材料和试剂

锥形瓶（Duran，目录号：2121628）
微量离心管（Eppendorf，Safe-Lock管，目录号：0030120086,0030120094）
离心管（Sarstedt，目录号：62.554.502,62.547.254）
培养管（TPP，目录号：91016）
移液器吸头（VWR，目录号：89041-404,89041-412,89041-400）
血清移液器（VWR，目录号：612-3702,612-3700,612-3698）
6孔组织培养试板（TPP，目录号：92406）
细胞计数器载玻片（Countess Cell Counting Chamber Slides，Thermo Scientific，目录号：C10228）
TC7细胞（Chantret et al。，1994）
福氏志贺菌 M90T（Sansonetti et al。，1982）也可从ATCC购买，并可应作者要求提供
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Gibco，目录号：21885-025）
青霉素 - 链霉素溶液（10,000 U / ml）（Gibco，目录号：15140122）
最低必需培养基非必需氨基酸溶液（100x）（Gibco，目录号：11140-035）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）解决方案（Gibco，目录号：14190-144）
胎牛血清（Gibco，目录号：10500056）
HEPES 1 M解决方案（Gibco，目录号：15630-080）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％），酚红（Gibco，目录号：25300-054）
台盼蓝染色（0.4％）（Thermo Scientific，目录号：T10282）
硫酸庆大霉素（西格玛，目录号：G1264）
琼脂糖（VWR生命科学，目录号：35-1020）
胰蛋白酶大豆汤（TSB）即用型粉末（默克，目录号：105459）
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）即用型粉末（默克，目录号：105458）
刚果红（西格玛，目录号：C6277）
乙醇（VWR chemicals，目录号：20821.558）
Giemsa的azur eosin亚甲蓝溶液（Merck，目录号：109204）
生长培养基（见食谱）
感染缓冲液（见食谱）
琼脂糖覆盖（见食谱）
5％（v / v）Giemsa解决方案（参见食谱）
刚果红解决方案（见食谱）

设备

生物安全柜（Thermo Scientific，HERAsafe KS 18）
分光光度计（Amersham，Ultrospec 2100 pro）
移液器（VWR，Accurpette）
CO 2 培养箱（Thermo Scientific，Heracell VIOS 160i）
台式离心机（VWR，Micro Star 17R）
离心机（Eppendorf，5810R带转子A-4-81用于板）
水浴（格兰特，JBA 12）
移液器（Eppendorf，Research plus）
倒置显微镜（Motic，AE2000双目）
细胞计数器（Thermo Scientific，Countess II FL）
成像系统（Bio-Rad，ChemiDoc XRS）
微波炉（Whirlpool，MD101）
一次性手术刀（Swann-Morton，0503）
真空泵（VWR，迷你隔膜真空泵VP 86）
轨道振动筛（EdmundBühler，Swip SM25）

软件

Prism 7（GraphPad， https://www.graphpad.com ）
ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/index.html ）< br />

程序

注意：实验应在生物安全2级实验室进行。

细菌的制备
第1天
1. 按照制造商的说明准备或熔化胰蛋白酶大豆琼脂（TSA），并将其冷却至约45°C（例如，在已设定为45°C的水浴中）。加入无菌刚果红溶液（参见配方）至终浓度为0.01％，例如，5ml刚果红溶液至500ml TSA。将板（在每个10cm直径板中约25ml TSA）倒在明火旁或无菌柜中并让它们干燥。将板保存在4°C并在3周内使用。
2. 下午，在补充有刚果红的TSA平板上从甘油原液（见注释）中划出福氏志贺菌。在37°C下过夜（约18小时）。
第2天
1. 用福氏志贺菌（Shigella flexneri）的单个红色菌落（图1）接种5ml TSB，并在37℃和180rpm搅拌下孵育过夜。
第3天
1. 将新鲜TSB中的过夜培养物稀释200倍于锥形瓶中。例如，在125ml烧瓶中，取25ml TSB并加入125μl过夜培养物。在37℃下以180rpm搅拌孵育并生长至对数中期（OD 600nm = 0.3-0.4）。志贺氏菌在指数期的倍增时间约为40分钟。通常需要大约3小时才能达到对数中期阶段。
  
  图1.在TSA上添加0.01％刚果红的福氏志贺菌的特征性红色菌落
TC7细胞的制备
第2天
1. 从具有汇合的单层TC7细胞的细胞培养瓶中取出生长培养基（参见食谱）。
2. 用无菌PBS洗涤细胞三次。
3. 加入5ml预热的胰蛋白酶溶液，并将烧瓶在37℃下孵育约4分钟。
4. 加入5ml生长培养基（参见食谱）以抑制胰蛋白酶，并在50ml离心管中收集胰蛋白酶消化的细胞。
5. 在900 x g 下离心并弃去上清液。通过轻轻吹打将沉淀重新悬浮在5-10ml不含抗生素的生长培养基中（参见食谱）。＆nbsp;
6. 在无菌的1.5 ml微量离心管中，将10μl细胞悬浮液与10μl台盼蓝溶液混合。将10ml该混合物加载到Countess II计数载玻片上并使用Countess II细胞计数器测定细胞数。
7. 在6孔板中培养所需数量的孔，每孔含1百万个细胞（1 x 10 6 ），每孔加入至少2 ml不含抗生素的生长培养基（见食谱）。这一数量的细胞足以在生长一天后形成完全融合的单层（图2）。
  
  图2.单层TC7细胞的明视野图像
感染
第3天
1. 在第3天，当细菌达到OD 600nm = 0.3-0.4时，将1-1.5ml培养物移液到微量离心管中。
2. 将管在3,000 x g 下旋转5分钟。吸出上清液。在室温下加入等体积的PBS，通过上下吸移或轻轻涡旋重悬沉淀。
3. 重复步骤C2至少两次，最后在室温下将沉淀重悬于感染缓冲液中。记录细菌悬浮液的OD 600nm 。
  推荐的该实验感染复数（MOI）非常低，每150个细胞有1个细菌。由于每个孔中有1×10个 6 细胞，每个孔所需的细菌数量约为6700个。
  OD 600nm = 1时志贺氏杆菌细胞的数量为0.5×10 9 / ml;因此，在OD = z时，细菌细胞的数量= z×0.5×10 9 。使用以下公式计算感染每个孔所需的细菌悬浮液的体积：
  需要的细菌悬浮液体积（以ml计）= 6,700 / z×0.5×10 9
  另外，制备细胞悬浮液的10倍系列稀释液，并在TSA平板上分散100μl。将板在37℃孵育并计数第二天获得的菌落。接种物的菌落计数将验证所用细菌的数量。
4. 从TC7细胞板中吸出培养基，并在室温下向每个孔中加入2ml PBS。
5. 轻轻旋转盘子，小心地吸出所有液体。以类似方式洗涤细胞两次，并在室温下向每个孔中加入2ml感染缓冲液（参见食谱）。
6. 将所需体积的细菌悬浮液（在步骤C3中计算）添加到6孔板的每个孔中。通过轻轻吹打混合均匀，以确保细菌悬浮液均匀混合。将板（使用离心机转子中的板衔接器）在180℃下离心10分钟，在室温下离心。
7. 将板在37℃，10％CO 2 下孵育2小时。
8. 孵育后，如步骤C4和C5，用预热的PBS洗涤孔三次。
9. 从孔中完全吸出液体并用2ml冷却的琼脂糖覆盖物覆盖细胞（参见配方）。
10. 将板放回37℃，10％CO 2 。每天检查平板以检查斑块的外观。孵育两天足以获得最佳斑块大小（直径1-2毫米）。但是，它取决于细菌菌株，因此需要经常观察。
斑块的可视化和枚举
第5天或第6天
1. 孵育48-72小时后，使用手术刀非常小心地剥离琼脂糖覆盖层，使覆盖层从壁上分离并绕过板。
2. 通过在95％乙醇中孵育5分钟来固定细胞。
3. 除去乙醇并用5％Giemsa溶液（参见配方）将孔染色10分钟。
4. 吸出污渍并用蒸馏水清洗孔两次。让盘子风干。
5. 当印版干燥时，使用成像系统拍摄印版图片（图3）。
6. 用记号笔计算每个孔中形成的斑块数量。
  
  图3.对细胞单层上形成的斑块的视觉评估。 A.清楚的斑块代表6孔板孔中的死细胞，其中TC7单层用Giemsa染色。 B.斑块边缘的明视野显微照片。清晰的区域是斑块，斑块和TC7单层的界面显示出对细胞的特征性损伤。

数据分析

使用ImageJ软件确定图像中每个斑块的直径。
使用Prism软件绘制斑块的数量或平均直径与条件（例如，菌株）或特定孔中使用的MOI（图4）。对于每个测试条件，在每个实验中至少准备重复样品作为技术重复。对于生物学重复，在另一天用相同数量的细菌和细胞重复实验至少3次。
要在固定时间点仅比较两个样本值，请使用学生的 t -test。但是，要评估多个样本在多个时间点的统计显着性，请使用双向ANOVA和Tukey的 post-hoc 测试。

图4.不同细菌菌株在特定MOI下噬菌斑数量的示例图。每个点代表从复制品中获得的独立值。

笔记

为了制备弗氏志贺氏菌的甘油储液，在新鲜的TSB中将过夜培养物稀释200倍，并在37℃和200rpm摇动下孵育。定期监测培养物的OD 600 。在OD 600 = 0.6时，在2ml冷冻管中取出1ml培养物并加入无菌甘油至浓度为15-50％（v / v）。轻轻混合并将管储存在-80°C。冷冻原料在-80°C下稳定多年，然而，多次冻融循环可能会缩短保质期。
仔细选择刚果红琼脂上的红色菌落进行实验。灰白色菌落失去了毒力质粒并且是入侵缺陷的。如果在过夜培养后不立即使用平板，但保持在4°C（可能长达3周），需要标记白色菌落，因为刚果红的非特异性结合它们会变红。侵袭性菌落的红色染色仅在35°C以上的生长期间发生。
刚果红能够通过志贺氏菌中的III型分泌系统（T3SS）诱导分泌。染料与具有活性T3SS的细菌菌落结合，使其呈现红色。这是一种简单快速的筛选方法，用于区分毒性志贺氏菌菌落与无毒菌株（由于毒力质粒的固化）。不幸的是，刚果红的作用机制尚不清楚。
培养TC7细胞并在青霉素和链霉素（100U / ml）存在下维持。然而，感染在不含任何抗生素（可能抑制细菌生长）的感染缓冲液中进行。理想情况下，如果第二天使用或至少在实验开始时大量洗涤，则将细胞接种在没有抗生素的培养基中。＆nbsp;
该实验的感染复数（MOI）应保持非常低，因为当斑块彼此太靠近时，斑块数和斑块大小都不能正确确定。 MOI可以通过用各种稀释的细菌悬浮液进行实验来凭经验确定。我们建议每150或300个TC7细胞使用一个细菌细胞。＆nbsp;
加入细菌后，将6孔板离心，以帮助结合，因为志贺氏菌缺乏粘附因子。
浇注时琼脂糖覆盖层不应该很热。它可能杀死细胞。
即使在较长时间的孵育期间，庆大霉素也不能穿透细胞并杀死细胞内的细菌。细胞内细菌始终保持“受到保护”。
保留入侵开始时所需的所有缓冲液和试剂，然后在使用前升温至37°C。介导入侵的T3SS效应子的分泌是温度依赖性的。它在35°C以上有效，但在室温下无效。为了使入侵同步，重要的是在入侵前将细菌保持在室温下的缓冲液中。
除了必须新鲜制备的琼脂糖覆盖层和吉姆萨溶液外，所有试剂均可在第1天制备。
使用移液器控制器时，轻轻地用重力（Accurpipette中的“G”设置）或以最低流速将溶液分配到6孔板中以避免分离细胞单层。
在旋转平板，清洗细胞和离心过程中要小心，因为融合细胞单层很容易脱落。＆nbsp;
斑块的平均数量和直径不能用总斑块面积的量度代替。斑块的数量实际上反映了入侵点的数量。斑块的直径反映了细菌传播的能力。因此，总斑块面积测量将不允许区分细菌菌株，该细菌菌株具有良好的侵入性，但能够从易于入侵但在播散性差的菌株中传播。
有关本手稿中未描述的基本方法的详细阅读和详细信息（如细菌接种，倒板，等），读者可参考以下书籍：微生物学：实验室手册（卡布奇诺和威尔士，2017）和动物细胞培养：基础技术和专业应用手册（Freshney，2010）。

食谱

刚果红解决方案
1％（w / v）刚果红在水中
称取1g刚果红染料，并将其溶于70ml水中。将溶液的体积调至100 ml，并使用0.2μm膜过滤器对溶液进行过滤灭菌。刚果红溶液在室温下长时间稳定
生长媒介
DMEM
1x氨基酸溶液
100 U / ml Pen-Strep溶液
10％热灭活FBS
向500ml DMEM中加入5ml Pen-Strep溶液，5ml氨基酸溶液和50ml FBS（通过在55℃温育30分钟灭活）
注意：生长培养基必须在4°C下储存，可以使用3-4周。
感染缓冲区
DMEM（无血清）
20 mM HEPES，pH 7.4
向50ml无血清DMEM中加入1ml 1M无菌HEPES pH 7.4 注意：感染缓冲液在4°C下稳定数月。
琼脂糖覆盖
感染缓冲液中0.5％（w / v）琼脂糖
5％FBS
50μg/ ml庆大霉素
1. 将0.1g琼脂糖加入20ml感染缓冲液中
2. 在微波炉中融化琼脂糖
3. 冷却至约50°C时，加入1 ml热灭活FBS和20μl50mg / ml庆大霉素溶液
4. 让琼脂糖在水浴中冷却至约45℃，使其仍然是液体但不是太热
注意：琼脂糖覆盖层需要在每次使用前准备好，并且不能存储。
5％（v / v）Giemsa解决方案
使用1毫升Giemsa原液，在19毫升PBS中制备20毫升Giemsa溶液。
将其放在黑暗的瓶子/管中
注意：不要存储它，并始终将其用作新制备的解决方案。

致谢

我们感谢Puhar实验室的成员进行批判性阅读。如。在Emmanuelle Charpentier的赞助下，获得MIMS卓越选择博士后计划的津贴。该计划由Kempe Foundations和Knut以及Alice Wallenberg基金会资助。 A.P.承认来自MIMS，UCMR，Umeå大学和Wallenberg Academy Fellow计划的慷慨资助。该方案用于Puhar 等人（2013）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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