材料和试剂

50毫升管（Labcon，目录号：3181-345-008）
15毫升管（Labcon，目录号：3131-345-008）
1.5毫升管（BIO-BIK，目录号：ST-0150F）
带有圆顶帽的0.2 ml PCR管（Axygen，Funakoshi，目录号：PCR-02D-C）
移液器吸头10μl（BIO-BIK，目录号：1050N），200μl（BIO-BIK，目录号：PT-200），1,000μl（BIO-BIK，目录号：804C）
96孔微孔板（Greiner Bio-One，目录号：655801）
一次性2毫升聚苯乙烯柱（Pierce，目录号：29920）
超滤盘，10 kDa NMW（Millipore，目录号：PBGC02510）
醋酸纤维素膜过滤器，0.45μm（Advantec，目录号：C045A090C）＆nbsp;
GL chromatodisc0.45μm（GL Science，25N）
PVDF膜（Millipore，目录号：IPVH00010）
透析膜（As One，目录号：2-316-02）
HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR（GE Healthcare，目录号：17-1166-01）
无菌培养皿（As One，目录号：1-7484-01）
电子。大肠杆菌DH5α感受态细胞（Takara Bio，目录号：9057）
Stirred Ultrafiltration cells（Millipore，目录号：1532701）
引物（Invitrogen）
引物1（正向），5'-AAAGAAGTTTGCTACGAAAGACTC-3'
引物2（反向），5'-GATTGTGCCACACTCCCACTCG-3'
引物3（前向），5'-ACCAAAAGATGTCAACACCCGCTTCC-3'
引物4（反向），5'-GACCAAGGCAATATATGGAGGGGTC-3'
引物5（前向），5'-ATGGTAGGTC TCAAATGAAAGAAGTTTGCTACGAAAGACTCG-3'
引物6（反向），5'-ATGGTAGGTCTCAGCGCTACACGGTGTGAGGGTGAGCAG-3'
引物7（前向），5'-CCCAGCAGAACCTTGCTTTCAGG-3'
引物8（反向），5'-CTTCCCAGATTCCGTCTATGTCC-3'
pASK-IBA3plus质粒（IBA，目录号：2-1402-000）
Strep-Tactin-Sepharose（IBA，目录号：2-1201-010）
Human MTC Panel I（Clontech Laboratories，目录号：636742）
PfuTurbo DNA聚合酶（安捷伦科技，目录号：600250）
KOD-Plus-Mutagenesis Kit（Toyobo Co.，Ltd。，目录号：SMK-101）
MgSO 4 ·7H 2 O（Wako，目录号：138-00415）
抗脂肪酶抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录号：ab96100）
HRP缀合的山羊抗兔抗体（Kirkegaard和Perry Laboratories，目录号：074-15-061）
BSA，牛血清白蛋白，低盐（Wako，017-15124）＆nbsp;
BsaI（BioLabs，目录号：R0535）
PCR纯化试剂盒（Wizard SV ®凝胶和PCR Clean-Up系统）（Promega，目录号：A9281）＆nbsp;
连接酶T4 DNA连接酶（Toyobo Co. Ltd，Osaka）
BigDye Terminator TM 纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：4376484）
FastDigest ® Eco31I（赛默飞世尔科技，目录号：FDO293）
10x FastDigest ®绿色缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：B72）
结扎高ver.2（TOYOBO，目录号：LGK-201）
氨苄西林钠（Wako，目录号：016-10373）
Bacto Agar（Becton，Dickinson and Co.，目录号：214010）
Luria Bertani（LB）肉汤基（Invitrogen，目录号：12780-052）
无水四环素（IBA，目录号：2-0401-002）
尿素（Wako，目录号：217-00171）
二硫苏糖醇（DTT）（Wako，目录号：049-08972）
Desthiobiotin（Sigma-Aldrich，目录号：D1411）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Wako，目录号：345-01865）
氯化钠（NaCl）（Kanto Chemical Co.，Inc。，目录号：37144-86）
氢氧化钠（NaOH）（Wako，目录号：198-13765）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Nacalai Tesque，目录号：27327-94）
三（羟甲基）氨基甲烷（Wako，目录号：204-07881）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
L-精氨酸盐酸盐（Wako，目录号：018-04625）
CBB R-250（Wako，目录号：031-17922）
甲醇（Wako，目录号：25183-70）
乙酸（Wako，目录号：017-00251）
L-胱氨酸二盐酸盐（Wako，目录号：03405322）
L-半胱氨酸（Wako，目录号：039-20652）
甘油（Wako，目录号：075-00611）
CaCl 2 （Wako，目录号：031-00435）
Tributyrin（Wako，目录号：207-02392）
脂肪酶，猪（Bio-Rad，目录号：2148-1004）
牛磺酸脱氧胆酸钠
LB琼脂平板（见食谱）
LB培养基（见食谱）
缓冲液A（见食谱）
裂解缓冲液（见食谱）
缓冲液A *（见食谱）
等效缓冲液（见食谱）
洗脱缓冲液（见食谱）
重折叠缓冲液（见食谱）
运行缓冲区（参见食谱）
反应缓冲液（见食谱）

设备

300毫升摇瓶（Iwaki，目录号：4070FK300）
500毫升玻璃烧杯（例如，As One，目录号：2-5091-06）
移液器（Eppendorf，参考10-100μl，0.5-10μl，目录号：4920000059,4920000024）
磁力搅拌棒（NALGENE，目录号：93-5521-5）
-80°C冰箱（Nihon Freezer MY BIO，型号：VT-208）
Zymoreactor II热循环仪（ATTO）＆nbsp;
Prism 3100 Avant测序仪（Applied Biosystems）
摇动培养箱（例如，Thomas，型号：AT-12R）
冷藏台式离心机（例如，Eppendorf，型号：5417R）
高速离心机（日立，型号：CR20GIII）
Sonicator（Branson，型号：Advanced Sonifier 250）
分光光度计（DeNovix，型号：DS-11）
微孔板分光光度计（DS Pharma Biomedical，型号：Viento XS）
馏分收集器（例如，Advantec，型号：SF-2100）
Amicon TM ，Bioseparations Stirred Cell（Merck，目录号：8010）
AKTA净化器色谱系统（GE Healthcare）
pH-stat AT-510（京都电子制造有限公司）

软件

UNICORN（GE Healthcare），AKTA净化器色谱系统的控制软件
Gen 5（Bio Tek），用于酶标仪的数据收集和分析软件
AT-Win（京都电子制造有限公司），用于pH-stat的控制软件，自动电位滴定仪，AT-510

程序

制备recHPL的该方法包括五个步骤：（A）表达质粒的构建，（B）在 E中的表达。大肠杆菌，（C）分离，（D）重折叠和（E）纯化。

HPL表达质粒的构建
将ST II融合的recHPL克隆到pASK-IBA3plus质粒中以允许在 E中表达。大肠杆菌该构建体含有C末端Strep-tag II以促进recHPL的分离（图1）。

图1. recHPL的序列。：一种。 HPL-pASK-IBA3plus质粒的部分核苷酸序列和推导的氨基酸序列。使用自动测序仪确认HPL的整个序列。盒装区域： HPL 的编码序列，波浪下划线：连接子序列，虚线下划线：ST II标签的序列。 B.pASK-IBA 3Plus-HPL质粒的结构。
1. 按照下面详述的PCR方案，使用人胰腺cDNA文库，人MTC Panel I作为PCR的模板，使用Zymoreactor II（ATTO）热循环仪扩增HPL的编码序列，条件如下：
  [引子]
  引物1（正向），5'-AAAGAAGTTTGCTACGAAAGACTC-3'
  引物2（反向），5'-GATTGTGCCACACTCCCACTCG-3'
  [反应混合物]
  
  [PCR条件] class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>
  的30个周期 95°C
  60秒（变性）
  
  55°C
  60秒（退火）
  
  72°C
  60秒（续）
2. 使用1％琼脂糖凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增子。
3. 切下凝胶上的DNA条带（预期大小为1,350 bp），用Wizard ® SV凝胶和PCR Clean-Up System纯化以获得插入DNA。
4. 使用Zymoreactor II（ATTO）热循环仪在以下条件下用GGTCAC替换插入DNA中包含的Eco311限制性内切核酸酶识别序列GGTCTC进行第二次PCR。
  [引子]
  引物3（前向），5'-ACCAAAAGATGTCAACACCCGCTTCC-3'
  引物4（反向），5'-GACCAAGGCAATATATGGAGGGGTC-3'＆nbsp;
  
  [反应混合物]
  
  [PCR条件] class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>
  的10个周期 94°C
  120 s
  
  98°C
  10秒
  
  68°C
  360 s
5. 使用1％琼脂糖凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增子。
6. 切下凝胶上的DNA条带（预期大小为1,350 bp），用Wizard ® SV Gel和PCR Clean-Up System纯化，得到插入DNA。
7. 进行第三次PCR以获得插入DNA，在以下条件下使用Zymoreactor II（ATTO）热循环仪在两端添加Eco31 I限制性内切核酸酶识别位点：
  [引子]
  引物5（前向），5'-ATGGTAGGTC TCAAATGAAAGAAGTTTGCTACGAAAGACTCG-3'
  引物6（反向），5'-ATGGTAGGTCTCAGCGCTACACGGTGTGAGGGTGAGCAG-3'
  
  [反应混合物]
  
  [PCR条件] class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>初期变性
  94°C
  120 s
  
  的25个周期 94°C
  15 s
  
  65°C
  30秒
  
  68°C
  60秒
8. 使用BigDye Terminator TM 纯化试剂盒纯化测序反应。
9. 通过在37°C下加入FastDigest ®Eco31I1μl，10x FastDigest Green Buffer2μl和ddH 2 O15μl消化扩增子2μl，持续5 min。
10. 通过在37℃下加入FastDigest ®Eco31I1μl，10x FastDigest Green Buffer2μl和ddH 2 O15μl消化pASK-IBA3Plus2μl，持续5分钟。
11. 使用1％琼脂糖凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分离消化的样品。
12. 在凝胶上切下DNA条带（插入DNA和pASK-IBA3Plus的预期大小分别为1,350 bp和3,247 bp），并用Wizard ® SV Gel和PCR Clean-Up进行纯化。
13. 用消化的pASK-IBA3plus连接消化的插入DNA，通过DNA连接试剂盒，Ligation high Ver.2获得HPL-pASK-IBA3plus质粒。
14. 使用Prism 3100 Avant测序仪对所有构建的质粒进行测序，以确认设计的重组HPL的序列。使用以下引物：
  引物7（前向），5'-CCCAGCAGAACCTTGCTTTCAGG-3'
  引物8（反向），5'-CTTCCCAGATTCCGTCTATGTCC-3'
recHPL在 E中的表达。大肠杆菌
1. 将5μl（10倍稀释）HPL-pASK-IBA3plus质粒（ ca。 2.5ng）转化到50μl E中。大肠杆菌DH5α感受态细胞在1.5ml管中。
2. 在冰上孵育30分钟。
3. 在42°C孵育45秒。
4. 加入900μlLB培养基并在37°C培养1小时。
5. 将包含100μg/ ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上的100μl转化体在37℃下平板培养18小时。
6. 挑取单个菌落，将转化体在含有100μg/ ml氨苄青霉素的5ml LB培养基中于50ml管中于37℃培养18小时。
7. 将细菌悬浮液（3ml）转移到摇瓶中的包含100μg/ ml氨苄青霉素的300ml新鲜LB培养基中，并在37℃，150rpm下培养3小时。
8. 当通过分光光度计（DeNovix）在550nm处测量的培养物的吸光度达到0.5以诱导重组蛋白的表达时，添加30μl的2mg / ml无水四环素，终浓度为200μg/ L.
9. 在30℃下以120rpm振荡孵育5小时。
10. 使用高速离心机（Hitachi）在4℃下以6,100 x g 离心15分钟以收获细胞。
11. 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于15 ml缓冲液A中，并在-80°C下在50 ml管中冷冻直至使用。
隔离recHPL
1. 解冻冷冻的细菌颗粒。
2. 在冰上通过超声处理裂解细菌细胞沉淀2分钟（30秒×4次，输出：4，工作循环：70％）。＆nbsp;
3. 使用高速离心机（Hitachi）在4℃下以4,400 x g 离心15分钟。
4. 弃去上清液，将沉淀重悬于15ml裂解缓冲液中。
5. 在4℃下以28,000 x g 离心10分钟。
6. 弃去上清液，用30ml缓冲液A洗涤沉淀两次。
7. 在4℃下以28,000 x g 离心10分钟。
8. 弃去上清液，用10ml缓冲液A *溶解洗涤的包涵体，在4℃搅拌30分钟。
9. 向上清液中加入50μl终浓度为10mM的2M DTT。
10. 在37°C孵育1小时，同时以100 rpm的速度搅拌。
11. 用10ml缓冲液A *稀释溶解的蛋白质。
12. 使用透析膜（孔径= 50）在4℃下对150ml等效缓冲液透析2小时以在玻璃烧杯中使用磁力搅拌器在温和搅拌下除去尿素。
13. 将透析的溶液在28,000 下在4℃下离心10分钟。＆nbsp;
14. 吸出上清液并转移至50ml管中。
15. 使用巴斯德吸管在聚苯乙烯柱中向2ml Strep-Tactin-Sepharose中加入20ml冰冷的等效缓冲液。
16. 除去平衡的Strep-Tactin-Sepharose并加入50ml管中透析的蛋白质溶液中。
17. 在4°C孵育30分钟，在约30转/分的温度下轻轻摇动。
18. 将Strep-Tactin-Sepharose的悬浮液混合物装入聚苯乙烯柱中。
19. 用3ml / s的流速用20ml等效缓冲液洗涤，使用馏分收集器在4℃收集70滴馏分（图2）。
20. 使用洗脱缓冲液以10滴/秒的流速洗脱ST II熔融的recHPL，使用馏分收集器在4℃下收集22滴馏分。
21. 使用96孔微量培养板，微孔板分光光度计（DS Pharma Biomedical）和软件Gen 5在室温下在280nm处测量200μl级分的吸光度。
22. 将具有对应于洗脱蛋白的高A280读数的级分合并，并将洗脱的峰级分保存在-80℃的15ml管中。＆nbsp;
  
  图2.通过Strep-Tactin-Sepharose柱分离recHPL。 A.在Strep-Tactin-Sepharose柱上的亲和层析谱（Schmidt 等，。，1996）。从箭头所示的级分开始洗脱，并在洗脱体积19-26ml下获得峰。柱体积：1.9ml（即，7mm×50mm），流速：10s / drop，温度：4℃。 B.RecHPL-ST II的SDS-PAGE和Western印迹分析。从左侧泳道，“CBB”显示CBB染色的12％聚丙烯酰胺凝胶。 “抗HPL”显示用3％BSA封闭的电印迹PVDF膜，并使用一抗，抗脂肪酶抗体（1：3,000）在室温下染色1小时，并且二抗，HRP缀合的山羊抗兔抗体（1：5,000）在室温下1小时，然后使用ECL试剂（GE Healthcare）显色。 1，标记蛋白质; 2，来自包涵体的溶解蛋白质; 3和4，在Strep-Tactin-Sepharose柱上纯化的recHPL-ST II。
RecHPL的重新折叠（图3）

图3.重新分离recHPL的程序＆nbsp;
1. 解冻冷冻洗脱的峰级分并在室温下测量280nm处的吸光度。
2. 在峰值级分中加入尿素至终浓度为8M至7-12ml的纯化的0.1-0.2mg / ml recHPL。
3. 加入2 M DTT至终浓度为10 mM。
4. 在37°C孵育2小时，同时以约100 rpm的速度搅拌。
5. 对300ml重折叠缓冲液透析，该缓冲液含有在4℃下逐步降低尿素浓度（6M和4M）2小时。
6. 在4℃下对300ml含有2M尿素的重折叠缓冲液透析过夜。
7. 对300ml重折叠缓冲液进行透析，该缓冲液含有在4℃下逐步降低尿素浓度（1M和0.5M）2小时。
8. 在4℃下对含有0M尿素的300ml重折叠缓冲液透析1小时。
9. 在21,000 x g 离心5分钟，收集上清液，在4°C下去除蛋白质聚集体。
recHPL的纯化（图4）
注意：储存所有试剂并在4°C下执行所有程序。
1. 将重折叠的recHPL的上清液加入到具有超滤盘（10kDa NMWL）的Amicon TM Bioseparations Stirred Cell中。
2. 使用搅拌的细胞将recHPL浓缩2-10倍。
3. 通过GL chromatodisc0.45μm过滤浓缩的recHPL（GL Science，25N）
4. 通过0.45μm的醋酸纤维素膜过滤器过滤FPLC的运行缓冲液。
5. 将1ml重折叠的recHPL注入HiPrep 16/60 Sephacryl S-200HR柱（柱体积：120ml）中，用AKTA Purifier FPLC系统上的运行缓冲液以0.5ml / min的流速预平衡。
6. 用180ml运行缓冲液以0.5ml / min的流速洗脱柱子，收集2ml级分。
7. 测量280nm处级分的吸光度，并储存约5个级分（每2ml）的第二个峰作为活性recHPL。
8. 使用pH-stat AT-510自动滴定用10mM NaOH释放的脂肪酸，使用三丁酸甘油酯作为底物确定recHPL的脂解活性（Kawaguchi 等人，2018）。
  
  图4.通过凝胶过滤FPLC纯化活性recHPL。 recHPL在尺寸排阻方面的洗脱曲线。将重折叠后的RecHPL加载到HiPrep 16/60 Sephacryl S-200柱（柱体积：120ml）上，并使用含有400mM L-Arg的10mM TBS以0.5ml / min的流速在4℃洗脱。通过使用UPC-900监测器和AKTA纯化器测量280nm处的吸光度来检测蛋白质峰。从1L培养物中获得活性recHPL-ST II（1.8-6mg），其比活性为1.2-1.9kU / mg。使用在1ml反应缓冲液中乳化的0.11M三丁酸甘油酯作为底物测量级分的比活性。进行含有过量，0.5μg/50μl的脂肪酶的测量。添加通过图4中的凝胶过滤FPLC（0.5μg/50μl）洗脱的各级分后，使用自动电位滴定仪pH-stat AT-510（Kyoto Electronics Manufacturing）在37℃的反应温度下记录NaOH消耗量。有限公司。）。一个单位定义为每分钟释放1.0μmol游离脂肪酸的酶量。

数据分析

通过考马斯染色和使用抗脂肪酶抗体（Abcam，ab96100）的蛋白质印迹验证蛋白质表达。使用UNICORN软件记录色谱图。 Gen 5软件用于酶标仪的数据收集和分析。 pH-stat AT-510由AT-Win软件控制。

笔记

在乙醇中制备0.2M PMSF储备溶液，并在使用前稀释至缓冲液。
在补充有8M尿素，1％Triton X-100或1％SDS的TBS的比较中，含有8M尿素的TBS是从 E溶解recHPL-ST II的最有效方法。大肠杆菌裂解液。
Strep-Tactin-Sepharose柱是使用重力移动溶剂的开放柱。流速由色谱柱顶部的静水压力和色谱柱底部的活塞控制。
除了8M尿素和10mM DTT的变性过程外，所有分离，重折叠透析和recHPL纯化的过程都应在4℃下进行，这必须在37℃下进行。＆nbsp;
加入L-Arg对recHPL-ST II的重折叠显示出显着的效果，导致高产率，这必须归因于L-Arg抑制recHPL-ST II的聚集。

食谱

LB琼脂平板
20克/升LB肉汤基地
15克/升bacto琼脂
高压灭菌器在121°C，2.6巴下进行20分钟灭菌加入氨苄青霉素（100μg/ ml），将培养基倒入无菌培养皿中
LB媒体
20克/升LB肉汤基地
高压灭菌器在121°C，2.6巴下进行20分钟灭菌
缓冲区A
10mM Tris-HCl（pH 8.0）
150 mM NaCl
1 mM EDTA
裂解缓冲液
10mM Tris-HCl（pH 8.0）
150 mM NaCl
1 mM EDTA
0.5％Triton X-100
缓冲区A *
10mM Tris-HCl（pH 8.0）
150 mM NaCl
1 mM EDTA
8 M尿素
1 mM PMSF＆nbsp;
等效缓冲区
10mM Tris-HCl（pH 8.0）
150 mM NaCl
400 mM L-Arg
1 mM EDTA
1 mM PMSF
洗脱缓冲液
10mM Tris-HCl（pH 8.0）
150 mM NaCl
400 mM L-Arg
1 mM EDTA
1 mM PMSF
2.5mM脱硫生物素
重塑缓冲区
10mM Tris-HCl（pH 8.0）
150 mM NaCl
10％甘油
2.5 mM CaCl 2
1 mM PMSF
1 mM半胱氨酸
0.1 mM胱氨酸
400 mM L-Arg
尿素浓度：6M，4M，2M，1M，0.5M和0M尿素
运行缓冲区
10mM Tris-HCl（pH 8.0）
150 mM NaCl
400mM L-Arg
反应缓冲液
1 mM Tris-HCl（pH 7.5）
4 mM牛磺酸脱氧胆酸钠
100 mM NaCl
5mM CaCl 2，

致谢

我们衷心感谢大和证券健康基金会（HO）和日本应用酶学基金会（HO）对研究基金的支持。我们衷心感谢Suusuki Yusuke教授，Chihiro Tomita女士，Rina Naradate女士，Tomoko Higami女士，中村康介博士和Hiromi Sakagami女士协助这项工作。我们感谢K. Ono女士的英文编辑。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

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Kawaguchi，N.，Date，K.，Suzuki，Y.，Tomita，C.，Naradate，R.，Higami，T.，Nakamura，K.，Aikawa，K。和Ogawa，H。（2018）。从大肠杆菌中制备活性重组人胰脂肪酶的新方案。 J Biochem 164（6）：407-414。
Lowe，M。E.和Whitcomb，D。C.（2015）。下一代胰酶替代疗法：重组微生物酶，寻找完美的脂肪酶。 Gastroenterology 149（7）：1678-1681。
Schmidt，G.，Koepke，J.，Frank，R。和Skerra，A。（1996）。 Strep-tag亲和肽与其同源靶标链霉抗生物素蛋白之间的分子相互作用。 < em> J Mol Biol 255：753-766。
Seyedan，A.，Alshawsh，M。A.，Alshagga，M。A.，Koosha，S。和Mohamed，Z。（2015）。药用植物及其对胰脂肪酶的抑制活性：综述。 Evid基于补充Alternat Med 2015：973143。
Sharma，R.，Chisti，Y。和Banerjee，C。（2001）。脂肪酶的生产，纯化，表征和应用。 Biotechnol Adv 19：627-662。
Thirstrup，K.，Carriere，F.，Hjorth，S.，Rasmussen，P.B.，Woldike，H.，Nielsen，P.F。和Thim，L。（1993）。昆虫细胞中表达的人胰腺脂肪酶的一步纯化和表征。 FEBS Lett 327（1）：79-84。
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