材料和试剂

15毫升锥形管（康宁，目录号：352196）
带0.22μm膜的瓶顶真空过滤器（Corning，目录号：431161）
塑料储存瓶（康宁，目录号：430281）
70-μm无菌细胞过滤器（BD，目录号：340633）
1毫升注射器（Braun，目录号：9161406V）
18-G插管（Braun，目录号：4667123）
培养皿94/16 mm（Greiner Bio-one，目录号：633181）
未处理的6孔板（Nunc TM ，目录号：150239）
C57BL / 6小鼠（6-10周龄）
PBS，pH 7.2（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：20012019）
EDTA储备溶液（例如，0.5 M，pH 8.0）
溶血缓冲液（自制或商业，例如，Morphisto，目录号：12146）
台盼蓝溶液0.4％（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
RPMI 1640培养基，无谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：31870025）
胎牛血清（推荐不同批次的测试）
硫酸庆大霉素50 mg / ml水溶液（Lonza，目录号：BE02-012E）
青霉素 - 链霉素（10,000 U / ml）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：15140122）
丙酮酸钠（100 mM）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：11360070）
GlutaMAX TM 补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：35050038）
来自J558L细胞系的条件培养基转染小鼠GM-CSF cDNA作为GM-CSF的来源（Zal et al。，1994; Stockinger et al。，1996; Rayasam ，2015）
ESGRO Complete Accutase（默克，目录号：SF006）
EGTA储备溶液（例如，0.5 M，pH 8.0）
UltraComp eBeadsTM补偿珠（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：01-2222-41）
Zombie Violet Fixable Viability Kit（BioLegend，目录号：423113）
FACS抗体（如表2所示）
BAL缓冲液（见食谱）
完全中等（见食谱）
AM培养基（见食谱）
支队介质（见食谱）

设备

移液器
小鼠解剖工具（剪刀，镊子）
水浴温度设定为37°C
用于旋转锥形管的冷冻台式离心机
血细胞计数器（罗斯，目录号：T729.1）
培养箱（37°C，5％CO 2 ）
逆显微镜

程序

通过支气管肺泡灌洗（BAL）收获肺泡巨噬细胞
1. 对于每只小鼠，准备一个装有3毫升完全培养基的15毫升锥形管（见食谱）。
2. 在整个过程中保持温暖。预热BAL缓冲液（见食谱）在37°C水浴中。
3. 通过颈椎脱位使小鼠安乐死而不破坏颈静脉或气管，以避免AM暴露于CO 2 或异氟烷，这可能影响AM的功能特性。
4. 避免切割或破坏血管。
  使用解剖工具，去除皮肤，胸腔和肌肉，露出肺部和气管。注意：由于手术暴露弓箭的方法已经在本期刊中发表过，读者可以从协议中获取指导（Han和Ziegler，2013; Tibbitt和Coquet，2016; Jhingran > et al。，2016; Sun et al。，2017）。
5. 气管朝下的部分（远离实验者）应保持完整，不要穿过整个气管。＆nbsp;
6. 注意不要损伤肺组织。注意不要损伤肺部5毫米深的气管朝向肺部。
7. 将装有1 ml温热BAL缓冲液的1 ml注射器连接到插入的插管上。＆nbsp;
8. 注射1 ml缓冲液，同时用另一只手固定套管位置。＆nbsp;
9. 可以回收大约800-900μl。观察到压力不应该太高，否则肺泡会破裂，BAL液会流失。注射和采集时，肺部明显膨胀和放气。＆nbsp;
10. 将收集的BAL液通过70μm细胞过滤器过滤到15ml管中，其中含有来自步骤A1的3ml完全培养基。＆nbsp;
11. 每次用新鲜的温热BAL缓冲液重复步骤A6-A10 9次。将细胞合并到相同的15ml管中。
12. 细胞沉淀应为白色。红色/粉红色指示血液在BAL期间意外收集。通过在300 x x x 5 ，4°C下离心5分钟收集细胞。
13. 用完全培养基填充试管以停止裂解并如前所述通过离心收集细胞。除去上清液。细胞沉淀的颜色为白色。在室温下加入1ml溶血缓冲液孵育2分钟以裂解残留的红细胞。
14. 仅计数活的（锥虫蓝色阴性）细胞。将细胞沉淀重悬于500μlBAL缓冲液中，并用台盼蓝染色后用血细胞计数器室取样以排除死细胞。
15. 计算每个BAL的总细胞数。通常，每个成年6-8周的野生型小鼠可以回收5×10 5-7×10 5个活细胞。使用预热BAL缓冲液，含有2 mM EDTA和0.5％血清的PBS。＆nbsp;
16. 进行细胞染色和流式细胞术分析或体外培养。
肺泡巨噬细胞的流式细胞术分析
1. 用TruStain fcX阻断细胞上的非特异性结合位点，并在4℃，黑暗中用200μl冷PBS（不含FBS）中的Zombie Violet同时染色15分钟（参见表2）。
2. 用冷BAL缓冲液洗涤细胞，在4℃下以300×g离心5分钟洗涤细胞。＆nbsp;
3. 根据表2，在4℃，黑暗中使用BAL缓冲液以100μl/ 1百万细胞的体积染色细胞30分钟。
  
  表2.用于染色BAL AM的FACS试剂
4. 为每种抗体缀合物制备补偿珠。
5. 用BAL缓冲液洗涤细胞，重悬于200μlBAL缓冲液中进行记录。
6. 在获得补偿珠后通过流式细胞术记录细胞。对于SiglecF和CD11c，AM是双阳性的（图2A-2C），并且> 98％存活（图2D）。
  
  图2. BAL AM的FACS分析。 A.排除双峰，死细胞的简单门控策略.AM是SiglecF-和CD11c-阳性.BC。用预热的BAL缓冲液收集BAL细胞每个符号表示1只小鼠。通常，> 95％的BAL细胞是AM.D.通过用EDTA染色评估的BAL单线态细胞的活力分析。
肺泡巨噬细胞的培养
1. 如前所述通过离心收集细胞。
2. 在3ml预热的AM培养基中，每孔3×10 5 -4×10 5个细胞未处理的6孔板（参见配方）。
  注意：通常，3x10 5 -4 x 10 5
3. 将庆大霉素添加到AM培养物中（1：1,000）。
  注意：第一次更换介质后会发出庆大霉素。
4. 在37°C孵育，5％CO 2 。＆nbsp;
5. 用新鲜培养基替换培养上清液6-18小时后丢弃上清液。＆nbsp;
注意：细胞将在第一次平板培养后几小时内完全摄取，我们不会在第一次培养基更换时将细胞保持悬浮状态。但是，对于中间培养基更换，细胞也会被收集，因为AM培养由粘附细胞和悬浮细胞组成（参见注释部分）。
1. 每2天换一次培养基，直到细胞培养物达到融合。
2. 向贴壁细胞中加入2 ml温热的AM培养基，以防止干涸细胞。使用300 离心收集悬浮细胞。 em> 5分钟。将沉淀的细胞重悬于1 ml温热的AM培养基中，并与贴壁细胞结合。
  注意：新收获的初级AM将每7-10天翻一番（Soucie 等。，，2016）。如果大部分AM出现拉伸（纺锤状）然而，增殖能力将是有限的，它可能适用于开始新的培养（参见图3的早期AM培养的示例图）。）并且激活，增加条件培养基的量或添加重组GM-CSF可能有帮助; em>
  
  图3.接种细胞后第一天AM培养的代表性图像。 A. AM培养，主要呈圆形细胞，在接种后第1天部分漂浮并部分粘附.B。相同箭头不分裂细胞，放大100倍，如第2天的培养物（A）所示.C。与第4天的（A）相同的培养物.D。
3. 为了从融合孔中分离细胞，将悬浮细胞收集到15ml管中。＆nbsp;
4. 将750μl脱离培养基（参见配方）加入6孔板（或3 ml至94 mm培养皿）的1孔中，并在37°C下孵育10-30分钟。
  培养基中破裂的细胞可能会出现野心注意：当破裂过于严苛的脱离过程时，AM非常容易和倾向。因此，使用未经处理的塑料制品和适当的分离介质是很重要的（参见食谱）。 AM的激活状态和增殖能力。＆nbsp;
5. 通过轻轻地在塑料底部移液来支持细胞分离以避免细胞损伤（参见注释）。
6. 将细胞悬浮于细胞中，将细胞以300μL离心细胞培养5分钟。＆nbsp;
7. 仅计数活的（锥虫蓝色阴性）细胞。将细胞沉淀重悬于1ml温热的AM培养基中，并用台盼蓝染色后用血细胞计数器室取样以排除死细胞。
8. 如果细胞数加倍，加入5ml温热的AM培养基并分成6孔板的2个孔（或对应于2×94mm培养皿）。通常，接种的细胞数保持在上述值附近。在步骤C2的说明中。
  注意：早期，我们可以证明AM培养至少传代10代（Soucie 等。，2016）。 AM培养物甚至超过20代仍然增殖，没有增殖能力下降的迹象。

数据分析

使用激光在用于tessa的BD LSR上记录染色的细胞并使用激光，对其进行分析，仅使用血细胞计数器进行分析，仅涉及台盼染色的细胞。如图2A所示进行门控。为了测试三组平均值之间的统计学显着差异（图1），使用GraphPad Prisma进行单向ANOVA和Tukey多重比较检验。 7.没有排除任何数据点。

笔记

悬浮液AM的重新接种将导致部分细胞附着在新孔中，而另一部分保持悬浮状态。注意表达培养基时不要丢失悬浮细胞这将减少增殖细胞的数量并减缓培养物的扩增。
如果细胞不易分离，收集含有细胞的培养基并进行另一轮抑制，当细胞没有脱落，细胞悬浮液过度上下时，这可能会影响培养的活力;晚期传代细胞比早期传代培养（最多30分钟）需要更短的孵育时间（约5分钟）。＆nbsp;
通过在各种量的条件培养基（例如，1,2,5,10％在完全培养基中）测试AM的生长，在每批制备后滴定条件培养基的百分比。在我们的批次中，我们通常使用1％至3％的条件培养基稀释成完全培养基（例如，100μl，10 ml），这大致相当于2-5 ng / ml纯化的重组小鼠-CSF。
较低的GM-CSF浓度可能已足够，但测试不够。
我们成功地用20 ng / ml重组GM-CSF（Peprotech）替换条件培养基用于长期培养。

食谱

BAL缓冲区
PBS
2mM EDTA（从0.5M EDTA储备溶液中稀释1：250）
0.5％胎牛血清（FBS）
使用真空过滤进行无菌过滤，并保持在4°C直至使用
完整媒体
RPMI 1640
1x GlutaMAX
1x丙酮酸
1x青霉素/链霉素
10％FBS
使用真空过滤进行无菌过滤，并保持在4°C直至使用
AM培养基
补充含有1-5％条件培养基的完全培养基，含有小鼠GM-CSF（需要滴定）
使用前在水浴中预热至37°C
支队媒体
ESGRO完成Accutase
1mM EGTA（从0.5M EGTA储备溶液中稀释1：500）
等分并在-20°C冷冻。使用前将水浴中的预热温度升至37°C

致谢

我们感谢Stephanie Vargas Aguilar和Sethuraman对手稿，Philippe Pierre的J558L细胞以及Max-Delbrück-Centrum的流式细胞术和动物护理功能的技术讨论和有益评论国家研究所德拉桑特等德拉RECHERCHE MEDICALE，中心法国国家科学研究和艾克斯 - 马赛大学的CIML和法新社国立德拉RECHERCHE（ANR-11-BSV3-0026补助MH Sieweke和ANR-17 -CE15-0007-01），国家癌症研究所（InCA13-10 / 405 / AB-LC-HS），RechercheMédicale基金会（DEQ.20110421320）和欧盟的欧洲研究理事会（ERC） K. Molawi得到了人类前沿科学计划长期奖学金和StiftungCharité，L。Geiersdottir基金会的支持，地平线2020研究和创新计划（授权协议编号695093 MacAge）。 M.H. Sieweke是柏林健康研究所 - 爱因斯坦访问MDC的人和德累斯顿工业大学的Alexander von Humboldt教授。

竞争利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

道德

经LandesamtfürGesundheitund Soziales批准后，根据德国动物福利立法进行畜牧业和老鼠工作（在柏林工作，遵循委员会机构动物护理和使用委员会的指导方针） Medizin）并经Landesdirektion Sachsen批准（在德累斯顿工作）。

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