材料和试剂

15毫升管（TPP，目录号：91015）
50毫升管（日立，目录号：S307904A）
1.5毫升管（Simport，目录号：T332-5S）
Millex-GV注射器过滤器，0.22μm，PVDF，33 mm（Merck，目录号：SLGV033RB）
Millex-HV注射器过滤器，0.45μm，PVDF，33 mm（默克，目录号：SLHV033RS）
10毫升注射器（Terumo，目录号：SS-10SZ）
P200 Tip（QSP，目录号：110RL-NEW）
P1000 Tip（Rikaken，目录号：RST-4810BR）
5毫升移液器（Nunc，目录号：170355N）
10毫升移液器（Nunc，目录号：170356N）
吸气移液器（康宁，目录号：357558）
10厘米培养皿（TPP，目录号：93100）
PCR管（FastGene，目录号：FG-0028DC / SE）
35毫米培养皿，未经处理（Iwaki，目录号：1000-035）
精细玻璃移液管（在实验室中制备，由玻璃管制成，ERMA，目录号：05-791-0）
Amicon Ultra-4,100 kDa（默克，产品目录号：UFC810024）
C57BL / 6N雄性小鼠（日本SLC）
B6D2F1雌性小鼠（日本SLC）
ICR雌性小鼠（日本SLC）
293T cell（Clontech，目录号：632180）
重组AAV载体质粒（用于您的敲入盒，侧翼为同源臂，朝向您感兴趣的基因）
pAAM-MCS2（重组AAV载体骨架，来自Steve Jackson的礼物，Addgene，Addgene质粒编号：46954）
pDGM6（来自David Russell的礼物，Addgene，Addgene质粒编号：110660）
Cas9蛋白（IDT，目录号：1074182）
crRNA（IDT，AltR等级，适用于您的gRNA序列）
tracrRNA（IDT，目录号：1072533）
DMEM（SIGMA，目录号：D5796-500ML）
FBS（Gibco，目录号：10437-028）
L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素溶液（SIGMA，目录号：G1146-100ML）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％），酚红（Thermo，目录号：25300-120）
蒸馏水（Wako，目录号：043-16785）
BES（SIGMA，目录号：B4554）
NaCl（SIGMA，目录号：28-2270-5）
Na 2 HPO 4 （Wako，目录号：197-02865）
NaOH（Wako，目录号：198-13765）
CaCl 2 ·2H 2 O（Wako，目录号：031-00435）
AAVpro纯化试剂盒（所有血清型）（Takara，目录号：6666）（该试剂盒含有AAV提取液A加，AAV提取液B，Cryonase冷活性核酸酶，沉淀剂A和沉淀剂B）
EDTA-2Na·2H 2 O（SIGMA，目录号：09-1420-5）
10x D-PBS（ - ）（KCl 0.2％w / v，KH 2 PO 4 0.2％w / v，NaCl 8.0％w / v，Na 2 HPO 4 1.15％w / v，pH 7.1-7.7）（Wako，目录号：048-29805）
M2培养基（Merck Millipore，目录号：MR-015P-5D）
KSOM（Merck Millipore，产品目录号：MR-020P-5D）
矿物油（SIGMA，目录号：M8410-1L）
MEM-EAA（Gibco，目录号：11130-051）
MEM-NEAA（Gibco，目录号：11140-050）
透明质酸酶（SIGMA，目录号：H4272-30MG）
Opti-MEM I medium（Gibco，目录号：31985-062）
怀孕母马血清促性腺激素（PMSG）（Aska药房）
人绒毛膜促性腺激素（hCG）（Aska药房）
1x PBS（见食谱）
DMEM补充10％FBS（见食谱）
2x BBS（见食谱）
150 mM Na 2 HPO 4 （见食谱）
2.5 M CaCl 2 （见食谱）
0.5 M EDTA（pH 8.0）（见食谱）
KSOM-AA培养基（见食谱）

设备

P20移液器（GILSON，目录号：F123600）
P200移液器（GILSON，目录号：F123601）
P1000移液器（GILSON，目录号：F123602）
37.0°C浴槽（实验室装甲，目录号：M714）
离心机（TOMY，目录号：AX-310）
离心机（HITACHI，目录号：CR21GII）
热循环仪（Takara，目录号：TP350）
Electroporator（BEX，目录号：GEB15）
1 mm间隙电极（BEX，目录号：LF501PT1-10）
立体显微镜（尼康，型号：SMZ1000）
显微镜用热板（TOKAI HIT，型号：TP-SMZSL）
麻醉蒸发器（Muromachi Kikai，型号：MK-A110）
CO 2 培养箱（Wakenyaku，型号：9300E）
-80°C冰箱（松下，型号：MDF-U700VX-PJ）

程序

AAV载体质粒构建
1. 设计您的AAV载体质粒并通过常规分子生物学技术构建它（Green et al。，2012; Behringer et al。，2003）。将AAV载体的空主链pAAV-MCS2保藏于Addgene。
2. 将侧翼为5'和3'同源臂的敲入盒插入AAV反向末端重复序列（ITR）之间的目的基因中。我们建议每侧300-1,000 bp同源臂，但100 bp同源臂仍然足以进行敲入。
注意：AAV基因组大小（两端ITR之间的序列长度）应小于4.8 kb。
AAV载体的制备，提取和纯化
第0天：
1. 种子4.0-4.5×10 6个 293T细胞/ 10cm培养皿，其中10ml DMEM补充有10％FBS。准备8道菜。
2. 在37.0℃，10％CO 2 培养箱中孵育（或者5％培养箱，或者）。
第1天：
1. 将无菌蒸馏水，2.5M CaCl 2，，2×BBS在37.0℃浴中孵育30-60分钟。短暂地涡旋。
2. 将80μlAAV质粒（1 mg / ml）和200μldDGM6（1 mg / ml）加入15 ml管中的3,320μl无菌蒸馏水中（10μlAAV质粒，25μlpDGM6,415μl无菌蒸馏水，10μl） cm碟转染，分别）。短暂地涡旋。
3. 添加400μl2.5MCaCl 2， 2 溶液（每10cm皿转染50μl）到15ml含有淤泥的质粒中。立即涡旋10秒。
4. 涡旋后，立即加入4ml 2x BBS（500μl用于10cm培养皿转染），然后剧烈摇动15ml管。或者，在连续涡旋下将2x BBS加入15ml管中。
5. 在室温下孵育20分钟。
6. 向每个10cm培养皿中加入1ml转染溶液（在方法B第1天制备：步骤1至5）。
7. 在37.0°C，3％CO 2 培养箱中孵育（或者5％培养箱，或者）。
第2天：
1. 吸出含有转染溶液的培养基，加入5ml含有10％FBS的DMEM和5ml移液管。
2. 孵育于37.0°C，10％CO 2 培养箱（或5％培养箱，或者），直至第4天。
第4天：
1. 加入x1 / 80体积的0.5M EDTA（pH8.0）（62.5μl，每10cm培养皿加入5ml培养基）。
2. 在室温下孵育10分钟。孵育后细胞将从培养皿中分离出来。
3. 用10ml移液管将293T细胞和培养基收集到50ml管中。
4. 在4℃，1,700-2,000 x g 离心10分钟。
5. 吸出上清液。
6. 在4℃，1,700-2,000 x g 离心1分钟以收集残余培养基。
7. 完全吸出上清液。
8. 涡旋50ml管并解离细胞沉淀。
9. 加入4ml AAV提取溶液A plus（每10cm培养皿转染0.5ml）。
10. 涡旋15秒。
11. 在室温下孵育5分钟。
12. 再次涡旋15秒。
13. 在室温下孵育另外5分钟。
14. 再次涡旋15秒。
15. 在4℃，9,000 x g 离心50ml管，10分钟。
16. 用P1000尖端移液管将上清液转移到新鲜的50ml管中。
17. 加入400μlAAV提取液B（10％体积的AAV提取液A加），轻轻混匀。
18. 加入40μl冷冻酶冷活性核酸酶（1％体积的AAV提取液A加），轻轻混匀。
19. 在37.0°C孵育60分钟。
20. 加入400μl沉淀剂A（10％体积的AAV提取液A加）。
21. 涡旋10秒。
22. 在37.0°C孵育30分钟。
23. 涡旋10秒。
24. 加入200μl沉淀剂B（5％体积的AAV提取液A加）。
25. 涡旋10秒。
26. 在4℃下离心，9,000 x g ，20分钟。
27. 用P1000尖端移液管将上清液转移到新鲜的50ml管中。
28. 再次在4℃，9,000 x g 离心20分钟。
29. 用P1000尖端移液管将上清液转移到6-10cm的培养皿中（可能难以用10ml注射器直接从50ml管中吸出上清液）。
30. 用10ml注射器吸出上清液，用0.45μmPVDF过滤器将其滤入15ml管中。
31. 将过滤的上清液转移到Amicon Ultra-4,100kDa中。
32. 在15℃下离心，2,000 x g ，5分钟。
33. 弃去流过物，在过滤器单元上加入4ml 1x PBS，并在15℃，2,000 x g 离心5分钟。
34. 重复上一次超滤步骤，共7次。
35. 用P200移液管将AAV载体溶液收集到1.5ml管中。将回收大约100-120μl的病毒载体悬浮液。
36. 用1x PBS稀释AAV载体溶液至200μl，并在1.5ml管中分配20μl等分试样。
37. 将AAV载体溶液储存在-80°C。
AAV载体滴度的估算
通过qPCR估计AAV载体滴度（Lock et al。，2014; Werling et al。，2015）。
原核小鼠胚胎的制备
如前所述制备原核阶段小鼠胚胎（Behringer et al。，2003）。用精细玻璃移液管转移胚胎。
1. 在15：00-18：00 PM通过腹膜内注射将5IU /小鼠PMSG施用于B6D2F1雌性小鼠。
2. PMSG给药48小时后，通过腹膜内注射将5IU /小鼠hCG给予B6D2F1雌性小鼠。
3. 在hCG施用后立即将雌性小鼠与C57BL / 6N雄性小鼠交配。
4. 注射hCG后14-16小时，从输卵管中取出受精卵，并通过短期培养和移取含0.1％透明质酸酶的M2培养基去除周围的卵丘细胞。
5. 将受精卵在KSOM-AA培养基中于37.0℃在5％CO 2 的空气气氛中孵育1-4小时。
6. 收集双原核受精卵。
Cas9 RNP溶液的制备
1. 用Opti-MEM I培养基以100μM重构冻干的crRNA和示踪RNA。
2. 在PCR管中混合10μlcrRNA和等量的tracrRNA。
3. 在PCR热循环仪中使用tracrRNA进行退火crRNA。将其加热95°C 5分钟，然后以5°C / min冷却至25°C，然后保持在4°C。
4. 在Opti-MEM I培养基中稀释100ng /μl（0.61μM）Cas9蛋白，200ng /μl（2.94μM）退火的gRNA复合物（crRNA + tracrRNA）。准备足够数量的Cas9 RNP溶液;在电穿孔前洗涤20-30μl胚胎，在电穿孔时洗涤5μl/ run。
5. 将Cas9 RNP溶液保持在冰上直至电穿孔。
含有敲入供体AAV载体的胚胎培养基的制备
1. 用KSOM-AA培养基稀释敲入供体AAV，浓度为1×10 5×1/10×10 8 /μg/ ml。我们建议初始试验使用3 x 10 7 vg / ml，但最佳AAV剂量应根据每个实验室的经验确定。
2. 制备100μl含有用于胚胎转导的AAV载体的KSOM-AA培养基和三个100μl不含AAV的KSOM-AA培养基用于在35mm未处理的培养皿中每40-60个胚胎进行电穿孔后洗涤胚胎。用矿物油覆盖。
3. 将培养皿在37.0℃，5％CO 2 空气气氛中孵育30分钟以上。
Cas9 RNP电穿孔和供体AAV转导
1. 使用电穿孔仪在立体显微镜上连接1 mm间隙电极。在电穿孔步骤中，请勿打开显微镜的热敏板。否则，电极溶液会立即蒸发（图1A）。
2. 用5μlOpti-MEM I培养基清洗1 mm间隙电极3次。
3. 在35-mm未处理的培养皿上制备20-30μlCas9RNP溶液用于洗涤胚胎。
4. 用步骤G3制备的Cas9 RNP溶液洗涤20-30个双原核受精卵。
5. 在1 mm间隙电极上添加5μlCas9RNP溶液。
6. 立即在1 mm间隙电极上转移20-30个双原核受精卵（图1B）。
7. 在1分钟内进行电穿孔。条件如下：25 V，3 ms ON，97 ms OFF，Pd Alt 3-4次。
8. 将胚胎收集在电极上，并用KSOM-AA培养基洗涤三次。
9. 将胚胎转移到含有AAV载体的KSOM-AA培养基中。
10. 将胚胎在37.0℃下在5％CO 2 空气气氛中孵育16-20小时。
11. 重复步骤G2-G10进行下一轮电穿孔。 Cas9 RNP溶液应替换为新的5μlCas9RNP溶液，用于接下来的20-30个胚胎。
12. 通过交配发情前期ICR雌性小鼠与ICR雄性小鼠接受输精管切除术制备假孕雌性。
13. 电穿孔后16至20小时，在2细胞阶段收集胚胎。
14. 用M2培养基洗涤胚胎三次，并在麻醉下转移到E0.5假孕雌性的输卵管。
  
  图1.小鼠受精卵的Cas9 RNP电穿孔。 A.受精卵电穿孔所需的设备。显微镜上的1mm间隙电极连接到电穿孔器。 B.在1mm间隙电极上的双原核受精卵。比例尺，100微米。

数据分析

胚胎的敲入效率和发育率在原始文章的表2中有描述（ https://doi.org/10.1016/j.isci.2018.10.030 ）。体外培养的敲入效率胚泡期胚胎类似于后代。我们建议在初步实验中对胚泡进行基因分型。

笔记

应对所有材料进行批次检查以进行胚胎培养。
将所有小鼠维持在12小时：12小时光 - 暗循环（08：00-20：00）。
一般来说，我们为一个实验准备100-200个受精卵。这足以在许多情况下获得创始人鼠标。
为了排除转基因的潜在脱靶插入，考虑通过数字PCR或常规的Southern印迹对后代'基因组上的转基因进行拷贝数估计。

食谱

1x PBS
用4.5L蒸馏水稀释500ml 10x D-PBS（ - ）
通过高压灭菌消毒
DMEM补充10％FBS
DMEM
10％FBS（热灭活）
1％L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素溶液
2x BBS
50 mM BES
280 mM NaCl
1.5mM Na 2 HPO 4
用NaOH调节pH至6.95-7.2 每个批次和实验室的最佳pH值不同
使用0.22μm过滤器灭菌，并在-30°C下储存
150mM Na 2 HPO 4
将1.065g Na 2 HPO 4 溶于50ml蒸馏水中
2.5 M CaCl 2
将18.38克CaCl 2 ·2H 2 O溶于50毫升蒸馏水中
使用0.22μm过滤器灭菌，并在-30°C下储存
0.5 M EDTA（pH8.0）
1. 将EDTA-2Na·2H 2 O 93.06g溶于500ml蒸馏水中
2. 用NaOH调节pH至8.0
3. 用0.22μm过滤器灭菌
KSOM-AA媒体
1x KSOM媒体
1％MEM-EAA
0.5％MEM-NEAA

致谢

我们感谢F. Suchy，A。Ogawa，Toshiya Nishimura博士，Hideki Masaki博士，Sanae Hamanaka博士和A. Umino提供了有用的建议。我们还要感谢Y. Yamamoto，J。Iwano，N。Sato，H。Tsukui提供技术支持，K. Okada获得秘书支持，感谢M. Watanabe提供有关准备手稿的建议。这项工作得到了日本医学研究与发展局医学创新领先先进项目的资助。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

伦理

所有动物实验均由Institutional Animal Care and Use Committee（PA17-59，2017年11月22日，2017年3月31日）批准，并根据东京大学和国家生理科学研究所的指导进行。

参考

Behringer，R.，Gertsenstein，M.，Nagy，K。V.和Nagy，A。（2003）。操作鼠标胚胎实验室手册。冷泉港实验室出版社。纽约。
Green，M。R.和Sambrook，J。（2012）。分子克隆：实验室手册。冷泉港实验室出版社。纽约。
Chen，S.，Lee，B.，Lee，A.Y.，Modzelewski，A.J。和He，L。（2016）。通过CRISPR核糖核蛋白电穿孔受精卵进行高效的小鼠基因组编辑。 J Biol Chem 291（28）：14457-14467。
Hashimoto，M.，Yamashita，Y。和Takemoto，T。（2016）。将Cas9蛋白/ sgRNA电穿孔到早期原核受精卵中会在小鼠中产生非镶嵌突变体。 Dev Biol 418（1）：1-9。
Lock，M.，Alvira，M.R.，Chen，S.J。和Wilson，J.M。（2014）。通过液滴数字PCR绝对测定单链和自身互补的腺相关病毒载体基因组滴度。 Hum Gene Ther Methods 25（2）：115-125。
Miura，H.，Quadros，R.M.，Gurumurthy，C.B。和Ohtsuka，M。（2018）。 Easi-CRISPR用于使用长ssDNA供体创建敲入和条件性敲除小鼠模型。 Nat Protoc 13（1）：195-215。
Mizuno，N.，Mizutani，E.，Sato，H.，Kasai，M.，Ogawa，A.，Suchy，F.，Yamaguchi，T。和Nakauchi，H。（2018）。通过CRISPR / Cas9介导的胚胎基因盒敲入与腺相关病毒载体编辑的基因组编辑。 iScience 9：286-297。
Werling，N。J.，Satkunanathan，S.，Thorpe，R。和Zhao，Y。（2015）。用于定量腺相关病毒产物的定量实时PCR方法的系统比较和验证。 Hum Gene Ther Methods 26（3）：82-92。
Yoon，Y.，Wang，D.，Tai，P.W.L.，Riley，J.，Gao，G。和Rivera-Perez，J.A。（2018）。简化离体和体内基因组使用重组腺相关病毒在小鼠胚胎中进行编辑。 Nat Commun 9（1）：412。
Yoshimi，K.，Kunihiro，Y.，Kaneko，T.，Nagahora，H.，Voigt，B。和Mashimo，T。（2016）。 ssODN介导的敲除CRISPR-Cas用于受精卵中的大基因组区域。 Nat Commun 7：10431。