材料和试剂

0.5毫升管（Bio PLAS，Inc。）
硅橡胶薄膜（道康宁公司医疗产品）
10μl移液器吸头（BioExpress）
1毫升注射器25 G（BD，Franklin lakes，NJ）
纱布垫2 x 2（Fisher品牌）
Betadine擦拭巾（Purdue Products，L.P。）
涂层Visorb未染色编织聚乙醇酸缝合线NSF-2 19 mm 3/8 30“（75 cm）
单丝聚酰胺缝合线（Redilon 5-0）（1公尺）18“（45 cm）
表达所需视蛋白的小鼠（杰克逊实验室）
凝血酶（MP Biomedical）
纤维蛋白原（Sigma）
甲苯噻嗪无菌溶液20 mg / ml Ana Sed Injection（AKORN）
盐酸氯胺酮注射液，USP 50 mg / ml（Hospira）＆nbsp;
乙醇（费雪）
CaCl 2 （Sigma）
纤维蛋白胶（见食谱）

设备

手术
1. Dumont镊子＃5（精细科学工具，目录号：11293-00）
2. 弹簧剪刀（精细科学工具，目录号：15008-08）
3. 手术剪刀（精细科学工具，目录号：14084-09）
4. 缝合钳（Fine Science Tools，目录号：11090-09）
5. 带缝线刀的针座（精细科学工具，目录号：12502-14）
6. 理发器（Braintree Scientific）
7. 加热垫或温水循环器（Braintree Scientific Gaymar TP500）
8. 手术刀和手柄
9. 手术显微镜（Wild Heerbrug Stereozoom）
10. 表夹（用于固定光纤电缆）
11. 2.5-10μl移液管
12. 玻璃珠消毒器（Braintree Scientific，目录号：GER 5287-120V和GER 5289）
13. -20°C冰柜
光遗传学和电生理学
1. 光遗传学贴片电缆（ThorLabs，目录号：M82L01）
2. 光纤耦合激光源和驱动器（ThorLabs）
  注意：
  1. 另外：我们制造了自己的激光二极管光源和驱动器，并在 http://web.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/hardware.html。
  2. 重要的是光源必须发出所使用的视蛋白波长的光。例如，我们使用蓝光（473 nM波长）激活通道视紫红质2.
3. 袖带电极（或其他电生理记录装置，如微通道神经接口）
  1. 硅橡胶管（实验室管材，目录号：508-006）
  2. 绝缘电线（CoonerWire，目录号：AS631）
  3. 柔性硅胶（道康宁，产品目录号：Sylgard®184）
4. 记录电极
  1. 细线，尺寸0.002 mm（California Fine Wire Company，MO＃M468240）＆nbsp;
  2. 无菌25 G针
5. 激光安全眼镜（ThorLabs，Inc。）
6. 银地线（A-M Systems，Inc。）
7. 电刺激器和刺激隔离装置：
  1. 低噪声6通道电生理放大器（图2A）
  2. 光隔离前置放大器级（图2B）
  3. 线性光伏光电耦合器（IXYS Integrated Circuits，目录号：LOC111）
  4. 电隔离电源模块（CUI，目录号：VWRAS2-D5-D12）
  5. 前置放大器仪表放大器（Analog Devices，目录号：AD8421）
  注意：我们使用内部设计和制造的低噪声6通道电生理放大器。这些使用光学隔离的前置放大器级。隔离由每个通道的线性光电耦合器（IXYS集成电路，LOC111）和电流隔离电源模块（CUI，VWRAS2-D5-D12）提供。光学隔离破坏了接地环路，可实现极低的噪声记录。前置放大器仪表放大器（ADI公司，AD8421）具有3.2nV /√Hz的电压噪声。后续放大器级具有0.1-300 Hz的可选高通滤波，1-30 KHz的低通滤波和50至1,000的增益。有关电生理学初创企业的深入资源，请参见 www.open-ephys.org/ 。
  
  图2.电生理学装备和软件。 A.使用六通道AC放大器的前面板。每个通道都有单独的增益控制，低通和高通滤波器以及偏移。 B.光隔离头级放大器单元为每个通道启用双极性输入和公共参考。 C.用于获取电生理数据的定制Labview®软件的前面板。

软件

Labview ®（National Instruments）
注意：其他软件在商业上可用于运行光遗传硬件（例如，ThorLabs）。
数据采集和激励计划
我们的数据采集和激励计划是使用National Instruments的Labview®编程语言在内部开发的。该程序监测神经或肌电图/神经电图（EMG / ENG）活动的输入通道之一的持续活动。这显示在前面板的左侧（图2C）。当活动的平均值落入用户定义的电压窗口20 ms内时，刺激输出到线束电极或光学设备（LED或激光脉冲），并在给定时间段内记录数据，写入光盘并显示在前面板右侧的窗口中（图2C）。然后可以如下所述离线分析数据。

程序

袖带电极的构造（图3A）（~2天）
1. 在第1天，切割两个12英寸长的Cooner线。从Cooner电线的尖端剥去6 mm的绝缘层。＆nbsp;
2. 切割一个0.5英寸长的Silastic管。通过管道纵向切开一个狭缝。
3. 将Cooner线穿过管壁。将电线的尖端缠绕在自身周围以形成结。两根外露的导线应在Silastic管的内部部分间隔约2 mm。＆nbsp;
4. 对于在Silastic管外部暴露（未绝缘）的任何部分电线，涂上柔性硅胶并使其干燥过夜。
5. 在第2天，修剪硅橡胶管，使袖带的整个长度约为1厘米。
细线电极的构造（图3B）（每个电极约30分钟）
1. 切两根12英寸长的0.002毫米细线。＆nbsp;
2. 将两段细线穿过无菌25 G针头。＆nbsp;
3. 用手术刀轻轻刮去细线尖端的绿色绝缘层，露出约1.5毫米的电线作为电极。折叠去绝缘的电线，在针尖处形成“钩子”。交错尖端，使两根导线的去绝缘部分不相互接触。
4. 在细线的远端长度上，轻轻刮掉约1厘米的绿色绝缘层。此端将连接到前置放大器。
  
  图3.记录和刺激电极。 A.用绞合不锈钢微丝制成的袖带电极。箭头指向围绕硅橡胶管内表面圆周的去绝缘电线。 B.细线EMG电极。 C.袖带电极的全视图。
坐骨神经轴突神经元的光学激活
1. 用热珠消毒器械（约250°C，持续2-3秒）。
2. 用腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠（氯胺酮盐酸盐，80mg / kg [McKesson，Memphis，TN，USA];甲苯噻嗪，10mg / kg [AnaSed Injection，LLOYD Laboratories，Quezon City，Philippines]）。基于小鼠重量，注射体积通常为0.1cc至0.25cc。
3. 夹住整个后肢的皮毛。
4. 用聚维酮碘和乙醇清洁手术部位三次。
5. 在大腿后部皮肤上做1英寸的皮肤切口，露出覆盖坐骨神经的腿筋肌肉。＆nbsp;
6. 在筋膜平面上轻轻划开腿筋肌肉，露出坐骨神经。
7. 将细线针电极插入腓肠肌（图4A和4B）。将电极放在每只动物的共同位置（神经损伤后肌肉会明显萎缩）。
8. 将袖带置于坐骨神经周围（图4B），并用缝合线轻轻握住管道。
9. 放置光纤电缆，使尖端轻轻接触坐骨神经。图4A。使用夹子将电缆固定到位。注意夹子不会破坏光纤。
  可选：通过解剖神经外膜以分离胫骨和腓骨神经，可以选择性地刺激坐骨神经的特定分支（图4C）。＆nbsp;
10. 通过袖带电极施加约5V的0.1ms电脉冲刺激神经。脉搏可伴随可见的肌肉抽搐（以及由直接运动轴突刺激引起的M反应）。如果发生肌肉抽搐，但未记录诱发的EMG反应，请检查所有连接。
  
  图4.用于在小鼠中刺激和记录的解剖准备。 A.光缆的尖端与暴露的坐骨神经轻轻接触。 B.将袖带电极放置在坐骨神经周围。在A和B中，观察到绿色细线电极经皮插入侧腓肠肌。 C.用细镊子去除神经外膜，轻轻分离坐骨神经的分支。白色星号表示较大的胫神经分支，较小的腓总神经（腓骨）和腓肠神经分别在其上方和下方可见。黑色星号表示坐骨神经的一小部分，支配一部分腿筋肌肉。
11. 用最大光强度通过光纤传递的5 ms脉冲光刺激神经（见光输出注1）。肌肉抽搐（和直接M反应）应伴随脉搏（如果使用在运动神经元中表达ChR2的小鼠，例如，Thy1ChR2或Chat：ChR2）。＆nbsp;
12. 记录肌肉和神经对光刺激的反应。刺激应该不超过每三秒一次，以减少肌肉疲劳。
  注意：如果从神经进行记录，动作电位将沿着来自光源的神经两个方向传播。在其中ChR2表达限于感觉神经元的小鼠中，例如AvilCre：ChR2小鼠，不应存在肌肉抽搐（或直接M反应）。相反，电位只能从神经袖套电极记录为电神经图（图5A，右）。＆nbsp;
13. 在一系列刺激强度下进行电学和光学刺激，从最低强度（电压或光强度）开始逐渐增加，以确定50％刺激试验发生响应的阈值（电压或光强度）最大响应（Vmax）。例如，从0.1 V开始，将刺激强度增加0.1 V，直到达到Vmax。
14. 以大于获得最大M响应所需强度的光强度进行光学处理。最广泛使用的治疗范例是在20Hz下超大刺激1小时。
15. 进行神经横断和修复。
神经横断和修复
1. 切割一块（~3 mm x 3 mm）方形的Silastic薄片。
2. 用镊子将硅橡胶方块置于腓肠神经分支点附近的神经下方。
3. 将2.5μl纤维蛋白原与5μl凝血酶混合，并快速将此胶水混合物吸移到Silastic薄膜上的神经上。
4. 让纤维蛋白胶干燥。
5. 用镊子轻轻探测薄膜，确保神经固定在硅橡胶薄膜上。
6. 使用锋利的弹簧剪刀，将神经横切到薄膜上，并确保在神经最深处没有纤维保持连续性。
7. 在切断的神经上涂抹更多的纤维蛋白胶。
术后恢复和监测
一旦用缝线封闭所有伤口，应将动物放置在经认可的水浴调节加热垫上的干净恢复笼中，使笼子的一半加热，一半在环境室温下。应每15分钟监测一次动物，直至完全从麻醉中恢复，此时它们将被移入其收容间。不可吸收的皮肤缝线应从皮肤上移除~7-10天。从手术前体重减轻25％的体重被认为是动物虚弱的证据，并且应该获得关于安乐死的兽医咨询。

数据分析

在我们的实验中，记录刺激诱发的活动在刺激前20ms（被认为是背景活动）开始并在刺激递送后50ms结束。

原始信号被放大（1,000x）并带通滤波（100-1,000Hz）。
数据以10kHz采样。
对所研究的每个刺激强度的10-30次刺激呈现的响应进行平均。＆nbsp;
从记录中数字减去平均背景（刺激前）活动。
在用户定义的延迟窗口中测量诱发的EMG和ENG电位的平均全波整流电压（图5A，左：虚线）。

可以用几种方式分析使用光学诱发电位收集的定量电生理学数据。通过在一系列刺激强度（光学或电学）上比较相同潜伏期窗口中的EMG响应幅度，可以生成完整的运动补充曲线（图5B），并且可以确定激活和最大诱发反应的刺激阈值。如果预期神经元兴奋性发生变化，例如当使用抑制性视蛋白时（Jaiswal 等人，2018），可以将这种效应评估为刺激阈值的变化。使用放置在神经上的记录电极，可以使用视神经刺激来收集诱发的神经电图（Ward等，2018），并且可以进行类似的定量测量。当光学刺激神经中的感觉轴突时，所得的ENG测量（图5A，右）也可用于通过评估不同潜伏期窗口中的响应幅度来划分不同大小和传导速度的感觉轴突的响应。最后，如果在同一实验中收集电学和光学诱发数据，最大响应可以表示为光学/电学比率（Ward et al。，2016）并在不同的恢复时间进行分析与来自完整对照的数据相比（图5C）。

图5.分析定量电生理数据的方法示例 A.整流肌电图（左）或ENG（右）曲线产生若干可量化参数，包括潜伏期（从刺激开始到反应的时间，粗体双箭头），持续时间（从可检测的响应到虚线的时间）和响应幅度（mV）。受伤后，潜伏期和振幅减小，而持续时间增加。 B.缓慢增加的刺激强度的斜坡（电刺激时的电压;光学刺激时的亮度[mW / mm 2]）允许检测阈值（在50％的时间内引起响应所需的刺激强度）和最大响应。 C.在相同实验（左）内收集电和光学数据有助于区分由于电可兴奋（野生型和ChR2表达）神经元/轴突与由光学可兴奋（表达ChR2）神经元/轴突引起的反应引起的诱发反应。电和光诱发的M反应可以表示为比率（条形图右）以确定在损伤后不同时间成功再生的野生型和表达ChR2的比例。在条形图中，我们显示损伤后4周，由于经过光学处理的ChR2表达运动神经元与完整和未处理组的成功再生，出现最大M反应。

笔记

应该注意的是，如果处理不当或弯曲，光纤会破裂，并且可能由于散射而导致光输出减少。用眼睛看，减少量可能不明显。因此，我们建议使用适合所用光波长的光电二极管功率传感器（ThorLabs提供）定期测试光纤的光输出。＆nbsp;
有时在人类中使用延迟来告知临床医生他们正在记录的轴突类型（例如，C纤维与Aδ）。然而，在鼠标中，记录和刺激部位之间的可用距离非常小，并且不适合这种分析。
将有更多的光学工具和光遗传小鼠可供使用。对于三种基因型的小鼠，我们用通道视紫红质进行测试，引起响应所需的光脉冲持续时间变化。因此，我们强烈建议在应用作为治疗之前测试一系列光脉冲持续时间，或者产生光学数据作为结果测量。
在大多数Chat-ChR2-YFP小鼠中，在20Hz的光学处理期间，由光学刺激产生的观察到的M响应完全消散或消失。通道视紫红质的激活根本无法遵循这种光应用速率（Ward et al。，2018）。在较慢的光学刺激速率（例如，10Hz）下，可以可靠地诱发M响应。在这些动物中，在10HZ下施加光刺激但是持续2小时。其他人已经表明，刺激的绝对数量，而不是刺激的速度，是增强外周轴突再生的最关键参数（Park et al。，2015）。
我们最初尝试使用在管道内构造的发光二极管（LED）进行这些实验（类似于Michoud et al。，2018）。对焊点进行绝缘并经常测试它们是否漏电是至关重要的。用镊子处理LED袖带以及在焊点处发生的弯曲可能导致不希望的电流泄漏（以及神经的电刺激）。

食谱

纤维蛋白胶
1. 准备原液凝血酶
  1. 在45mM CaCl2中稀释5μl25U/ ml凝血酶
  2. 以50μl等分试样移取凝血酶
  3. 冷冻（-20°C）原液等分试样直至神经切断手术当天需要
2. 在神经横断手术当天，必须准备新鲜的纤维蛋白原。
  1. 称出50毫克纤维蛋白原
  2. 移取500μl无菌水到离心管中
  3. 将50mg纤维蛋白原添加到500μl无菌水中
  4. 用移液管尖轻轻搅动（不要摇动），直到纤维蛋白原溶解（3-6分钟）
  5. 解冻1个凝血酶等分试样。
  6. 以2：1的比例组合纤维蛋白原和凝血酶
  7. 立即应用于神经

致谢

该研究由NIH Grants NS057190，NS087915资助。特别感谢Olivia Mistretta和Bill Goolsby的贡献和持续的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有程序均经埃默里大学机构动物护理和使用委员会（协议＃2003261）批准，并符合“神经科学学会研究中动物使用指南”。

参考

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