材料和试剂

玻璃载玻片（Micro Slides，VWR，目录号：48311-703）
盖玻片（IMEB，目录号：CG1-2450）
Wistar大鼠（ Rattus norvergicus albinus ），250-300 g，90-100天大
石蜡（Fisher Scientific，目录号：AC416770020）
氯胺酮盐酸盐（Sigma，目录号：K113）
盐酸甲苯噻嗪（Sigma，目录号：K4138）
甲醛（Fisher Scientific，目录号：SF100-4）
乙醇（Fisher Scientific，目录号：BP2818100）
二甲苯（Fisher Scientific，目录号：X3S-4）＆nbsp;
基于二甲苯的封固剂（Source Mount，目录号：9277722）＆nbsp;
苏木精（默克，目录号：517-28-2）
钾明矾（默克，目录号：7784-24-9）
氧化汞（默克，目录号：21908-53-2）
Eosin（默克，目录号：15086-94-9）
Phloxine B（默克，目录号：18472-87-2）
乙酸（默克，目录号：64-19-7）
磷酸氢二钠（默克，目录号：7558-79-4）
磷酸二氢钠（默克，目录号：7558-80-7）
磷钨酸水合物（默克，目录号：12501-23-4）
Chromotrope 2R（默克，目录号：4197-07-4）＆nbsp;
快速绿色FCF（默克，目录号2353-45-9）＆nbsp;
Harris苏木精（参见食谱）
伊红（股票解决方案）（见食谱）
曙红phloxine（见食谱）
10％缓冲甲醛（见食谱）
Gomori（见食谱）

设备

数显卡尺（Digimess，King Tools，目录号：502.150BL）
脱毛机（Wahl和Toshico）
镊子14厘米（Golgan，Fibracirúrgica，目录号：003439）
Straight Metzenbaum Scissors（WPI，目录号：501747）
8毫米直径圆形活检穿孔器（Kruuse，目录号：273693）
10毫米直径圆形活检穿孔器（Integra Miltex，目录号：12-460-406）
LEICA ®手动切片机（LEICA，型号：M2125RT）
带高清摄像头的三目显微镜（LEICA，型号：DM500）
组织浴（Lupetec，型号：BH2015）

程序

大鼠切除皮肤伤口（图1）
1. 用氯胺酮和甲苯噻嗪（分别为20 mg / kg和100 mg / kg）的混合物肌内注射或按照当地伦理委员会的要求麻醉动物。
2. 剃除背部区域，使用8 mm直径的圆形活检穿孔器（伤口之间的距离应约为1.5 cm）从皮肤上轻轻移除两个碎片。
  注意：应小心处理此程序，以免损伤皮肤下的肌肉层。
3. 使用数字卡尺立即测量伤口区域，并在创伤后第3天，第7天，第14天和第21天重复该过程。
  注意：这个时间过程几乎与皮肤愈合过程的各个阶段相对应。
  
  图1.大鼠皮肤创伤。 A.直径8毫米的活组织检查。公元前。从背部皮肤上取下两个碎片。 D.使用数字卡尺测量伤口面积。＆nbsp;
伤口的组织学评估
1. 在伤口创建后第3,7,14和21天对动物实施安乐死。此程序必须与当地伦理委员会批准的协议一致。
2. 使用10毫米冲头收集皮肤碎片。它应该覆盖整个伤口区域。
3. 立即将皮肤碎片固定在10％缓冲甲醛中。在固定溶液中6小时后，使用剃刀将组织切成两半并将组织保持在固定溶液中24小时。如图2所示，确定所有伤口（颅骨或后侧方向）的切割方向至关重要。
  注意：对于长期储存，24小时后将片段转移至70％乙醇。
4. 使用常规程序处理石蜡包埋组织（脱水，清除和蜡渗透）。
  1. 脱水
    90％乙醇：30秒
    100％乙醇I：30秒
    100％乙醇II：30秒
  2. 清算（透明化）
    Xylol I：30秒
    Xylol II：30秒
  3. 在59°C的调节烘箱中进行蜡渗透（包埋在石蜡中）
    石蜡I：30秒
    石蜡II：30秒
  4. 嵌入
    渗透的组织应放入基模中，皮肤切面朝下（图2C）。
  图2.切割和包埋伤口组织。 A.切割石蜡渗入组织; B.切割表面; C.将裂开的表面组织放置在基模中; D.蜡块。
5. 石蜡包埋组织的切片
  1. 将蜡块放在切片机上，使其表面平行于刀片。＆nbsp;
  2. 切割厚度约4-5μm的切片。
  3. 用镊子取出切片的纸巾，然后转移到39°C的水浴中。
  4. 使用载玻片拍摄浮动部分（图3）。
  5. 载玻片可以直立的方式存放在机架中，然后在烤箱中烘干，但不要超过65°C。
  图3.使用切片机的切片程序。：一种。手动切片机和组织浴。 B.放置并调整蜡块。 C.用干净且识别出的载玻片收集切片的组织。
6. 苏木精和伊红（H＆amp; E）和Gomori的三色染色
  1. 苏木精 - 伊红染色
    参见制备溶液（食谱）：Harris苏木精和伊红ε-
    技术： class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>二甲苯I和二甲苯II
    每个5分钟
    100％乙醇
    1分钟
    90％乙醇
    1分钟
    70％乙醇
    3分钟
    用蒸馏水冲洗
    1分钟
    苏木素
    30秒到1分30秒
    自来水
    10分钟
    曙红phloxine
    1-3分钟
    70％乙醇
    数10次
    90％乙醇
    数10次
    100％乙醇我
    1分钟
    100％乙醇II
    1分钟
    二甲苯我
    3分钟
    二甲苯II
    3分钟
  2. Gomori三色染色
    class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：500px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>二甲苯I和二甲苯II
    每个5分钟
    100％乙醇
    1分钟
    90％乙醇
    1分钟
    70％乙醇
    3分钟
    用蒸馏水冲洗
    1分钟
    Harris Hematoxylin
    30秒到1分30秒
    用自来水冲洗
    10分钟
    Gomori三色染料
    15-20分钟
    用含0.5％乙酸的蒸馏水冲洗
    2分钟
    95％乙醇I
    数10次
    95％乙醇II
    1分钟
    100％乙醇我
    1分钟
    100％乙醇II
    1分钟
    二甲苯我
    3分钟
    二甲苯II
    3分钟
7. 对形成的新组织以及在稍后的时间点对形成的瘢痕组织进行形态学分析。应评估每个切片的六个视野以包含边界（完整结缔组织与形成的结构之间的边界区域）和伤口或瘢痕的中心。对于每个参数，分析五个切片。＆nbsp;
8. 定性组织学研究应该通过使用每个参数的特定分数分析染色组织来进行，如下所述：
  炎症
  使用10倍物镜评估HE染色切片中的细胞浸润（多形核和单核）（表1和图4）。
  
  表1.切除大鼠伤口的H＆amp; E染色组织切片中炎症的形态学评分
  
  图4.用H＆amp; H染色的切片的代表性显微照片。 E显示炎症评分。得分0：皮肤;分数1：第21天和第14天的伤口;得分2：在第7天，得分3：在第3天。根据愈合时间，由不同浓度的黑色和黄色箭头指示炎性细胞。 A.比例尺：200μmB。比例尺：50μm。
  
  结痂
  通过使用4x物镜的HE染色切片分析评估伤口组织中形成的痂的量（表2和图5）。
  
  表2.切除大鼠伤口的H＆amp; E染色组织切片中结痂的形态学评分
  
  图5.H＆amp; E染色切片的代表性显微照片，显示痂的评分。得分0：第21天;得分1：在第14天，得分2：在第7天或第3天，得分3：在第3天或第7天。比例尺：500μm。
  
  细胞外基质沉积
  使用10倍物镜评估Gomori三色染色切片中沉积的细胞外基质的量和胶原纤维的厚度（表3和图6）。
  
  表3.切割大鼠伤口的Gomori三色染色组织切片中细胞外基质沉积的形态学评分
  
  图6. Gomori三色染色切片的代表性显微照片，显示细胞外基质沉积的评分。评分0：皮肤;得分1：第3天;得分2：在第7天，得分3：在第14天和第21天。比例尺：200μm。
  
  血管化
  使用40x物镜评估HE染色切片中形成的新组织中的血管数量（表4和图7）。
  
  表4.切除大鼠伤口的H＆amp; E染色组织切片中血管形成的形态学评分
  
  图7.H＆amp; E染色切片的代表性显微照片，显示血管化评分。评分0：整个皮肤;分数1：第21天;得分2：在第14天，得分3：在第3天和第7天。比例尺：50μm。
  
  上皮化
  使用10x物镜评估HE染色切片中形成的新上皮层（表5和图8）。
  
  表5.切除大鼠伤口的H＆amp; E染色组织切片中上皮形态的形态学评分
  
  图8.H＆amp; E染色切片的代表性显微照片，显示伤口上皮化评分。评分0：在第3天;得分1：在第7天，得分2：在第14天，得分3：在第21天。比例尺：200μm。

数据分析

对于每个参数，使用来自分析的每个切片的得分的平均值来执行数据分析（图9）。

图9.健康Wistar大鼠伤口感染后第3,7,14和21天每个参数的可预测得分。炎症：它发生在愈合过程的开始，伴有血浆外渗，血小板聚集，凝块形成和炎性（多形核和单核）细胞募集到伤口部位。结痂：由细胞碎片，纤维蛋白和红细胞组成;当上皮舌上皮充满受损部位时仍然存在。细胞外基质沉积：在第二阶段，成纤维细胞负责产生胶原纤维并填充受损区域，以及白细胞和血管，形成肉芽组织。这些纤维将重塑和聚合，直到愈合结束，变得越来越密集和有组织。血管生成：伴随炎症和纤维组织增生阶段，在5-7天达到峰值。上皮化：在切除伤口中，这些细胞从受伤上皮的边缘向伤口中心离开，直到它们连接并覆盖上皮的整个部位（Balbino 等。，2005; Abbas et al。，2010; Moreira et al。，2015）。

笔记

为了再现性，伤口区域的测量必须在整个实验时间由单个观察者进行。
对于组织学分析，在收集伤口组织后，将伤口放在一张滤纸上以避免在固定过程中在10％缓冲甲醛中组织折叠。然后进行常规的石蜡包埋过程。
根据实验目标，瘢痕过程可在重塑阶段持续数月，能够在超过21天的时间点进行评估。
对于每个评分指示的图片对应于8mm的皮肤伤口，其在健康大鼠中自发地治愈。
见Castro-Souza 等。（2017）有关如何分析伤口区域的详细信息。
有关切除性皮肤伤口的详细信息，请参阅Moreira et al。（2015）。

食谱

哈里斯苏木精 class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>苏木素
5.0克
酒精96％
50毫升
钾明矾
100克
蒸馏水
1000毫升
氧化汞
2.5克
冰醋酸
4毫升
苏木精溶于酒精;将钾明矾溶解在热水中（不要煮沸）;混合两种解决方案;快速煮沸（1分钟）;慢慢加入氧化汞;让它慢慢变成紫色;取出加热，放入冷水浴中;加入醋酸;使用前，请存放在琥珀色的瓶子中并过滤
伊红（股票解决方案） class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Eosin Y
1.0克
蒸馏水
100毫升
Eosin Phloxine class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>含水曙红1％
100毫升
乙醇95％
780毫升
Phloxine B在蒸馏水中1％
10毫升
冰醋酸
4毫升
10％缓冲甲醛
磷酸盐缓冲液，0.2M，pH7.2-7.4 class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：500px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Na 2 HPO 4 （磷酸氢二钠）
11.155克
NaH 2 PO 4 磷酸二氢钠）
2.767克
蒸馏水
400毫升
调节pH值并将音量调到
500毫升
37％甲醛
100毫升
磷酸盐缓冲剂
900毫升
莫里 class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：500px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Chromótrope2R
0.6克
快速的绿色FCF
0.3克
磷钨酸水合物
0.8克
冰醋酸
1.0毫升
蒸馏水
100毫升

致谢

这项工作得到了Conselho Nacional de Pesquisa / CNPq，CoperdenaçãodeAperfeiçoamentodePessoaldeNívelSuperior/ CAPES，FundaçãodeAmparoàCiênciaeTecnologia de Pernambuco-FACEPE，ProgramadeBiociênciaDynamicda UFRPE，Recife，PE，Brazil的支持。 LRME持有CAPES PNPD奖学金; LSB和JEN持有CNPq研究奖学金。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿方面没有任何作用。

伦理

该项目提案得到了伯南布哥联邦农村大学动物伦理委员会的批准（许可证号57/2017）。在实验结束时，按照我们当地的机构动物福利委员会制定的指南对动物实施安乐死，制备和丢弃。

参考

Abbas，A.，Kumar，V.，Fausto，N（2010）。罗宾斯＆amp; Cotran -Patologia - 基地PatológicasdasDoenças。 8 a ed。里约热内卢：Elsevier。 1557p。
Balbino，C.A.，Pereira，L.M。和Curi，R。（2005）。伤口愈合机制：修订版。 R < em> ev Bras Cienc Farm 41（1）：27-51。
Castro Souza Junior Neto，J.，Estevao，LR，Baratella-Evencio，L.，Vieira，MG，Simoes，RS，Florencio-Silva，R.，Evencio-Luz，L。和Evencio-Neto，J。（2017）。用 Ximenia americana L 治疗的大鼠的肥大细胞浓度和皮肤伤口收缩。 Acta Cir Bras 32（2）：148-156。
Estevão，L.R.M.，Simões，R.S。，Cassini-Vieira，P.，Canesso，M.C。C.，Barcelos，L.D.S.，Rachid，M.A.，Camara，C。和Evêncio-Neto，J。（2017）。 Schinus terebinthifolius Raddi（Aroeira）叶油减轻皮肤伤口的炎症反应小鼠的愈合。 Acta Cir Bras 32（9）：726-735。
Moreira，C。F.，Cassini-Vieira，P.，Silva，M。F.和Barcelos，L.S。（2015年）。皮肤伤口愈合模型 - 切除伤口和病变区域评估。生物协议 5（22）：e1661。