材料和试剂

0.8μm150ml过滤装置（Thermo Scientific Nalgene，目录号：125-0080）
Nunc TM 细胞培养处理过滤盖的烧瓶（Nunc TM ，目录号：136196）
Falcon <®>®细胞刮刀，无菌（Corning®，目录号：353085）
Falcon ® 50 ml高净度PP离心管（Corning ®，目录号：352098）＆nbsp;
RNase-free Microfuge Tubes（1.5 ml）（Invitrogen TM ，目录号：AM12400）
5cc BD Luer-LokTM一次性注射器（BD，目录号：309603）
21 G 11/4针（BD，目录号：305166）
10 ml血清移液管，无菌（USA Scientific，目录号：1071-0810）
Fisherbrand TM SureOne <<>气溶胶屏障移液器吸头（Fisherbrand TM SureOne TM ，目录号：02-707-404 [1,000μl]，02-707-430 [200μl]，02-707-432 [20μl]）
CCF-STTG1细胞系（ATCC，目录号：CRL-1718）
RPMI-1640 Medium（ATCC，目录号：30-2001）
胎牛血清（FBS）（ATCC，目录号：30-2020）
LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix，GeltrexTM（Invitrogen，目录号：A1413202）
70％乙醇
RNaseZapTMTM RNase去污解决方案（AmbionTM，目录号：AM9780）
TRIzol TM Plus RNA纯化试剂盒（Ambion TM ，目录号：12183555）
细胞恢复解决方案（康宁，目录号：354253）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P3813）＆nbsp;
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
无核酸酶水（未经DEPC处理）（Ambion TM ，目录号：AM9937）
无DNA DNA去除试剂盒（Ambion TM ，目录号：AM1906）
RNA 6000 Nano Kit（安捷伦，产品目录号：5067-1511）
乙醇，Pure（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
RPMI-1640完全培养基（见食谱）
无菌1x PBS（见食谱）

设备

GilsonTM PETETMAN ClassicTM移液器（Gilson，目录号：F123600 [P20]，F123601 [P200]，F123602 [P1000]，F144802 [P10]，F144801 [P2] ）
2100生物分析仪（安捷伦，目录号：G2939BA）
Drummond Pipet-Aid，平原，110V（Drummond，目录号：DP-110）
生物安全柜（Nuaire，目录号：NU-425-600）
4°C离心机（Beckman Coulter，目录号：AllegraTM 21 R）＆nbsp;
离心机转子
37°C水浴（Sheldon Manufacturing Inc.，目录号：1211）
AutoFlow Water Jacket CO 2 孵化器（Nuaire，目录号：NU-4750）＆nbsp;
-20°C冰柜

软件

2100专家（安捷伦）
Photoshop CS6（Adobe）

程序

细胞培养
1. 对于使用RPMI-1640完全培养基的CCF-STTG1细胞分别进行2D和3D培养。对于3D培养，用100μl/ cm 2 Geltrex 涂覆T25烧瓶并允许将CCF-STTG1细胞置于固化的Geltrex TM 顶部，密度为5×10 4个细胞/ cm，在37℃培养箱中固化30分钟。对于单层或2D培养，直接在T25烧瓶中培养相同数量的细胞（在加入细胞之前用基质标记烧瓶）。在37℃和5％孵育烧瓶CO 2 。
2. 定期监测细胞生长。
  每隔一天吸出旧培养基并在培养瓶中加入新鲜培养基。
RNA分离
注意：确保所有用于RNA分离的供应品，如离心管，移液器吸头，塑料移液管和微量离心管都是无菌的，不含DNase和RNase。
1. 当2D和3D培养物中的细胞达到约80-90％汇合时开始RNA分离（图1）。这通常需要大约一周，尽管它可能随细胞类型和过程类型而变化。在同一天处理两个培养瓶平行。
  
  图1.相差图像显示单层和水凝胶培养物中80-90％汇合的CCF-STTG1细胞。允许CCF-STTG1细胞在A）单层和B）水凝胶培养物中生长直至达到80在开始RNA提取程序之前-90％融合。
2. 在紫外线之前用乙醇处理所有表面，然后用RNase ZAP处理 - 包括离心机转子，移液管和组织培养室外的工作台表面。
3. 打开离心机使其冷却至4°C。
4. 打开并将水浴设置在37°C。
5. 此外，准备冷1x PBS（用于细胞回收溶液）。在开始RNA提取程序之前，对组织培养罩和所需材料进行紫外线灭菌30分钟。
6. 离心管。在4℃下在200 xg 下离心5分钟。使用转移刮刀并转移至50ml，使用细胞刮刀将胰蛋白酶包括在2D和3D培养瓶中。由于它改变了基因表达，因此未在此程序中使用（Chaudhry，2008）。
  注意：如果培养皿由材料制成，可以在培养皿或培养皿中直接用TRIzol ® 试剂裂解细胞。与TRIzol ® 试剂兼容。请在此之前检查产品详细信息及其兼容性。＆nbsp;
7. 请确保在含有单层细胞沉淀的另一个管中留下等体积的培养基，因为这些管将在相同条件下平行处理。
8. 使用TRIzol或细胞回收溶液，用两种方法中的一种将星形细胞瘤细胞与基底膜基质分开。选择的方法通过分析两种基质与表面的目标细胞系来确定。我们发现细胞回收溶液对某些细胞系（例如，HCC70细胞系，图2B）效果很好，而其他细胞系被发现敏感并在暴露后死亡（例如<其中，CCF-STTG1细胞系，图2A。我们决定将TRIzol用于这些细胞系。由于2D和3D培养必须独特处理，2D或单层培养也暴露于等体积的TRIzol细胞。恢复解决方案，虽然它们不含矩阵。
  
  图2.显示从单层和水凝胶培养物中提取的总RNA质量的电泳图。从星形细胞瘤细胞系CCF-STTG1的单层和水凝胶培养物中提取总RNA。每个样品一微升总RNA A.使用TRIzol（上图）和细胞回收溶液（下图）从CCF-STTG1细胞分离的RNA。从用作对照的HCC70（乳腺癌细胞系）细胞中提取的RNA以显示回收溶液适用于HCC70细胞，但不适用于CCF-STTG1细胞.a：18s峰，b：28s峰。
  1. 使用TRIzol试剂：
    1. 将TRIzol®试剂加入两个管中，使样品体积为总体积的10％，样品中加入5分钟。例如，如果样品体积为1 ml，则加入9 ml TRIzol应该添加。＆nbsp;
    2. 将细胞通过21 G x 11/4“针头和5cc注射器至少5-6次裂解细胞。
    3. 细胞裂解后，每毫升TRIzol®试剂加入0.2毫升氯仿，倒置试管混合内容物15分钟，然后在室温下孵育2-3分钟。
    4. 在4℃以15,000 x g 离心15分钟。
    5. 无色上层相的体积变为无RNase管。无色上相的体积根据样品的体积和前面步骤中添加的TRIzol /氯仿而变化。例如，在我们的情况下，含有2.8 ml细胞的基质的体积，所以我们加入2.8×9毫升= 25.2毫升TRIzol加0.2×25.2毫升= 5.04毫升氯仿。所以溶液的总体积为~33毫升。其中，无色上相的体积出现了〜 50％，即，18 ml（图3）。
    6. 加入70％乙醇（等体积）至终浓度为35％。使用绝对或分子生物级酒精制成70％乙醇，以减少污染的机会。
    7. 通过倒置管子以分散沉淀物来充分混合。
      
      图3.离心步骤后分离无色上层相。然后用TRIzol和氯仿孵育，CCF-STTG1的单层和水凝胶样品在15,000 xg 离心15分钟在4°C下获得含有RNA的无色上层相。
  2. 使用细胞回收方案：
    1. 用冷的1x PBS洗涤细胞三次，并将等量的细胞回收溶液（227μl/ cm 2）直接加入T25烧瓶中。＆nbsp;
    2. 使用细胞刮刀刮擦细胞并转移到冷的50ml离心管中。＆nbsp;
    3. 每15分钟翻转一次，混合悬浮液。
      在冰上孵育直至GeltrexTM溶解（最多1小时，每个细胞系的品种）。注意：请注意用于溶解Geltrex的细胞回收溶液的暴露时间 TM 。某些细胞系可能对在进行主要实验之前，优化细胞系的治疗时间。
    4. 当细胞在管底部沉降时，将混合物在200℃下在4℃下离心5分钟。
    5. 在冷的1x PBS中洗涤细胞两次。＆nbsp;
9. 使用制造商（Ambion）方案进行RNA提取，以从动物细胞中分离总RNA。
10. 使用DNA-freeTM试剂盒去除DNA污染，并在-80°C下储存纯RNA直至使用。＆nbsp;
11. 使用Agilent bioanalyzer检查提取的RNA完整性的质量（图2）。
  注意：RNA完整性编号（RIN）> 8的样品被认为是纯的和高质量的，并用于实验。如果样品中的RNA浓度小于25 ng /μl，安捷伦软件可能不会显示RIN值（Mueller 等，2004）。在这种情况下，使用Nanodrop等其他方法确定RNA浓度至关重要。通过视觉确认RNA完整性也很重要。检查安捷伦软件提供的电泳图，即使没有显示RIN值。

数据分析

使用Agilent bioanalyzer 2100和RNA 6000 Nano Kit确定RNA质量。＆nbsp;
使用制造商（安捷伦）的说明在芯片上加载RNA样品，并使用2100 Bioanalyzer Expert软件在芯片上读取（图2）。

食谱

RPMI-1640完整介质
RPMI 1640基础培养基
10％FBS
1. 混合两种成分并通过0.8μm过滤装置过滤灭菌培养基
  注意：我们的实验室不使用抗生素进行细胞培养，但您可以根据您的要求将其添加到适当浓度的培养基中（通常为总体积的1％）。
2. 储存在4°C并在一个月内使用
无菌1x PBS
1. 将粉末状内容物从一袋PBS溶解到1,000ml蒸馏水中，得到1x PBS，pH7.4
2. 高压灭菌溶液并在室温下储存

致谢

感谢您对此项工作的帮助。此协议已从之前的健康与人文研究所进行了修改。公布的RNA提取方法（Lee et al。，2007; Mroue and Bissell，2013）。

竞争利益

作者宣称没有竞争利益。

参考

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