材料和试剂

96孔板
200μlEppendorf管
LongAmp缓冲液（LongAmp Taq DNA聚合酶试剂盒）（New England Biolabs，目录号：M0323L），储存于-20°C
Taq LongAmp（LongAmp Taq DNA聚合酶试剂盒）（New England Biolabs，目录号：M0323L），始终保存并保存在-20°C
dNTP（dNTP组，Illustra TM ）（VWR，目录号：28-4065-57），稀释至2 mM并储存于-20°C
Tricine（Sigma-Aldrich，目录号：T9784），稀释至200mM并在4℃下储存
DTT（DL-二硫苏糖醇）（Sigma，目录号：D-0632），储存在4℃
NaOH（储备溶液：1M）
TBE缓冲液（1x）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：15581044）
琼脂糖（Agarose DNA Pure Grade，VWR，目录号：443666A）
PCR纯化试剂盒（用于PCR纯化的AMPure XP，Beckman Coulter，目录号：A63882）
引物组1（5042f-1424r）（Integrated DNA Technologies，稀释至10μmol，等分并储存于-20°C）
正向引物：5'-AGC AGT TCT ACC GTA CAA CC-3'
反向引物：5'-ATC CAC CTT CGA CCC TTA AG-3'
引物组2（528f-5789r）（Integrated DNA Technologies，稀释至10μmol，等分并储存于-20°C）
正向引物：5'-TGC TAA CCC CAT ACC CCG AAC C-3'
反向引物：5'-AAG AAG CAG CTT CAA ACC TGC C-3'

注意：选择这两个引物组（第12和13项）是因为它们能够扩增mtDNA的大片段并在扩增Rho Zero细胞时检测为阴性，表明它们没有扩增核基因组中的NuMTS。通过进行掺入实验，还评估了这些引物组在低频异质调用中的表现，并且显示出对低频变体的更好估计（Zambelli等，2017）。

Qubit TM dsDNA宽范围检测试剂盒（Invitrogen TM ，目录号：Q32853）＆nbsp;
乙醇（80％）
Tris-HCl溶液（10 mM，pH 8.0）
文库制备试剂盒（KAPA HyperPlus试剂盒，罗氏，目录号：07962436001）
破碎试剂盒（HS NGS Fragment Kit，Agilent，目录号：DNF-474）
吐温20（西格玛奥德里奇，目录号：P9416）
MPS试剂盒（NovaSeq6000 S2试剂盒[200个循环]）（Illumina，目录号：20012861）
凝胶电泳（见食谱）
碱性裂解缓冲液（见食谱）
EBT（带Tris的洗脱缓冲液）缓冲液（见食谱）

设备

琼脂糖凝胶电泳仪
电源（Electrophoresis Power Supply-EPS 301）（GE Health Care，目录号：18113001）＆nbsp;
热循环仪（Veriti TM 96-Well，Applied Biosystems，目录号：4375786）
磁铁
Qubit荧光定量（Invitrogen TM ，目录号：Q33238）
片段分析仪（安捷伦以前的高级分析技术，安捷伦， https://www.aati-us的.com /乐器/片段分析器/ ）＆NBSP;
测序系统（例如，NovaSeq6000，Illumina，目录号：20012850）

软件

bcl2fastq转换软件v2.19脚本（Illumina， http：/ /emea.support.illumina.com/downloads/bcl2fastq-conversion-software-v2-19.html ）
Seqtk（ https://bioconda.github.io/recipes/seqtk/README.html）＆NBSP;
BWA-MEM＆NBSP;
GATK v3.3（Broad Institute， https://software.broadinstitute.org/gatk/ ）＆nbsp ;
GATK v3.6 Mutect2（Broad Institute， https：// software。 broadinstitute.org/gatk/documentation/tooldocs/3.7-0/org_broadinstitute_gatk_tools_walkers_cancer_m2_MuTect2.php ）
Mpileup（SAMtools， http://samtools.sourceforge.net/mpileup.shtml ）＆nbsp;
mtDNA服务器（ https://mtdna-server.uibk.ac.at/index.html < / A>）
MitoWheel（ http://mitowheel.org/mitowheel.html ）
MitImpact（ http://mitimpact.css-mendel.it/ ）
MutPred2（ http://mutpred.mutdb.org/ ）

程序

提取大量DNA：从感兴趣的样本中提取DNA。＆nbsp;
1. 样品可以是大量组织或细胞系。批量分析不需要特殊的试剂盒，例如，我们经常使用Qiagen的DNeasy试剂盒或苯酚/氯仿提取物，然后进行乙醇沉淀（Zambelli et al。，2018）。＆nbsp;
2. 对于单个细胞，我们借助立体显微镜在2.5μl碱性裂解缓冲液（200 mM NaOH和50 mM DTT）中在200μlEppendorf管中进行手动收集它们（Spits et al。，2006）并将它们储存在-20°C。在扩增之前，将单细胞在65℃温育10分钟以进行裂解，然后如步骤3中那样制备用于扩增。＆nbsp;
将DNA样品稀释至10 ng /μl的工作溶液（仅适用于大量DNA）。
准备主混合物如下：

* Tricine用于PCR反应，以缓冲单细胞收集中使用的碱性裂解缓冲液。
将45μl主混合物等分到PCR管中，加入5μl10ng /μlDNA进行批量处理。
注意：对于单细胞，将47.5μl预混液加入Eppendorf试管中，细胞收集在碱性裂解缓冲液中。
使用以下PCR程序：
1. 步骤1（引发）：在94℃下30秒
2. 步骤2（8个循环）：在94℃下15秒
  每个循环在64°C减去0.4°C 30秒（这是着陆步骤）
  在65°C下11分钟（对于引物组1）或在65°C下5分钟（对于引物组2）
3. 步骤3（22个循环用于大量; 27个循环用于大单细胞（人卵母细胞），37个循环用于其他单个细胞）：
  15°C在94°C
  在61°C下30秒
  在65°C下11分钟（对于引物组1）或在65°C下5分钟（对于引物组2）
4. 步骤4（最终）：在65℃下11分钟（对于引物组1）或在65℃下5分钟（对于引物组2）
5. 步骤5：在4℃冷却步骤直至储存。
将扩增子保存在4°C（短期储存）或-20°C（长期储存），直至进一步处理。
通过运行凝胶电泳确认成功扩增（1％用于批量，1.5％用于单个细胞）（参见配方）。
在凝胶上每个样品加载9μl，并在80V下运行凝胶1小时。成功放大应如图1所示。

图1.与凝胶电泳显示的DNA梯子相比，两个引物组的成功扩增
使用AMPure珠子清洁样品如下。
注意：这通常是在96孔板中96批样品中进行的。
1. 将54μlAmpure珠加入30μl每种扩增子中（比例为1.8x）。
2. 通过上下吸移混合样品，并在室温下孵育样品5分钟。
3. 将样品放在磁铁上5分钟或直到溶液澄清。
4. 去除上清液而不打扰珠子。
5. 加入200μl乙醇（80％）。
6. 将样品在磁体上孵育30秒。
7. 去除上清液而不打扰珠子。
8. 重复步骤9e-9g。
9. 让珠子在室温下干燥5分钟。
10. 从磁铁上取下样品。
11. 加入30μlTris-HCl（10mM，pH8.0）并在室温下孵育样品2分钟。
12. 将样品放在磁铁上直至溶液澄清。
13. 将上清液转移到新的96孔板中。
根据制造商的说明使用Qubit定量样品的DNA浓度。
每个样品将引物组1和2的扩增子汇集在一起，并且为了保持均匀的覆盖率，扩增子需要以0.35 / 0.65的比例混合（引物组2产生的较短扩增子的35％和较长的65％）引物组1）产生的扩增子。在17.5μlTris-HCl（10mM，pH 8.0）中使用总共500ng DNA。
注意：每个扩增子也可以单独进行，总共500 ng。
使用KAPA HyperPlus Kit准备库，使用供应商指定的一半试剂量。这是总结的协议：
1. 准备碎裂混合物（在冰上）：
2. 涡旋破碎混合并旋转下来。
3. 将7.5μl片段化混合物加入17.5μl纯化的DNA样品中，并通过移液（在冰上工作）混合。
4. 将样品在热循环仪（加热至50°C的盖子）中孵育。
  在4°C下10分钟
  在37°C下15分钟
  将样品保持在4°C
5. 立即进行End Repair和A-tailing。
6. 准备最终修复和A-tailing混合如下：
7. 通过涡旋和旋转混合末端修复和A尾混合物。
8. 向片段化DNA中加入5μlEndRepair和A-tailing mix。
9. 将样品在热循环仪中孵育（将盖子置于85°C）。
  在65°C下30分钟
  将样品保持在4°C。
10. 立即进入结扎步骤。
11. 按如下方式准备结扎混合物：
12. 通过上下移液混合结扎混合物。
13. 将20μl连接混合物加入30μlEndRepaising和A-tailed DNA中。
14. 每个样品添加一个独特的适配器：5μl7.5μMIlluminaTruSeq Unique Dual（UD）索引适配器。
  注意：这些适配器可以由寡聚物供应商（例如，Integrated DNA Technologies）定制，或者可以作为试剂盒购买（例如，Illumina-TruSeq DNA UD Indexes的IDT）。请注意，大多数供应商提供15μM的现成适配器，而在此协议中，我们使用7.5μM。
15. 通过移液彻底混合。
16. 将样品在20℃下在热循环仪（无加热盖）中孵育15分钟。
17. 立即进行珠子样品清理。＆nbsp;
使用AMPure珠子清理库，如下所示：
1. 将44μlAmpure珠加入35μl文库中（比例为0.8x）。
2. 通过上下吸移混合样品，并在室温下孵育样品5分钟。
3. 将样品放在磁铁上5分钟或直到溶液澄清。
4. 去除上清液而不打扰珠子。
5. 加入200μl乙醇（80％）。
6. 将样品在磁体上孵育30秒。
7. 去除上清液而不打扰珠子。
8. 重复步骤13e-13g。
9. 让珠子在室温下干燥5分钟。
10. 从磁铁上取下样品。
11. 加入27μlTris-HCl（10mM，pH8.0）。
12. 在室温下孵育样品2分钟。
13. 将样品放在磁铁上，直至溶液澄清。＆nbsp;
14. 将25μl洗脱液转移到新的96孔板中。
注意：这可能是一个停止点。将样品放入冰箱（4°C）中24小时，或长时间存放，保存在冰箱中（-20°C）。
大小 - 使用AMPure珠子选择库如下：
1. 向纯化的文库中加入75μl不含核酸酶的水。
2. 将50μlAmpure珠加入100μl文库中（比例为0.5x）。
3. 通过上下吸移混合样品，并在室温下孵育样品5分钟。
4. 将样品放在磁铁上5分钟或直到溶液澄清。
5. 将140μl上清液转移到新的96孔板中。
6. 将20μlAmpure珠加入140μl上清液中（比例为0.7x）。
7. 通过上下吸移混合样品，并在室温下孵育样品5分钟。
8. 将样品放在磁铁上5分钟或直到溶液澄清。
9. 去除上清液而不打扰珠子。
10. 加入200μl乙醇（80％）。
11. 将样品在磁体上孵育30秒。
12. 去除上清液而不打扰珠子。
13. 重复步骤14j-14I。
14. 让珠子在室温下干燥5分钟。
15. 从磁铁上取下样品。
16. 加入15μlTris-HCl（10mM; pH8.0）。
17. 在室温下孵育样品2分钟。
18. 将样品放在磁铁上直至溶液澄清。
19. 将13μl洗脱液转移到新的96孔板中。
注意：这可能是一个停止点。将样品放入冰箱（4°C）中24小时，或者长时间存放，将它们放入冰箱（-20°C）。
使用HS NGS片段试剂盒在AATI片段分析仪上通过电泳检查最终文库的质量（制备的文库的1/10稀释度）。成功库的一个例子如图2所示。

图2.通过AATI片段分析仪上的电泳显示成功制备的文库
根据供应商的说明使用Qubit量化所有样品。
使用平均大小（AATI片段分析仪上的涂片分析在200和1500碱基对之间）和Qubit浓度，计算获得的文库的摩尔浓度。使用下面的公式：
在EBT缓冲液中将所有文库稀释至2 nM。
通过组合每个2 nM库的相等体积来汇集所有样品。
将样品加载到您选择的Illumina平台上。对于Illumina NovaSeq6000，执行NovaSeq6000测序系统指南（文档1000000019358v11）中提到的文库变性。对于96个样品，使用NovaSeq6000 S2试剂盒（200个循环）的6％容量（匹配9μl2nM文库池的变性）。

数据分析

使用Illumina bcl2fastq v2.19脚本将基本调用（.bcl）文件解复用到.fastq文件。
使用'seqtk'工具从.fastq文件中随机提取150万次读取。
注意：这是为了减少读取次数，因为在步骤6中，较大的数字可能会导致计算问题。
将.fastq文件与参考基因组（NC_012920.1）对齐，并使用BWA-MEM生成.bam文件。
使用GATK v3.3重新插入插入和删除以及基本重新校准（从.bam到.bam）。
对于变体调用，请使用工具GATK v3.6Mutect2（从.bam到.vcf）。
注意：前面步骤1-5的代码可以在补充文件1 。＆nbsp;
将.bam文件上传到mtDNA服务器（ https://mtdna-server.uibk.ac。在/ index.html中）群组。
mtDNA服务器报告显示：
1. 异质变体（示例如图3所示）。
  
  图3.通过mtDNA服务器检测到的异质变体的报告
2. 同质变体（示例如图4所示）。
  
  图4. mtDNA服务器检测到的同质变体的报告
3. Haplogroup和其他单倍群的可能污染（图5中显示了一个例子）。
  
  图5. mtDNA服务器检测到的单倍群的报告
4. 覆盖图（示例如图6所示）。
  
  图6. mtDNA服务器提供的覆盖图示例
打开Mutect文件并按频率对变体进行排序。
1. 打开Mutect文件，然后按照图7所示的过程进行操作：
  
  图7.在Microsoft Office Excel中打开Mutect文件的顺序步骤。确保在步骤1中指示“分隔”并遵循标准设置。
2. 打开文件后，选择单元格J39下面的完整列，如图8所示。
  
  图8.打开Mutect文件并选择单元格J39下方的完整列时的布局
3. 通过选择“将文本转换为列”工具将所选区域转换为列，如图9所示。
  
  图9.将文本转换为单元格J39下面的完整列中的列
4. 按照以下设置完成转换，如图10所示。
  
  图10.完成从文本到列的转换的顺序步骤。确保在步骤1中指示“Delimited”，并且用分号作为分隔符指示分隔符“other”。请遵循步骤3中的标准设置。
5. 选择第39行中的所有行，并在“列L”中排序“最大到最小”，如图11所示。
  
  图11.第39行中所选行的示例以及第39行以下所有行中从最大到最小的排序示例＆nbsp;
6. <变体>选择L列中的0.015用于进一步分析。列K表示位置的正向和反向读数除以逗号。只考虑总读数（正向+反向）高于1000的变体（图12）。
  
  图12.黄色显示的细胞是考虑进一步分析的变体
交叉检查MuTect检测到的变体与mtDNA服务器变体的频率，并报告可能的插入/删除。
如果存在差异，请按如下方式计算覆盖文件给出的频率：
通过在 http://mitowheel.org/mitowheel.html。示例如图13所示。

图13. mitoWheel为7306位置提供的注释结果
如果变体位于蛋白质编码区，则在 http://mitimpact.css-mendel.it/。图14显示了一个例子。

图14.由MitImpact2提供的位置7306上导致氨基酸改变的变体的结果
通过上传 http://mutpred.mutdb.org/。图15中显示了一个示例。

图15.致病性预测因子MutPred2对MT-CO1基因中M468T和M468K的氨基酸变化的结果
某些地区被排除在分析之外。这些被排除的区域可以在Zambelli et al。，2018的补充数据中找到（ https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711（18）30224-8＃secsectitle0020 ）。

食谱

凝胶电泳
50毫升1x TBE缓冲液
0.5克琼脂糖
碱性裂解缓冲液
EBT（具有Tris的洗脱缓冲液）缓冲液
10mM Tris-HCl pH 8.5
1％吐温20

致谢

这项工作由Wetenschappelijke Fonds Willy Gepts（UZ Brussel），Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek（FWO，1506616N）以及Karen Sermon教授的Vrije Universiteit Brussel的Methusalem赠款资助。

利益争夺

没有。

伦理

在该协议中，我们仅使用人类mtDNA进行优化。所有捐助者都给出了知情同意书，所有与该议定书有关的研究都得到了当地道德委员会的批准。

参考

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Rohlin，A.，Wernersson，J.，Engwall，Y.，Wiklund，L.，Bjork，J。和Nordling，M。（2009）。用于检测镶嵌突变的平行测序：与四种诊断DNA筛查技术进行比较。 Hum Mutat 30（6）：1012-1020。
Spits，C.，Le Caignec，C.，De Rycke，M.，Van Haute，L.，Van Steirteghem，A.，Liebaers，I。和Sermon，K。（2006）。单细胞的全基因组多重置换扩增。 Nat Protoc 1（4）：1965-1970。
Ye，F.，Samuels，D.C.，Clark，T。和Guo，Y。（2014）。线粒体DNA研究中的高通量测序。 Mitochondrion 17：157-163。
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