材料和试剂

96孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：167008）＆nbsp;
猎鹰管，15和50毫升容量（康宁，目录号：430791和430291）
Luer-lock注射器，2 ml，5 ml和10 ml容量（BD Plastipak，目录号：300185,302187和300912，分别）
微量离心管，1.5 ml容量（Eppendorf，目录号：0030120086）
移液器吸头（Rainin LTS1,000μl，LTS250μl和LTS20μl;目录号：17001864,17001863和17001865;或与本协议使用的移液器兼容的等效吸头）
聚碳酸酯厚壁超速离心管，容量32毫升（Beckman Coulter，目录号：355631）
聚丙烯OptiSeal（TM）超速离心管，11.2 ml容量（Beckman Coulter，目录号：362181）和相关的管适配器（Beckman Coulter，目录号：362202）
半微量比色皿（Sarstedt，目录号：67.742）
硅胶管（内径1 mm，壁直径1 mm）（Fisher Scientific，目录号：10430313）
不锈钢钝头针，14号（Sigma-Aldrich，目录号：Z261408）
具有预切隔垫的总回收玻璃瓶和瓶盖（Waters，目录号：186000385C）
垃圾箱
X光胶片（Fujifilm，目录号：4741019289）
Trans-Blot®TurboTM聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Bio-Rad，目录号：1704157）
Saccharomyces cerevisiae 菌株适合于实验目的（例如，BY4741（Baker Brachmann et al。，1998），我们用于最近的hyperLOPIT研究夜莺 et al。，2019）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：320099）
丙酮，分析纯（Sigma-Aldrich，目录号：32201）
乙腈，HPLC梯度级（Fisher Scientific，目录号：A / 0627/17）
腺嘌呤半硫酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：A3159）
AmershamTM ECL Prime增强化学发光蛋白质印迹检测试剂（GE Healthcare，目录号RPN2232）
甲酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：70221）
氢氧化铵（Sigma-Aldrich，目录号：30501）
精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A8094）
Difco Bacto 琼脂（Fisher Scientific，目录号：10455513）
Difco Bacto蛋白胨（Fisher Scientific，目录号：DF0118-17-0）
Difco Bacto酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：DF0127-17-9）
cOmpleteTM Mini蛋白酶抑制剂片（罗氏，目录号：11836170001）
cOmpleteTM蛋白酶抑制剂片（罗氏，目录号：11873580001）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
磷酸氢二钾（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Melford Laboratories，目录号：D11000）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
Ficoll <®> PM-400（Sigma-Aldrich，目录号：F4375）
甲酸（VWR，目录号：20318.297）
HEPES游离酸（Melford Laboratories，H75030）
组氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：H6034）
盐酸，37％（v / v）（Fisher Scientific，目录号：H / 1200 / PB15）
羟胺50％（w / v）溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：90115）
碘乙酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：I6125）
异亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：I5281）
亮氨酸（西格玛奥德里奇，目录号：L8912）
赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L5501）
醋酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：M5661）
氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
蛋氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M5308）
脱脂奶粉，如Marvel TM
OptiPrep （Sigma-Aldrich，目录号：D1556）
苯丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P5482）
醋酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：P1190）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：31248）
蛋白质浓度估计测定，例如PierceTM BCA蛋白质测定（Thermo Fisher Scientific，目录号：23225），DC TM蛋白质测定（Bio-Rad，目录号：5000112））或Quick StartTM Bradford检测（Bio-Rad，目录号：5000202）
测序级改良胰蛋白酶（Promega，目录号：V5111）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：436143）
氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：06203）
山梨糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：W302902）
蔗糖（西格玛奥德里奇，目录号：S0389）
苏氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T8441）
TMT 10-plex或11-plex同量异位标记试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：90111或A37725，反映）
三氯乙酸（TCA）（Fisher Scientific，目录号：421455000）
三氟乙酸（TFA）（赛默飞世尔科技，目录号：85183）
Tris base（Melford Laboratories，目录号：T60040）
三 - （2-羧乙基）膦（TCEP）（Generon，目录号：GEN-TCEP）
色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T8941）
Tween ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
酪氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T8566）
Uracil（Sigma-Aldrich，目录号：U1128）
缬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：V4638）
水，HPLC梯度级（Fisher Scientific，目录号：W / 0106/17）
不含氨基酸的酵母氮碱（Sigma-Aldrich，目录号：Y0626）
Zymolyase 100-T（Nacalai-Tesque，目录号：07665-55）
抗Pgk1p抗体，用作cytosol蛋白质印迹标记（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录号：ab113687）
抗Dpm1p抗体，用作内质网Western印迹标记物（ThermoFisher Scientific，目录号：A-6429）
抗Pep1p抗体，用作高尔基体蛋白质印迹标记物（艾博抗（Abcam），目录号：ab113690）
抗Cox4p抗体，用作线粒体蛋白质印迹标记物（ThermoFisher Scientific，目录号：459150）
抗Hh3p抗体，用作核免疫印迹标记（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录编号：ab1791）
抗Pma1p抗体，用作质膜western blotting标签（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录号：ab4645）
5x SDS-PAGE样品缓冲液（Jena Biosciences，目录号：BU-117）＆nbsp;
4-20％Mini-PROTEANTGX<<> <<>预制蛋白凝胶（Bio-Rad，目录号：4561096）
TGS缓冲液10x（Bio-Rad，目录号：1610732）
10x酵母氮碱（YNB）（见食谱）
10倍完全补充混合物（见食谱）
40％（w / v）葡萄糖（见食谱）
含2％葡萄糖的合成培养基（见食谱）
YPD琼脂培养基（见食谱）
TCEP减少缓冲液（见食谱）
原生质球介质（见食谱）
Zymolyase 100-T解决方案（见食谱）
原生质球洗涤介质（见食谱）
（可选）Ficoll裂解缓冲液（Kizer et al。，2006）（见食谱）
（可选）Buffer NP（Kizer et al。，2006）（参见食谱）
1x LB（见食谱）
6x LB（见食谱）
碘克沙醇工作溶液（IWS）（见食谱）
18％（w / v）OptiPrep解决方案（参见食谱）
16％（w / v）OptiPrep解决方案（参见食谱）
蛋白质再溶解缓冲液（见食谱）
消化缓冲液（见食谱）
5％（v / v）羟胺（见食谱）
TTBS（见食谱）
阻止解决方案（见食谱）
二硫苏糖醇（DTT）溶液（见食谱）
碘乙酰胺（IAA）溶液（见食谱）
平衡缓冲液（见食谱）
脱盐缓冲液1（见食谱）
脱盐缓冲液2（见食谱）
洗脱缓冲液（见食谱）
RP流动相储备液（见食谱）
RP流动相A（见食谱）
RP流动相B（见食谱）
RP重新溶解缓冲液（见食谱）

设备

4°C冰箱（Polestar冷却，型号：MR 100 E）
-20°C冰柜（Hotpoint，型号：FZS175）
-80°C冰箱（New Brunswick Scientific，型号：U725-G）＆nbsp;
Acquity超高效液相色谱（UPLC）系统，带光电二极管阵列（PDA）检测器（沃特世）
Acquity UPLC BEH C 18 专栏（Waters，目录号：186002353）
分析天平（Explorer，型号：EX124）
具有自动弯月面检测功能的Auto-Densiflow蠕动泵（Labconco）
Avanti ® JXN-26落地式制备离心机（Beckman Coulter）
Bioruptor ® Plus超声波发生器（Diagenode，目录号：B01020001）
离心瓶组件，500 ml容量（Beckman Coulter，目录号：355649）
比色皿分光光度计（Cecil Instruments，型号：2041）
Dounce均质器，7 ml容量（Wheaton，目录号：357542）
Erlenmeyer烧瓶，250 ml，500 ml和2 L容量（Fisher Scientific，目录号：15429103,15439103和11383454）
手持式模拟折射仪（Bellingham + Stanley，E-line，目录号：44-803）
JLA-10.500转子（Beckman Coulter，目录号：369681）
氮气蚀容器（Parr Instrument Company，型号：4639）
Optima TM L80-XP落地式超速离心机（Beckman Coulter）
Orbitrap Fusion TM Lumos TM Tribrid TM 质谱仪（赛默飞世尔科技）
无氧氮气瓶（BOC，氮气[无氧] 230 bar气瓶，尺寸：W）＆nbsp;
移液器（Rainin LTS L-1000 XLS，L-200 XLS，L-20 XLS和L-10 XLS，目录号：17014382,17014391,1704392和17014388;或能够分配相同容量的等效移液器）
读板分光光度计，能够测量250 nm和850 nm之间的波长（Molecular Devices，Spectramax M2e）
质谱仪耦合nanoLC的预柱（Thermo Fisher Scientific，目录号：160454）
Proxeon EASY-Spray色谱柱（Thermo Fisher Scientific，目录号：ES803）
冷冻台式离心机，能够离心15 ml和50 ml Falcon管并以4,500 x g 运行（Eppendorf，型号：5804R）
冷冻台式微量离心机，能够离心微量离心管并以16,100 x g 运行（Eppendorf，型号：5415R）
Sep-Pak®tC<18>滤芯，每个滤芯100 mg吸附剂（Waters，目录号：WAT036820）
摇动培养箱进行细胞培养（Sartorius，Certomat，型号：BS-1）
SW32钛转子（Beckman Coulter，目录号：369650）
Thermo Scientific TM Sterilin 标准90mm培养皿（Fisher Scientific，目录号：15370366）
用于微量离心管和Falcon管的管架（Starlab，目录号：E2345-1000）
Trans-Blot
®Turbo TM 系统（Bio-Rad，目录号：1704150）
70型Ti转子（Beckman Coulter，目录号：337922）
终极RSLC纳米色谱系统（赛默飞世尔科技）
真空离心机（Labconco，CentriVap浓缩器）
VTi 65.1转子（Beckman Coulter，目录号：362759）
电泳系统和相关的电源组（Bio-Rad，型号：Mini-PROTEAN ® II）

软件

Proteome Discoverer 2.1版（Thermo Fisher Scientific， www.thermofisher.com ）
R编程语言（R核心团队，2018年）（ www.r-project.org ）
Bioconductor（Gentleman et al。，2004）MSnbase package（Gatto and Lilley，2012）（ http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/MSnbase.html ）
Bioconductor（Gentleman et al，2004）pRoloc package（Gatto et al。，2014）（ http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/pRoloc.html ）
Bioconductor（Gentleman et al。，2004）pRolocGUI包（Breckels et al。，2018）（ http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/pRolocGUI.html ）
RStudio R编程语言编辑器（RStudio Team，2016）（ www.rstudio.com ）
Mascot Server（Matrix Science， www.matrixscience.com ）
Microsoft Excel

程序

细胞培养
1. 在30°C的固定培养箱中孵育约2天，直到您计划进行实验前4天进行定殖，进行实验，将菌株板从低温恒温器中取出适当的酵母菌株到YPD琼脂平板上。 °C持续数周。＆nbsp;
2. 对于典型的超LOPIT实验，我们推荐培养物720 OD单位的酵母，其等于1.2 600 0.6的培养物。对于这种文化体积，我们使用2 L Erlenmeyer flaksks。
3. 稀释，因为细胞在收获前经历至少2次倍增，以便在方便的时间达到所需的细胞密度。
  注意：新生长条件所需的细胞数量，其为hyperLOPIT方案的下游步骤（每个部分>50μg）产生足够的每个收集的密度梯度级分的蛋白质，应根据经验确定对于目标不是执行hyperLOPIT的实验，较小的培养应该足够，但这应该由研究者确定。
4. 当达到所需的OD <600>时，通过在室温下以3,000 xg 离心5分钟收集细胞并弃去上清液。对于该步骤，使用500ml瓶组件和Avanti离心机中的JLA 10.500转子。
用于裂解的细胞预处理
1. 在还原细胞沉淀中，在500ml瓶组件中，以5个OD单位/ ml的TCEP还原缓冲液离心，在3,000 xg 中离心5分钟，并在室温下无振荡孵育5分钟。 Avanti离心收集细胞并弃去上清液。
2. 在实验中使用的每单位酵母OD单位中加入1μl酶解酶100-T溶液。
  将细胞以20 OD单位/ ml重悬浮于原生质球培养基中，并转移至50 ml Falcon试管中。注意：原生质球介质由与用于细胞培养的培养基相同的成分组成，以保持与培养相同的条件。但是，我们不建议在该步骤中使用条件培养基。培养基应该是新鲜的，包括1.0-1.2 M山梨醇和20 mM Tris-HCl，pH 7.5，以维持渗透压支持和原生质球时的适当pH值。
3. 用等效稀释的原生质体介质在水中冲洗分光光度计后测量OD <600>。取出10μl等份的溶液并在990μl水中稀释注意：通过分光光度法可以方便地监测原生质球转换效率。细胞悬浮液在600 nm处的吸光度与悬浮液中存在的完整细胞数量成正比。球形细胞非常脆弱和敏感将溶液转移到渗透性无支撑溶液中的溶液将仅产生孢子孢子。剩余的完整细胞有助于600nm处的吸光度，表明经历转化的细胞量。
4. 在30°C下孵育10分钟，同时以200 rpm的速度摇动，测量OD 600为1：100稀释度.OD 600应为预处理的10％左右。消化OD <600>，表明约90％的酶解酶消化效率。
  注意：此步骤不应持续超过10分钟，因为在酶解酶存在下孵育时间过长会导致不受控制的细胞裂解。
5. 通过在1,500 x g ，4°C下离心5分钟并在原生质球洗涤介质中重新悬浮，收集细胞而不转移到新管中。
  注意：颗粒可能是粘性的，难以重悬，但不会发生涡旋或吸管，因为脆弱的sporaplasts会有危险的裂解。由于存在裂解的风险，此时不要针对细胞的均匀悬浮。
6. 在1,500 x g ，4°C下收获细胞5分钟并弃去上清液。
可选：核准备
注意：如果没有特别感兴趣的是更大的核分辨率，请跳至第D节。
1. 对于该方案，我们使用大约120个OD单位的原生质球用于核制备，600个OD单位用于主要亚细胞性（2006），随后进行修改。分馏。
  注意：此步骤是可选的，如果其他细胞器特别感兴趣，可以进行这些细胞器的富集而不是核制备，如在之前的两次超LOPIT研究中所进行的（Christoforou 等人等。，2016; Thul 等。，，2017）。
2. 在冰上用20个上下冲程裂解。
  将原生质球重悬于Ficoll裂解缓冲液中并转移至Dounce匀浆器。注意：正如在原始论文（Kizer 等，2006）中，我们使用“紧”Dounce杵来完成裂解的完整性，而不是提倡“松散”杵“重新悬浮”。
3. 70型Ti转子（Beckman Coulter）的平衡位置在3,220℃，4℃下预裂解裂解物10分钟，并将上清液转移到32ml圆底超速离心管中。使用“最大”加速和减速。“斧”4分钟。使用“MAX”加速和减速。
4. 将响应的富含核的沉淀储存在-80℃。
  弃去上清液并用剧烈移液将沉淀重悬于缓冲液NP中。
用于密度梯度离心的裂解
1. 将剩余的600个OD单位的原生质体以每毫升20个OD单位重悬于1×LB中，并转移到氮气蚀容器的腔室中。
2. 使用Wang et al。（2014）修改的方法进行裂解。使用无氧氮气将容器装入500 psi并孵育3分钟。
  注意：气缸内的氮气处于压力状态，如果进气口打开太快，可能会导致500 psi的目标压力超负荷。然后，缓慢打开进气口并密切监测压力表的压力避免发生这种情况的可能性。
3. 通过打开进气阀释放压力，使压力降至300 psi。
4. 以每秒约3滴的速度收集裂解液。
  再孵育3分钟，然后通过打开容器底部的出口将容器排出。注意：当氮从溶液中释放出来时，氮气蚀容器内的压力会下降，相反裂解液的释放速度会更慢。监测裂解液从出口释放的速度，如有必要，再打开端口以保持每秒约3滴的稳定速率。
5. 通过在1,000℃，4℃下离心5分钟来清除聚集体，聚集体和未裂解细胞的裂解物。使上清液在3,000g下进行另一轮离心10分钟。，4°C
粗膜制剂
1. 借助手持折射仪和已知OptiPrep浓度的校准曲线及其折射率测量值，以白利糖度（°Bx）（参见注释1）测量，制备18％（w / v）OptiPrep溶液。
2. 使用连接到四个圆底超速离心管（每管约7.5ml裂解物）的注射器，用1ml LB制备的5ml 18％（w / v）OptiPrep缓冲溶液在每个管的内容物下面。一个钝端的宽口径针。
  注意：
  1. 即使可以将整个裂解液配合在一个圆底离心管中，我们也不建议这样做。如果这样做，超速离心时，全身的蛋白质含量很高这可能会导致对细胞器记忆的损害并影响整个实验的结果。我们发现如果裂解物被描述为发生这种情况，因为它不会发生。
  2. 当使用18％（w / v）OptiPrep缓冲溶液进行垫层时，最小心的是不要将气泡引入缓冲溶液中。如果引入气泡，将导致裂解液与OptiPrep溶液混合，发生这种情况的溶液的超速离心将在两种溶液之间进行两百五十次，从而破坏了溶液的性质在预防之前，发生在管的底部。为了防止这种情况发生，使用注射器上的刻度作为在垫下之前绘制的OptiPrep溶液量的指导。在开始裂解物的底层之前，将针头浸没在注射器中，以便从宽口径针头上释放一滴OptiPrep（以排出任何可能存在的空气）用注射器溶液密切注意液体，用注射器用液体注射器液体注射器密切注意液体，取下针头并丢弃剩余的溶液。
3. 将四个管彼此平衡至10毫克以内，并将管放置在SW32 Ti摆动转子的相对侧。
4. 离心机在28,000rpm下将管2小时（96300 XG ），4℃下选择“MAX”的加速曲线和（即使用一个制动最慢的减速）“9”的减速分布这最小化了在超速离心时形成的膜间期的破坏。
5. 将上清液保存在-20℃进行进一步处理。从管中取出富含胞质溶胶的上清液，在膜间期上方留下1至2cm的上清液，以免干扰粗膜间期。
6. 使用修剪过的1 ml移液器吸头将含有膜的间期取出到单独的管中，注意不要从间期上方或下方取出过多的溶液。
Isopycnic密度梯度超速离心和馏分收集
1. 将收集的膜间期溶液中OptiPrep的浓度调节至16％（w / v），使用手持式折光仪监测浓度（见注1）。
  注意：
  1. 使用600 OD单位的培养物通常在该步骤中产生约2-3ml的粗膜。目的应该是以尽可能小的体积将所需指数的折射率调节到所需的值并制造如果不是这样，可能会导致膜在正确的Optipre浓度下，11.2 ml体积的分离梯度管，预先准备好16％（w / v）被分成多个密度梯度。
  2. 我们发现，制备使用16％（W / V）OptiPrep提供在酵母中的主要亚细胞器的良好分离自发电梯度（图2）。该步骤可以，如果不同的梯度的形状是理想的或者特定的改性亚细胞细胞器是实验的主要焦点。
    
    图2.使用此处描述的方案获得的代表性数据。使用可选的核制备物在 S.cerevisiae 中进行超LOPIT后，二维主成分分析分析12的分辨率在酿酒酵母空间蛋白质组图中分离出三种主要成分的细胞器和蛋白质复合物，包括细胞器的主要亚细胞器。 em> et al。， 2019]）。在每个图中代表每个单个蛋白质组，由hyperLOPIT确定为有色代表性蛋白质的点到地点灰色点负责蛋白质由hyperLOPIT预测的本地化。
2. 准备一个含有16％（w / v）OptiPrep的平衡管，用于填充空白的垂直转子管，该转子管不含任何膜，可用作平衡管。
3. 将两个管放在VTi 65.1转子的相对侧，并在管顶部浮动铝垫片。
4. 拧上转子盖和离心机中以65000转（362900 XG ），在4℃下4小时，选择“MAX”的加速度曲线和“9”（最慢减速的减速分布这有助于最小化在超速离心时形成的对密度梯度的破坏。
5. 从VTi 65.1转子上拆下管子，取下并丢弃塑料塞子。
6. 夹紧蠕动泵。
  准备一台带有弯月面跟踪探头的Labconco Auto-Densiflow蠕动泵，通过将一块约40厘米长的收集管连接到探头上来收集馏分。注意：如果Auto-Densiflow馏分收集器不可用，可以通过刺穿管底部并使梯度馏分从底部和最密集的部分滴出来收集馏分。我们不建议通过从Brandel和Teledyne Isco的高级技术技能和可用技术中吸取来收集馏分，但这些尚未经过测试用于hyperLOPIT。错误，这将导致梯度实验的不同部分的混合。
7. 用蒸馏水冲洗到废液容器中，然后用空气冲洗，用1x LB冲洗，然后用空气冲洗。
8. 将梯度管插入管架并将探头方向设置为“向下”，直到探头找到梯度弯月面，此时探头将停止移动。
9. 将探针设置为“沉积”并从梯度中收集23个级分到1.5ml微量离心管中，其中22个应为0.5ml，一个应为0.2ml。
  将馏分储存在-80°C直至进一步处理。注意：此步骤不是自动化的，因此应按密切监控每个馏分收集的体积。
监控渐变形状
1. 解冻梯度级分并充分涡旋以确保含OptiPrep的级分中的碘克沙醇含量均匀地悬浮在级分中。
2. 使用手持式模拟折光仪确定每个馏分的近似指数。在此步骤中使用大约20μl的每个馏分。
  不要使用1x LB.将得到的折射率乘以稀释系数，得到无界折射率测量。
3. 结果应该是一个轻微的S形曲线，在梯度中间相对平坦，在最后2-3个分数中变得更陡（图3）。
4. 如果通过酶测定监测细胞器分布，请在此处取一份等分试样，然后进行酶测定。
  注意：我们尚未在 S.cerevisiae 中尝试此类方法，但如果需要，可在文献中找到方法。
  
  图3.使用OptiPrep浓度和本协议中详述的密度梯度超速离心参数实现的典型梯度形状。使用Auto-Densiflow馏分收集器收集馏分并按升序编号梯度中最密集的部分。
分数处理
1. 为此添加1/4体积的100％（w / v）TCA，在水中制备并充分涡旋。通过TCA沉淀进一步处理所有级分（包括单独的细胞器制剂和富含胞质溶胶的级分），然后用丙酮洗涤。
2. 在4°C孵育2小时，使每个级分的蛋白质含量从溶液中沉淀出来。
3. 通过在台式微量离心机中在4℃下以最大速度离心10分钟来收获沉淀物。丢弃上清液。
4. 在Diagenode BioRuptor，超声波仪中进行广泛涡旋并进行超声处理（30秒和30秒），直到颗粒完全分解并变成。 br /> 注意：
  1. 如果颗粒没有完全分解，则可能难以在本协议的下游步骤中解决。
  2. 如果没有BioRuptor，可以使用其他超声波仪进行此步骤。
5. 重复离心，丙酮洗涤，超声处理两次;每次丢弃上清液。
6. 弃去上清液，让颗粒在室温下短暂干燥，直至丙酮蒸发（见注2）。
样品重新溶解和蛋白质浓度估计
1. 用广泛的超声处理重新溶解蛋白质再溶解缓冲液中的每个沉淀物。
  注意：在整个蛋白质含量可溶的最小体积中重新溶解。
2. 再添加等份的蛋白质重新溶解缓冲液，对于该步骤，每个沉淀用50μl蛋白质重新溶解缓冲液开始，并通过离心监测馏分中任何沉淀物的存在，如在TCA预处理中那样一旦离心后没有可见颗粒，这表明蛋白质含量已经解决完成。
3. 使用蛋白质浓度估计测定估计每个级分中的蛋白质浓度，优选以96孔板形式。
  注意：
  1. 如果没有推荐的蛋白质检测试剂盒，可以使用其他蛋白质估算试剂，只要它们与100 mM HEPES和0.1％（w / v）SDS相容即可。
  2. 我们建议使用96孔板格式分析，因为高渗实验中的样品量可能非常有限，这样可以保留每个样品的最大量，用于Western印迹和同量异位标记标记。
4. 如果同量异位标签标记，应该是50毫克，允许每个部分额外1微克用于下游蛋白质印迹。如果需要分馏，没有同量异位标记标记，
通过Western印迹监测细胞器分辨率
1. 使用蛋白质印迹监测细胞器分辨率，针对一组针对标记蛋白的抗体，这些蛋白的分辨率是它们所代表的细胞器的特征（见注1）（表1）。
  
  表1.建议的抗体与hyperLOPIT一起使用 S.cerevisiae 。建议的一抗和二抗抗体基于Western印迹，每个泳道使用1μg总蛋白质的SDS-PAGE凝胶进行。
2. 将每种级分（包括核制剂，富含胞质溶胶的级分和密度梯度级分）的量标准化为1μg总蛋白质，并在SDS-PAGE样品缓冲液存在下加热至95℃5分钟。在预制的梯度SDS-PAGE凝胶的单个孔上。
3. 使用mini-PROTEAN II电泳系统和电源组进行此步骤，并在200 V下运行凝胶。使样品在TGS缓冲液中的SDS-PAGE微型凝胶电泳，并使用全长凝胶。
4. 使用Bio-Rad Trans-Blot Turbo装置上的混合分子量程序转移至Trans-Blot Turbo聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。
5. 将膜切割成适当的分子量范围（参见注释3），并将每个条带在封闭溶液中在室温下在旋转混合器上搅拌1小时。
6. 在4°C孵育过夜，在旋转混合器上振荡（建议稀释度见表1）。用适当的一抗探测每个条带，用封闭溶液稀释（见注4）。
7. 第二天，将膜置于室温下，并在TTBS中洗涤三次，每次5分钟。
8. 用在封闭溶液中稀释的适当的辣根过氧化物酶缀合的二抗（参见表1的建议稀释度）在室温下探测1小时。
9. 弃去二抗并在TTBS中洗涤3次，每次10分钟。
10. 继续使用增强的化学发光（ECL）底物检测信号。
11. 用X射线胶片暴露每个膜，直到达到所需的信号水平（参见图4的Western印迹）。
12. 假设已获得合适的产量（参见注释5），如果需要继续使用hyperLOPIT协议，则进入下一部分。
  
  图4.使用本文所述的超LOPIT方案进行的酿酒酵母实验的典型代表性蛋白质印迹，在没有核制备和使用表中描述的抗体进行探测的情况下进行使用Labconco馏分收集器，从第一个和最不稠密的部分，到第二十三个和最密集的部分，按照它们的收集顺序编号。 C“。修改自（Nightingale et al。，2019）。
蛋白质还原，烷基化和消化
1. 对于包括核制备在内的实验，选择核制剂，富含胞质溶胶的部分，并使用等压标记的其余部分来标记密度梯度中的部分。在涉及核制备的实验中，选择手性当使用TMT 10或11-plex标签或具有较低多路复用能力的同量异位标签时，此建议是相同的。
  注意：应根据感兴趣的细胞器的相对富集和其他污染细胞器的相对耗尽来选择级分用于标记，如Western印迹所确定的。在这个Western印迹方案中，我们能够解析最终数据集中的12个亚细胞位置（图2）。精心设计的分馏方案将导致最终空间蛋白质图谱中亚细胞位置的分辨率在Western印迹实验中，因为它们将在密度梯度内离散地分辨。
2. 将每个级分标准化为相同量的蛋白质（50-100μg），并用蛋白质回收缓冲液补足相同的体积（100μl）。
  注意：如果产量不足以使用100μg的每种级分，总蛋白量可能会减少。尽管如此，我们仍然不建议标记<50μg的每种选定的级分。
3. 向每个样品中加入11.1μl在蛋白质分离缓冲液中制备的二硫苏糖醇（DTT）溶液。
4. 在56°C孵育1小时，以减少二硫键。
5. 回到室温，每个样品中加入12.3μl碘乙酰胺（IAA）溶液，在室温下避光孵育1小时。
6. 向每个级分中加入1ml丙酮，短暂涡旋各级分，使蛋白质含量在-20℃下在丙酮中沉淀过夜。
7. 第二天，在台式微量离心机中以4℃以最大速度离心所有沉淀的级分10分钟。
8. 弃去上清液，短暂风干颗粒（见注2）。
9. 通过涡旋将沉淀重悬于87.5μl消化缓冲液中。
10. 用1:20（w / w）蛋白酶：蛋白质比例的胰蛋白酶消化，在37℃下消化16小时。将胰蛋白酶分成间隔1小时的两个等分试样（1:40（w / w）蛋白酶：蛋白质比例），例如消化的最终体积是100μl。
TMT标签（从TMT 10-plex套件用户指南修改）
1. 如果使用不同的同量异位标记化学品，请参阅试剂盒随附的相关标签协议。
2. 第二天，通过在微量离心机中以最大速度离心15分钟，清除任何不溶物质的消化物。
3. 在打开样品瓶之前，将其短暂脉冲离心。让TMT试剂盒平衡至室温。
4. 在每个标签样品瓶中加入41μl乙腈，充分涡旋并溶解5分钟。
5. 将每个分离的标签转移至不同的消化物并在摇动平台上在室温下孵育2小时。
6. 向每个样品中加入8μl5％（v / v）羟胺，在消化缓冲液中制备，并在室温下在振荡平台上孵育30分钟。
7. 向每个样品中加入100μlHPLC级水，并在4°C下孵育1小时。
8. 将样品标记的消化物合并到单个管中，并在10°C的真空离心机中干燥至完成。在-80°C下储存，直到通过固相萃取（SPE）进行样品净化。
通过固相萃取（SPE）进行样品净化（根据以前的出版物修改[Villen and Gygi，2008]）
1. 用1.8ml 100％（v / v）HPLC级乙腈（ACN）平衡Sep-Pak tC18柱。
2. 用600μl平衡缓冲液冲洗。
3. 用1.8毫升脱盐缓冲液1冲洗。
4. 将样品在1ml 0.4％TFA中重新溶解并确保pH <2。为此，使用pH试纸在小等分试样（~10μl）的样品上检查pH。如果pH> 2，则继续加入10％TFA的等分试样。，每次添加后检查pH，直至pH <2 注意：即使在0.4％TFA存在下，来自消化和同量异位标签标记步骤的残留HEPES的缓冲能力也可保持高pH值。确保在加载到SPE柱上之前pH <2，或标记的肽不会绑定到tC 18 材料，而是会丢失。
5. 将解析的肽加载到盒上并允许与包装材料结合。
6. 在1.8毫升脱盐缓冲液中脱盐1。
7. 用180μl脱盐缓冲液2冲洗。
8. 使用1ml洗脱缓冲液从柱中洗脱缓冲液，并取出对应于约5-10μg标记肽的小等分试样。
9. 将样品在10°C的真空离心机中干燥至完成。
通过高pH反相（RP）色谱预分馏
1. 在Waters Acquity UPLC系统上，在质谱分析之前使用高pH反相色谱法对样品进行分级。
2. 通过涡旋混合在100μlRP分辨率缓冲液中重新溶解固相提取的样品，并在台式微量离心机中以最大速度旋转10分钟。
3. 将上清液转移至Acquity自动进样器样品瓶中，置于Waters Acquity UPLC系统的自动进样器中，保持在10°C。
  注意：如果需要，可以使用另一种能够在正常流量下运行的色谱系统。
4. 借助于系统样品以1分钟的间隔收集级分，并使用表2中所示的梯度参数运行。使用光电二极管阵列（PDA）检测器监测样品洗脱，扫描210-400nm的波长。馏分收集器在干冰上冻结完成。
  
  表2.在Waters Acquity UPLC系统上pH值反相超级LOPIT样品预分级时使用的参数整个LC梯度长75分钟。在梯度内，0-10分钟，62每个切换步骤之间的梯度是本表中描述的应该是线性的（用UPLC入口方法软件用“6”表示）。
5. 将干燥级分在真空离心机中在10℃下完成。将干燥的级分在-80℃下储存。
6. 使用收集的色谱数据确定与含肽色谱空间对应的收集馏分。
LC-SPS-MS3样品分析
1. 重悬干燥的样品在0.1％（V / V）在下列方案中的甲酸和池等量：普尔所述第一与所述中间馏分，第二与第二从 - 中间，依此类推，直到所述肽的末端 - 含有洗脱空间。
  注：池的样品以这种方式不仅使更好地利用肽分馏的第二维的（低pH RP耦合在线质谱仪）（张等人，2011），但也将质谱分析时间缩短了一半。
2. 将约1μg的每个合并的级分加载到Dionex Ultimate 3000 RSLC纳米色谱系统的自动进样器中。
  注意事项：基地该测定无论是在这是Western印迹和蛋白质的消化或之前进行该蛋白质的估计，执行肽估计测定以确定的量装入
3. 分析通过使用耦合线到戴安终极3000 RSLC nanoUPLC系统中的轨道阱融合荧光闪烁Tribrid质谱仪120分钟梯度液相色谱 - 质谱法各汇集级分。用LC-SPS-MS3方法获取数据（麦卡利斯特等人，2014）。有关用于LC和MS方法的详细信息，请参阅已采用TMT加上SPS-MS3进行hyperLOPIT研究10-PLEX定量以前的出版物（Christoforou 等。，2016 ;.书尔等人，2017年; ..马尔维等人，2017年）。另外，在不存在的Fusion系列质谱仪，使用适用于质谱仪的LC-MS / MS方法用于分析。
  注意：＆nbsp;
  1. 我们建议使用Thermo Fisher Scientific Fusion系列质谱仪，因为SPS-MS3功能（McAlister 等，2014）提供更高的定量准确度和精确度。 SPS-MS3涉及同时选择多个MS2碎片离子，这些离子源自特定扫描中的靶前体，TMT 10或11重报告离子，相对于MS T的唯一用途。这解放了由靶前体离子产生的TMT报道分子，在没有来自污染物碎片的报告信号起源的情况下，在MS1扫描中共同选择了污染物。可用于这些实验，但它们更容易受到问题的影响（Ting 等。，2011; Wenger 等。，2011）除了通过MS / MS进行碎裂的离子外，共同选择污染前体。将导致实验中定量的总体准确度和精确度降低，其直接读数将在最终的hyperLOPIT空间图中区分细胞器分辨率。
  2. 使用质谱仪分析TMT标记样品并非高分辨率分辨率可能会因为无法分辨同位素N和C标记而排除使用10或11重TMT标签，这将导致报告离子合并（McAlister et al。，，2012），因此，定量不准确。在这种情况下，应使用具有较低多路复用能力的等压标签。
4. 使用与上述步骤O3中使用的相同的质谱分析方法分析在SPE步骤中收集的额外的非分馏样品。这将使得能够表征同量异位素标签标记效率。
  注意：建议对每个超LOPIT实验表征同量异位标记效率，与通过LC-SPS-MS3或其他LC-MS / MS方法分析预分级样品无关。用同量异位标签试剂标记溶素残基的肽N-末端和ε-氨基的效率足够高（即，基本上完全）。实际上，我们观察到使用该方法标记特异性地> 99％。检测同量异位标签浓度，在同量异位标签标记过程中进行修饰，这将导致同量异位标签标记试剂，不可逆侧试剂或不良副反应的分化稳定性这将导致肽的标记不完整，这将导致不准确的PSM水平和整体蛋白质水平定量。这将导致非代表性和减少整体细胞器重新生成最终hyperLOPIT空间映射中的解决方案。

数据分析

使用Proteome Discoverer 2.1版分析质谱数据
1. 使用与内部Mascot服务器连接的Proteome Discoverer 2.1分析原始质谱数据文件。使用规范的 S. Cerevisiae 数据库搜索数据，例如UniProt或SwissProt数据库，在现场备选缺少蛋白质序列信息。从Saccharomyces基因组数据库中下载蛋白质序列数据库（SGD - www.yeastgenome.org 执行分馏样品的搜索。执行分馏样品文件文件的搜索，这是））（Cherry et al。，2012）。整个hyperLOPIT实验质谱运行组的单一结果报告。
2. 对于标记测试搜索，指定TMT（或其他同量异位标记）标记N末端和赖氨酸残基作为动态修饰，但保留所有其他搜索以肽 - 光谱匹配（PSM）水平导出结果文件，并计算相对于理论上可能暴露的所有肽，显示每个同量异位标签修饰的肽的百分比> \ ，所有具有可被标记的赖氨酸ε-氨基的肽，以及未经其他修饰的所有肽N-末端。这给出了对该特定形式的效率的估计使用此方法应该> 99％。
3. 如果使用LC，则执行Mascot搜索，允许肽耐受性为±15 ppm，片段匹配容差为±0.6 Da。对于分级的超LOPIT数据，将每组原始数据文件作为一组分数加载到Proteome Discoverer中，而不是文件。 SPS-MS3。如果在不同的质谱平台上使用另一种LC-MS / MS方法，请使用适合MS1和MS2扫描中使用的质谱分析仪的肽和片段匹配公差。 > et al。，2009）软件中的节点，允许基于其错误发现率过滤肽 - 光谱匹配。
4. 设定蛋氨酸的氧化，并将赖氨酸和N-末端的同量异位标记标记为静态修饰。
5. 对于使用LC-SPS-MS3的分析，在报告离子定量节点中，使用每个单同位素报告基因的m / z周围±2mmu窗口内的质心峰的总和进行定量，并将MS活化顺序设置为MS3。将蛋白质组水平定量设置为对于其他报告分析方法和/或同量异位标签是相等的，将MS激活顺序设置为MS2并相应地调整窗口以总结报道分子的m / z。任何给定蛋白质组的所有定量PSM的中位数，并使用Proteome Discoverer 2.1版中提供的S / N测量选项报告定量。
6. 如果导出到Excel工作簿，请在继续下一部分之前将工作簿转换为CSV格式。
使用MSnbase和pRoloc软件包进行数据分析
1. 使用R编程语言编辑器分析来自Proteome Discoverer的结果文件，例如运行Bioconductor的RStudio（RStudio Team，2016）（Gentleman et al。，2004）pRoloc（Gatto et al ，2014），pRolocGUI（Breckels et al。，2018）和MS nbase软件包（Gatto和Lilley，2012）。对于详尽的分析协议，我们引导读者阅读最近发表的工作Breckels及其同事（Breckels et al。，2016b）。
2. 使用“readMSnSet2（）”函数将原始数据读入R环境语言，其中“ecol”被指定为包含定量数据的列。
3. 使用“filterNA（）”函数过滤实验中包含缺失定量值的蛋白质组。或者，允许一定数量的缺失值进行定量，并以某种方式对主题进行估算。
  注意：缺失值可以设置为零，如先前所执行的（Christoforou 等，2016）或者可以使用其中一个MSnbase包中描述的“Impute（）”方法（Gatto和Lilley，2012）。
4. 标准化每行的量化数据（ i。E. ，蛋白质组），使得总和的比率等于1.使用“normalize（）”函数和“sum”方法。
  注意：MSnbase软件包中提供了其他标准化方法，可用于标准化Proteome Discoverer定量数据，但我们发现“sum”方法对此特定数据分析很有用。
5. 请注意任何群集位置，即维度减少这一事实，例如主成分分析（PCA）或t分布式随机邻域嵌入（t-SNE）（Van Der Maaten和Hinton，2008）从数据。
6. 策划一系列标记蛋白，这些标记蛋白已知定位于酿酒酵母中的亚细胞细胞器。替代方案，使用pRoloc包中提供的标记（使用pRolocmarkers（“scer”））。 /> 当使用有监督的机器学习监督学习对蛋白质类进行细胞分类时，蛋白质只能被归类为类别exe之一。注意：确保包含预期在实验中单独解析的所有细胞器的标记注释。在那里，如果针对特定的细胞器或一组细胞器发出注释，它将导致来自该细胞器或一组细胞器的蛋白质被包含到另一个细胞器中，该细胞器与其他受试者类似地解析在实验中。最终结果不仅是最终数据集中缺乏有问题的细胞器，而且还没有将任何蛋白质分类到该细胞器。
7. 将标记注释附加到MS n Set并观察亚细胞器水平数据内的分辨率。
8. （可选）使用pRoloc中的“addGOAnnotation（）”函数执行自动蛋白质标记注释，用户可以在其中添加基因本体论（GO）（Ashburner et al。，2000; The Gene Ontology Consortium，2017 ）使用pRolocgui软件包可以观察到在该分析后单独解析的GO注释簇的分辨率。这是来自GO名称空间的GO，用于基于共同的分子功能，生物过程或细胞组分搜索蛋白质的聚类。用于增加用于将未知定位的蛋白质分类为亚细胞器的标记蛋白质数据。
9. 使用二元分类器进行分类，将未知定位的蛋白质分类为预定义的细胞器类别之一。这可能涉及使用监督机器学习方法，例如支持向量机（SVM）（Vapnik，1995）。新的方法可以用于多个先前的hyperLOPIT研究（Christoforou et al。，2016; Thul et al。，2017）。可以使用更新的方法，包括半监督机器学习方法（“ phenoDisco ”）（Breckels et al。，2013），它可以预测新蛋白质簇的存在，而不需要先验知识除了高度标记的标记蛋白列表之外，替代方案，变体方法可用，质量较低，辅助数据可提高分类分类性能（Breckels et al。，2016a）。可以使用新的概率分类方法，该方法基于贝叶斯统计（Crook et al。， 2018）并且现在可以在pRoloc包中使用。
10. 在分类为细胞器后观察所有蛋白质的分辨率。
11. 在逐个细胞器的基础上输出所有分类数据，并按降序对所有归类为给定细胞器的蛋白质的SVM分数进行分类。
12. 允许在hyperLOPIT和低通量研究预测的蛋白质定位之间进行一定的允许百分比的假性解剖蛋白质降解。对于给定的细胞器，基于识字％或1％）。
  注意：由于这种机器学习方法的性质，数据集中的所有蛋白质将被分类到在细胞器标记列表训练数据中预先定义的单个位置。这不能忠实地重述体内的内容其中蛋白质可以定位于多个亚细胞器或多个细胞器之间的交通。
13. 参见图2，来自在参考文献中进行的单个生物学重复的代表性数据（Nightingale等人，等人在该阈值下对每个细胞器设定SVM得分截止值，并使用所得数据作为最终空间蛋白质组图谱。 >，2019），没有任何蛋白质分类。此外，参见Bioconductor（Gentleman et al。，2004）pRolocdata（Gatto et al。，2014）包（版本1.19） .4以后）和 https://proteome.shinyapps.io/yeast2018/ （Nightingale et al。，2019），包含来自四个生物重复实验的数据的完全处理数据集，在有和没有可选的核制备的情况下进行，可以进行交互式探索。
14. 通过hyperloPIT分析以低通量方式预测并使用正交方法分析已通过蛋白质定位验证的蛋白质子集。或密度梯度蛋白共分馏实验。

笔记

要准备OptiPrep浓度和折射率，请添加IWS。要减少，请添加1x LB.
在室温下干燥5分钟应使大部分丙酮蒸发。如果蛋白质颗粒开始从白色变为无色，则很难分辨。它开始过度干燥。
基于其报道的分子量将膜（后印迹）切成适当分子量范围的条带，并用单一抗体探测每个条带。我们可以探测表1中仅运行两个SDS-PAGE凝胶的所有标记物。
不要再使用辣根过氧化物酶偶联的二抗。在封闭液中稀释的一抗可在使用后储存在-20°C，并可重复使用至少5次，没有明显的信号丢失。
如果需要获得足够高的蛋白质产量，可以在标记之前合并相邻级分的蛋白质含量。如果在同一时间内多次进行合并，则可以区分分辨能力实验中的整体细胞器分辨率将受到影响。

食谱

细胞培养
1. 10x酵母氮碱（YNB）
  在1L水中溶解6.7g不含氨基酸的酵母氮碱并过滤灭菌
2. 10倍完全补充剂混合物
  0.03％（w / v）异亮氨酸
  0.15％（w / v）缬氨酸
  0.04％（w / v）腺嘌呤半硫酸盐
  0.02％（w / v）精氨酸
  0.02％（w / v）组氨酸
  0.1％（w / v）亮氨酸
  0.03％（w / v）赖氨酸
  0.02％（w / v）蛋氨酸
  0.05％（w / v）苯丙氨酸
  0.2％（w / v）苏氨酸
  0.04％（w / v）色氨酸
  0.03％（w / v）酪氨酸
  0.02％（w / v）尿嘧啶
  将所有组分溶解在水中并过滤灭菌
3. 40％（w / v）葡萄糖
  将40g葡萄糖溶解在100ml水中并通过高压灭菌消毒
4. 含2％葡萄糖的合成培养基（每个实验1.2L）
  混合120ml 10x YNB，60ml 40％（w / v）葡萄糖和120ml 10x完全补充混合物
  用无菌水补足至1.2L
5. YPD琼脂培养基
  1. 在190毫升水中悬浮4克Bacto琼脂，4克Bacto蛋白胨和2克Bacto酵母提取物
  2. 通过高压灭菌消毒
  3. 在仍然熔化的同时，加入10毫升40％（w / v）葡萄糖并倒入琼脂平板（每块约20毫升）
细胞预处理和成球细胞生成
1. TCEP还原缓冲液（每个实验150毫升）
  20mM Tris-HCl，pH 7.5
  10 mM三 - （2-羧乙基）膦（TCEP）
2. 原生质球培养基（每个实验40毫升）
  由与合成培养基相同的成分组成，但添加20 mM Tris-HCl，pH 7.5和1.2 M山梨糖醇
  每50 ml缓冲液中新鲜补充1片完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂
3. Zymolyase 100-T溶液（每个实验700μl）
  在原生质球培养基中制备的5μg/ ml酶解酶100-T 为实验中使用的每个酵母OD单位准备1μl
4. 原生质球洗涤培养基（每个实验150毫升）
  由与原生质球介质相同的成分组成，具有Tris-HCl缓冲液的发射每50 ml缓冲液中新鲜补充1片完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂
（可选）核准备＆nbsp;
1. Ficoll裂解缓冲液（Kizer et al。，2006）（每个实验15 ml）
  18％（w / v）Ficoll PM-400
  20 mM磷酸氢二钾，pH 6.8
  1 mM氯化镁
  0.5 mM EDTA
  每10 ml缓冲液新鲜补充1片完全不含EDTA的无蛋白酶抑制剂片剂
2. 缓冲液NP（Kizer 等人，2006）（每个实验300μl）
  340 mM蔗糖
  20mM Tris-HCl，pH 7.4
  50 mM氯化钾
  5 mM氯化镁
  每10 ml缓冲液中新鲜补充1片完全不含EDTA的无蛋白酶抑制剂片剂
细胞裂解
1. 1x LB（每次实验75 ml）
  250毫克蔗糖
  50 mM醋酸钾
  2 mM醋酸镁
  1 mM EDTA，pH 8.0
  每50 ml缓冲液中新鲜补充1片完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂
2. 6x LB（每次实验4 ml）
  300 mM醋酸钾
  12 mM醋酸镁
  6 mM EDTA，pH 8.0
密度梯度离心
1. 碘克沙醇工作溶液（IWS）（每个实验18毫升）
  将3 ml 6x LB与15 ml OptiPrep混合
2. 18％（w / v）OptiPrep溶液（每个实验25毫升）
  1. 将9 ml IWS与16 ml 1x LB混合
  2. 双折检查折射率与已知折射率的OptiPrep浓度的标准曲线
  3. 根据需要进行调整，使用IWS增加折射率和1 x LB以降低折射率
3. 16％OptiPrep溶液（每个实验20毫升）
  1. 将6.4ml IWS与13.6ml 1x LB混合
  2. 双重检查折射率与已知折射率的OptiPrep浓度的标准曲线
  3. 根据需要进行调整，使用IWS增加折射率和1x LB以降低折射率
馏分处理，消化和TMT标记
1. 蛋白质分辨率缓冲液（每个实验20毫升）
  100mM HEPES-NaOH，pH 8.5
  0.1％（w / v）SDS
2. 消化缓冲液（每次实验2毫升）
  100mM HEPES-NaOH，pH 8.5
3. 5％（v / v）羟胺（每个实验120μl）
  将108μl消化缓冲液与12μl50％（w / v）羟胺溶液混合
  使用前准备好
4. TTBS（每个实验1升）
  25mM Tris-HCl，pH 7.6
  150 mM NaCl
  0.1％（v / v）吐温-20
5. 封闭溶液（每种抗体使用100毫升）
  用TTBS制备的5％（w / v）脱脂奶粉
6. 二硫苏糖醇（DTT）溶液
  在蛋白质再溶解缓冲液中制备100mM DL-二硫苏糖醇
7. 碘乙酰胺（IAA）溶液
  在蛋白质再溶解缓冲液中制备的250mM碘乙酰胺
通过固相萃取（SPE）进行样品净化
1. 平衡缓冲液（每个实验600μl）
  50％（v / v）乙腈
  0.5％（v / v）乙酸
2. 脱盐缓冲液1（每个实验1.8毫升）
  0.1％（v / v）三氟乙酸
3. 脱盐缓冲液2（每个实验180μl）
  0.5％（v / v）乙酸
4. 洗脱缓冲液（每个实验1毫升）
  80％（v / v）乙腈
  0.5％（v / v）乙酸
高pH反相色谱
1. RP流动相原液（每个实验100毫升）
  200 mM甲酸铵，pH 10.0。用氢氧化铵调节pH。
2. RP流动相A（每个实验500毫升）
  20 mM甲酸铵，pH 10.0
  通过将50ml RP流动相储备溶液与450ml HPLC级水混合来制备
  如有必要，用氢氧化铵重新调节至pH 10.0
3. RP流动相B（每个实验500毫升）
  20 mM甲酸铵，pH 10.0
  80％（v / v）乙腈
  通过将50ml RP流动相储备溶液与400ml HPLC级ACN和50ml HPLC级水混合来制备
  不要调节pH值
4. RP重新溶解缓冲液（每个实验100μl）
  95％（v / v）RP流动相A
  5％（v / v）RP流动相B.

致谢

我们承认Owen Vennard的批判性阅读，读取这个交易所，并且大于a到交流，而不是比从那里开始，而不是比从那里开始。。

竞争利益

没有利益冲突或竞争利益。

参考

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Ashburner，M.，Ball，CA，Blake，JA，Botstein，D.，Butler，H.，Cherry，JM，Davis，AP，Dolinski，K.，Dwight，SS，Eppig，JT，Harris，MA，Hill， DP，Issel-Tarver，L.，Kasarskis，A.，Lewis，S.，Matese，JC，Richardson，JE，Ringwald，M.，Rubin，GM and Sherlock，G。（2000）。基因本体：生物学统一的工具。基因本体联盟。 Nat Genet 25（1）：25-29。
Brachmann，CB，Davies，A.，Cost，GJ，Caputo，E.，Li，J.，Hieter，P。和Boeke，JD（1998）。来自酿酒酵母 S288C的设计者缺失菌株：用于PCR介导的基因破坏和其他应用的一组有用的菌株和质粒。 > Yeast 14（2）：115-13。
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