材料和试剂

耗材
1. 移液器吸头
2. 18 x 18 mm玻璃盖玻片（Menzel，目录号：BB018018A1）
3. Hamilton注射器（Dominique Dutscher，701 / N型）
4. 3.5毫米培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：CLS430165）
5. 1.5 ml离心管（Sigma-Aldrich，目录号：T9661）
6. 0.5毫升管（Sigma-Aldrich，目录号：T9036）
7. 0.22μm膜过滤器（MF-Millipore TM ，目录号：GSWP04700）
8. 1ml注射器（Sigma-Aldrich，目录号：Z230723）。
9. Kimtech精密组织任务擦拭（Kimtech，目录号：05511）
脂质
注意：所有脂质均购自Avanti Polar Lipids粉末，溶于氯仿（除非另有说明），并在-20°C下保存。
1. 蛋L-α-磷脂酰胆碱[EPC]（Avanti Polar Lipids，目录号：840051）
2. 1,2-二油酰基 - 甘油-3-磷酸-L-丝氨酸[DOPS]（Avanti Polar Lipids，目录号：840035）
3. 1,2-二油酰-sn-glycero-3-phosphatidylethanol-amine [DOPE]（Avanti Polar Lipids，目录号：850725）
4. Cholest-5-en-3β-ol [胆固醇]（Avanti Polar Lipids，目录号：700000）
5. L-α-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸[PI（4,5）P2]（Avanti Polar Lipids，目录号：840046）
  注意：溶于氯仿：甲醇溶液（70:30）。
6. L-α-磷脂酰乙醇胺-N-（丽丝胺罗丹明B磺酰基）[蛋PE-罗丹明]（Avanti Polar Lipids，目录号：810146）
7. 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N- [生物素（聚乙二醇）-2000] [DSPE-PEG（2000）-biotin]（Avanti Polar Lipids，目录号：880129）
其他试剂
1. 来自牛奶的β-酪蛋白（> 99％）（Sigma-Aldrich，目录号：C6905）
2. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903）
3. D +葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
4. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
5. Tris（Sigma-Aldrich，目录号：10708976001）
6. 链霉抗生物素蛋白功能化金纳米棒（Nanopartz TM ，目录号：C12-10-850-TS-DIH-50）
7. 聚乙烯醇（PVA; Merck，目录号：8.14894.0101）
8. 聚苯乙烯链霉抗生物素蛋白包被珠（直径3.2μm）（Spherotech，目录号：SVP-30-5）
9. 氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：288306）
10. 矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5310）
11. 乙醇（96％，Sigma-Aldrich，目录号：16368）
12. 脂质混合物P（见食谱）
13. 脂质混合物E（见食谱）
14. 缓冲液P（见食谱）
15. 缓冲液E（见食谱）
16. 外部缓冲区（见食谱）
17. PVA解决方案（见食谱）
18. β-酪蛋白溶液（见食谱）

设备

该设备已在Prévost et al。（2017）中准确描述。

微量移液管：内部和外部半径分别为0.78 mm和1 mm的硼硅酸盐毛细管（哈佛设备，目录号：30-0036）
相差显微镜：尼康TE2000倒置显微镜，eC1共聚焦系统（尼康），有两条激光线（λ= 488 nm和543 nm）;由5W镱光纤连续波激光器（λ> 1070nm; IPG GmBH德国）引起的光学镊子
等离子清洁剂（SPI Supplies，Plasma Prep III）
烤箱：B系列Classic.Line（活页夹，模式B 28）
真空泵：Pfeiffer Balzers涡轮分子泵DRAG 020和Pfeiffer Balzers TCP 015 Turbo分子泵控制器
玻璃注射器：Hamilton 701N（10μl）（VWR，目录号：549-1135）

程序

通过PVA辅助溶胀，洗涤和纳米棒孵育制备GUV
1. 用乙醇和水冲洗两次，清洁18 x 18 mm载玻片。用Kimtech纸巾擦干它们。每个GUV人群都需要单独的幻灯片。
  可选：使用空气作为等离子源等离子清洁玻璃载玻片5分钟。这有利于PVA的传播和附着。＆nbsp;
2. 将PVA溶液预热至约55°C并将120μl溶液涂布在载玻片上。通过将载玻片的侧面倾斜在Kimtech组织上来排出过量的PVA。 PVA也可以在载玻片上以90 x g旋涂。
3. 将载玻片在60℃下在烘箱中孵育50分钟。使用前冷却至室温。
4. 在氯仿中制备脂质混合物P和E（配方1和2）至总终浓度为1mg / ml。对于具有不同蛋白质或脂质的多个融合事件，准备额外的混合物。
5. 用氯仿彻底清洗Hamilton注射器，并使用针的侧面将15μl每种脂质混合物涂在每个相应的载玻片上，直到氯仿完全蒸发并且载玻片看起来干燥。
6. 将每个载玻片放入单独的3.5 mm培养皿中，并使用真空泵除去残留的有机溶剂。
  注意：对于敏感的脂质，如PI（4,5）P2，在真空中20分钟就足以去除残留的有机洗涤剂而不会影响脂质的完整性。
7. 稀释缓冲液E中的目标蛋白质（配方4）。
  注意：考虑到储存缓冲液对缓冲液E的最终渗透压和盐浓度的潜在影响。
8. 在相应的载玻片上沉积360μl缓冲液P和E（配方3和4）。避免缓冲区溢出幻灯片。
9. 将载玻片在所需温度下孵育30-60分钟以使肿胀。使用相差显微镜可以容易地观察到GUV生长。
10. 通过倾斜培养皿并通过轻轻移液轻轻冲洗载玻片，从每个载玻片收集200μlGUV。将每个GUV制剂转移到单独的1.5ml离心管中。
  注意：GUV非常脆弱。移液应尽可能温和。
11. 每管加入1.2毫升外缓冲液（配方5）;通过反转管轻轻混合几次。
12. 在100 x g 下离心10分钟。 GUV将沉到底部。将20μlGUV从试管底部转移到新的0.5 ml管中。＆nbsp;
13. 将80μl外部缓冲液和0.8μl链霉抗生物素蛋白包被的金纳米棒添加到上一步的GUV中。通过移液轻轻混合直至纳米棒均匀悬浮。在室温下孵育20分钟。
  注意：步骤A11和A13中的稀释液降低了GUV外缓冲液E中存在的蛋白质浓度，有助于去除脂质聚集体和小囊泡。
制备实验室
1. 如前所述准备实验室和微量移液管，也是电影一步一步准备（Prévost et al。，2017）。至少需要三个微量移液管才能进行实验（图3）。虽然R型和L型移液器需要精确的压力控制，因为每个人通过将它们连接到受控高度的水库来吸入GUV（Kwok和Evans，1981），用于固定微珠的T型移液管的压力可以是使用注射器手动调节。 R-和L-移液管的尖端直径应在5-10μm的范围内，而T-移液管的开口应小于5-10μm。 3微米。将所有三个微量移液管的尖端定位在平台的中心，在视野内，在腔室底部上方约100μm。
2. 通过与β-酪蛋白溶液（配方7）一起温育20分钟来钝化腔室和移液管。腔室的体积约为200μl。从腔室中取出β-酪蛋白，并用外部缓冲液冲洗。用170μl缓冲液填充腔室。
  注意：需要约1 ml的β-酪蛋白溶液来填充腔室和微量移液器。
3. 从Eppendorf管的底部小心地吸取15μl每种GUV群，并将它们缓慢加入室中。将两个群体放在室的不同区域（图3）。
4. 向腔室中加入2μl链霉抗生物素蛋白包被的聚苯乙烯珠粒（直径~3μm）至终浓度为0.1×10 5 sup / 3％（w / v）。将珠子放在腔室的单独区域，以避免与GUV混合（图3）。
5. 将GUV保持在腔室中20-30分钟。在此期间，GUV和珠子沉降到腔室的底部。此外，从缓冲液中蒸发产生渗透梯度，这使得GUV“松软”并允许它们通过微量移液管抽吸。
6. 为了防止实验过程中的进一步蒸发，用矿物油密封腔室。
  
  图3.表示实验室布置的示意图，包括移液器，GUV和微珠。 L（左）和R（右）微量移液管在融合前固定两个GUV，而T型移液管用于牢固地固定微珠并拉动纳米管。
GUVs融合实验（对于描述融合事件的电影，请参阅De Franceschi的补充数据 et al。，2018）：
1. 将T形移液管的尖端降低到腔室的底部。通过移动显微镜载物台，找到微珠并用T型移液管强力吸出。通过关闭移液管和注射器之间管道上的阀门来锁定压力。将T形移液管的尖端从腔室底部抬起100μm。
2. 将R-和L-移液管吸气压力设置为零。通过移动显微镜载物台，找到含有PI（4,5）P2的GUV并用R-移液管吸出。将GUV升高至腔室底部上方100μm。
3. 通过移动显微镜载物台，找到含有蛋白质的GUV。降低L型移液管并吸出GUV。将该移液管从腔室底部抬起100μm。
4. 调整T型移液器固定的微珠上的焦点。将R-移液管的压力释放到几乎为零并使其与珠子接触。通过用微操纵器移动R-移液管远离珠子，从含PI（4,5）P2的GUV中拉出纳米管。调整R-移液管的高度，使微珠和纳米管都聚焦。
5. 通过使用显微操纵器，横向和垂直放置R型和L型移液器，使红外激光聚焦在两个GUV之间的界面上。释放R型和L型吸管的吸气压力几乎为零。
  重要提示：这是最关键的一步，因为只有在正确放置GUV并且R型和L型移液器的抽吸压力几乎为零时才会发生融合。在定位和融合期间，通过DIC观察GUV而不是荧光，大大简化了这一过程（图4）。
  
  图4. GUV的定位和融合。 A. GUV在融合前和融合后的荧光图像。脂质混合仍未完成。融合后图像中的对比度已增强，表明融合发生时GUVs外没有蛋白质泄漏。比例尺=10μm。 B.融合前GUV最佳位置的DIC成像。红点表示光学镊子的位置。比例尺=10μm。
6. 通过打开红外激光触发融合。如果GUV正确对齐，融合是瞬时的。如果没有发生融合，请关闭激光器并使用微操纵器微调GUV的位置。然后重复这个过程。
  注意：也可以在调整移液器位置的同时保持激光打开。然而，这偶尔会引起两个GUV之间的强粘附，这可以抑制融合。此外，长时间照射会导致膜加热（由于纳米棒的吸收），从而降解敏感脂质，如PI（4,5）P2。
7. 融合后，内容物混合几乎是瞬间的，而脂质混合可能需要几十秒才能完成（图4）。这可能导致膜张力的波动，而与吸移管的抽吸压力无关。等待2-3分钟，直到张力稳定，然后再进行任何测量。可能必须重新调整焦点以使纳米管可视化。在融合期间或之后没有GUV内容的释放。
8. 一旦膜张力稳定，可以改变管半径以研究蛋白质的募集作为管半径的函数，如通常用纳米管测定法所做的那样（Prévost等人，，2017）。

数据分析

这里描述的融合方案用于重建GUV内的蛋白质。一旦完成融合，就进行测量和数据分析，类似于经典的拉管实验（Prévost et al。，2017）。在我们的设置中，光阱（因此是红外激光）用于诱导融合，因此不可能进行力测量。然而，在具有多个光阱的设置中，可以执行力测量。

笔记

该方案与用于生长GUV的方法无关，但我们建议使用PVA溶胀方法，因为其具有良好的蛋白质包封效率和高产率的GUV。 GUV非常脆弱，并且在洗涤过程中产生了大量产生的GUV，使其他方法（例如铂丝上的电铸（Prévost et al。，2017）不太合适，因为GUV较少生产。此外，PVA辅助的GUV溶胀可以在很宽的温度范围内（4-60℃）起作用，因此可以适应基本上所有蛋白质和脂质所需的实验条件。
通常更容易融合相似尺寸的GUV，因为它们更容易对齐。
在进行管拉动实验时，重要的是确保囊泡是单层的。 PVA溶胀方法通常产生单层囊泡。然而，当使用我们的方案时，确认囊泡的单层性是不必要的，因为多层囊泡的偶然融合很容易识别：只有外膜将经历融合，从而揭示内膜的存在（图5）。 >

＆nbsp; 图5.具有多层GUV的融合事件。洋红色的GUV是多层的，但这只在融合后变得明显，因为只有外膜可以与其他GUV融合。这在膜之间产生了一个充满蛋白质的额外隔室。比例尺=10μm。
金纳米粒子的链霉抗生物素蛋白功能化程度存在显着的批次间差异。这会严重影响GUV融合的效率，并且需要针对每个新批次调整添加的纳米颗粒的量。然而，每批中通常提供的纳米颗粒的量足以进行数百次实验。

食谱

注意：

脂质混合物P和E以及该方案中描述的P，E和外部缓冲液是ESCRT-III蛋白CHMP2B和含有PI（4,5）P2的GUV之间的融合实验所需的。不同的蛋白质，脂质或结合条件可能需要调整脂质混合物和缓冲液。
对于每个GUV生产，需要360μl缓冲液。每个实验需要约3ml的外部缓冲液。缓冲液组成可根据实验的要求和目的而广泛变化。始终确保所有缓冲液具有相似的渗透压，并且缓冲液P和E含有足够的蔗糖，与外部缓冲液的葡萄糖含量相比，以使GUV下沉。
在此实施例中，将23μl30μM的CHMP2B储备液加入到337μl缓冲液E中。蛋白质储备缓冲液含有100 mM NaCl和25 mM HEPES，因此它不会显着影响渗透压。

脂质混合物P / nbsp;
脂质混合物E
PI（4,5）含P2的GUV缓冲液（缓冲液P）
封装缓冲区（缓冲区E）
外缓冲区
PVA解决方案
1. 在下列缓冲液中溶解5％w / v的PVA：100mM蔗糖，50mM NaCl和50mM Tris pH 7.4
2. 在约80℃温和搅拌下溶解PVA
β-酪蛋白溶液
1. 在下列缓冲液中溶解5mg / ml的β-酪蛋白：100mM NaCl和50mM Tris pH 7.4
2. 用0.22μm膜过滤器过滤溶液

致谢

这项工作得到了国家知识产权局（ANR-14-CE09-0003-01）的支持。来自居里研究所，SPF20160936338基金会，欧洲分子生物学组织（EMBO）非附属长期奖学金（ALTF 818-2016），MSCA Grant 751715（ESCRT模型）的博士后奖学金被认可资助这种方法的发展及其传播。
＆NBSP;这种方法首次应用于De Franceschi et al。（2018），结合并优化了三种技术：经典的管拉法（Prévost et al。，2017），激光 - 引发GUV融合（Rørvig-Lund 等人，2015）和PVA辅助凝胶肿胀的蛋白质包封（Weinberger et al。，2013）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Caillat，C.，Maity，S.，Miguet，N.，Roos，W。H.和Weissenhorn，W。（2019）。 VPS4在ESCRT-III聚合物重塑中的作用。 Biochem Soc Trans 47（1）：441-448。
Dasgupta，R。和Dimova，R。（2014）。从巨大的囊泡中取出向内和向外的膜管。 < em> J Phys D Appl Phys 47（28）：282001。
De Franceschi，N.，Alqabandi，M.，Miguet，N.，Caillat，C.，Mangenot，S.，Weissenhorn，W。和Bassereau，P。（2018）。 ESCRT蛋白CHMP2B可作为重组膜颈的扩散屏障。 J Cell Sci 132（4）。
Henne，WM，Stenmark，H。和Emr，SD（2013）。膜的分子机制雕刻ESCRT途径。 Cold Spring Harb Perspect Biol 5（9）。
Kwok，R。和Evans，E。（1981）。大型卵磷脂双层囊泡的热弹性。 Biophys J 35 （3）：637-652。
Mathivet，L.，Cribier，S。和Devaux，P.F。（1996）。在交流电场存在下制备的巨型磷脂囊泡的形状变化和物理特性。 Biophys J 70（3）：1112-1121。
McCullough，J.，Frost，A。和Sundquist，W。I.（2018）。 ESCRT-III / Vps4膜重塑和裂变复合物的结构，功能和动力学。 Annu Rev Cell Dev Biol 34：85-109。
Prévost，C.，Tsai，F.C。，Bassereau，P。和Simunovic，M。（2017）。从巨大的单层囊泡中拉出膜纳米管。 J Vis Exp （130）。
Prévost，C.，Zhao，H.，Manzi，J.，Lemichez，E.，Lappalainen，P.，Callan-Jones，A。和Bassereau，P。（2015）。 IRSp53检测到阴性膜弯曲和沿膜管相分离。 Nat Commun 6：8529。
Rørvig-Lund，A.，Bahadori，A.，Semsey，S.，Bendix，P.M。和Oddershede，L.B。（2015）。由光学加热的金纳米粒子触发的囊泡融合。 Nano Lett 15（6）：4183-4188。
Sorre，B.，Callan-Jones，A.，Manzi，J.，Goud，B.，Prost，J.，Bassereau，P。和Roux，A。（2012）。 amphiphysin与膜的曲率耦合性质取决于其结合密度。 Proc Natl Acad Sci USA 109（1）：173-178。
Weinberger，A.，Tsai，F.C.，Koenderink，G.H.，Schmidt，T.F.，Itri，R.，Meier，W.，Schmatko，T.，Schroder，A。和Marques，C。（2013）。凝胶辅助形成巨大的单层囊泡。 Biophys J 105（1）：154-164。