％Triton X-100无核酸酶dH 2 O.在冰上冷却，然后补充：
每100μl含0.5μlRNase抑制剂（终浓度0.2 U /μl）
RNase抑制剂酶活性所需的1 mM二硫苏糖醇（DTT）

致谢

欧盟神经退行性疾病联合计划（JPND）[529-2014-7500];神经科学战略研究计划（StratNeuro）;卡罗林斯卡医学院;Ahlén-Stiftelsen（mA1 / h17和mA1 / h18）; Ulla-Carin Lindquists支持ALS forskning;和Magnus Bergvalls stiftelse [2015-00783和2016] -01531]到EHJAB获得瑞典医学研究学会（SSMF）的博士后奖学金。
＆nbsp;该协议基于我们之前在2018年的干细胞报告中发表的研究：Nijssen et al。（2018）。

竞争利益

作者声明没有财务或非财务竞争利益。

道德

瑞典斯德哥尔摩区域伦理审查委员会批准使用人类干细胞系（区域） Etikprövningsnämnden，斯德哥尔摩，EPN）。

参考

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Briese，M.，Saal，L.，Appenzeller，S.，Moradi，M.，Baluapuri，A。和Sendtner，M。（2016）。整个转录组分析可以恢复运动轴突的RNA含量。 Nucleic Acids Res 44（4）：e33。
Campenot，RB（1977）。通过神经生长因子局部控制神经元发育。 Proc Natl Acad Sci USA 74（10）：4516-4519。
Holt，CE和Schuman，EM（2013）。分散的中心法则：关于RNA功能的新观点神经元中的局部翻译。 Neuron 80（3）：648-657。
Kolde R.（2019）。 R-package：pheatmap。漂亮的热图。
Konopka T.（2018）。 R-package：umap。均匀流形逼近和投影。
Nichterwitz，S.，Chen，G.，Aguila Benitez，J.，Yilmaz，M.，Storvall，H.，Cao，M.，Sandberg，R.，Deng，Q。和Hedlund，E。（2016）。 a href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27387371”target =“_ blank”>激光捕获显微镜结合Smart-seq2进行精确的空间转录分析。 Nat Commun 7：12139。
Nichterwitz，S.，Benitez，JA，Hoogstraaten，R.，Deng，Q。和Hedlund，E。（2018）。 LCM-Seq：使用激光捕获显微切割与基于PolyA的RNA测序偶联的空间转录组分析方法。方法Mol Biol 1649：95-110。
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