材料和试剂

10 cm培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：172931）
15厘米培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：168381）
15毫升锥形管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339651）
40μm细胞过滤器（Argos Technologies，目录号：TC1040-A）
6孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：140675）
玻璃底盘（MatTek，目录号：P35G-1.5-14-C）
1毫升移液器
血清移液管
定时怀孕的小鼠胚胎
注意：神经和神经胶质祖细胞可以从胚胎日（E）13.5至E15.5胚胎中分离，这是一个发生早期和活跃神经发生的阶段。请注意，在此阶段，祖细胞在增殖扩增和细胞谱系分化之间迅速进化。因此，在不同胚胎的祖细胞之间进行比较的实验中从相似的发育时间点选择胚胎至关重要（例如，某些遗传模型，不同的治疗组）是不可避免的。
乙醇
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（赛默飞世尔科技，目录号：14025092）＆nbsp;
DMEM / F12（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330032）
胰岛素（Sigma，目录号：I0516）
N2补充剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：17502048）
B27补充剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：17504044）
上皮生长因子（EGF）（Peprotech，目录号：AF-100-15）
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（Peprotech，目录号：AF-100-18B）
DMSO（默克密理博中国，目录号：S-002-D）
Dulbecco的PBS（DPBS），无钙，无镁（赛默飞世尔科技，目录号：14190144）
Accutase（Thermo Fisher Scientific，目录号：A1110501）
血小板衍生生长因子AA（PDGF-AA）（Peprotech，目录号：AF-100-13A）
聚L-鸟氨酸（PLO）（Sigma，目录号：P4957）
层粘连蛋白（Thermo Fisher Scientific，目录号：23017015）
Dulbecco的PBS，钙和镁（Thermo Fisher Scientific，目录号：14040133）
神经生长培养基（NGM）（见食谱）
Oligosphere Medium（OM）（见食谱）

设备

移液器
微剪刀（Ted Pella，目录号：1346）
镊子（Ted Pella，目录号：525）
敷料钳（Ted Pella，目录号：5002-42）
解剖锋利/钝剪（Ted Pella，目录号：1329）
血球
离心分离机
倒置的活细胞成像系统，连接到具有受控温度的孵化器（温度模块）和CO 2 模块，例如EVOS TM FL Auto（Thermo Fisher Scientific）

软件

Chemotaxis软件（ibidt， https://ibidi.com/44-software-and-image-分析）
ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/index.html ）< br />

程序

小鼠神经干细胞（NSCs）的分离培养
1. 从E14.5小鼠脑中分离神经干细胞
  第1天
  1. 准备几个装有汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的10厘米培养皿，放在冰上。＆nbsp;
  2. 按照机构动物方案，使用二氧化碳对E14.5定时怀孕的小鼠实施安乐死。
  3. 用70％乙醇喷洒腹部以润湿毛皮，并使用标准解剖剪刀和敷料钳将Y形开腹（视频1）。
    
    视频1.用于NSC培养的小鼠皮质的分离
  4. 解剖子宫角之间的结缔组织和血管，取出子宫，放在装有冰冷HBSS的10厘米培养皿上。
  5. 使用微型剪刀（Ted Pella）和镊子（Ted Pella）将胚胎与胎盘分离，将胚胎转移到装有冰冷HBSS的新10cm培养皿中。
  6. 斩首，去除皮肤和颅骨，并在解剖显微镜下仔细收集胚胎大脑。
    注意：在10厘米培养皿下放置一个装有冰的15厘米培养皿，以保持胚胎冷却。
  7. 移除脑膜并隔离皮质，然后将皮质切成小块。
  8. 将组织转移到装有冰冷HBSS的15ml锥形管中，在4℃下以100μl/ g离心3分钟。
  9. 去除上清液，加入冰冷的神经生长培养基（NGM）（每个脑0.5ml），用1ml移液管研磨，然后在冰上孵育2分钟。
    注意：轻轻地通过1毫升移液管约20次，并避免在研磨过程中形成气泡。＆nbsp;
  10. 将细胞悬浮液通过40μm细胞过滤器以获得单细胞。用血细胞计数器或细胞/颗粒计数器计数细胞。
  11. 用NGM将具有NGM的单细胞悬浮液稀释至终浓度为每毫升5×10 4个细胞。
  12. 在每个6孔板中培养4ml（每毫升5×10 4个细胞）细胞。通常一个胚胎足以分离大约10个 6 总细胞。
  第2天
  1. 在第二天，通过将悬浮细胞转移到新的孔中，丢弃已附着到培养皿底部的分化细胞。
  第3-6天
  1. 每隔一天用新鲜NGM替换半培养基4-5天，以形成神经球。
    注意：小心地从培养箱中取出6孔板以避免干扰沉积在孔底部的神经球。使用P1000 piptetman从每个孔的顶部轻轻地移除2ml培养基，以避免在此期间意外抽吸神经球。丢弃去除的培养基并用预先加热至37℃的2ml新鲜培养基补充孔。在该步骤中，细胞可以在具有10％DMSO的NGM中冷冻保存。
2. 当球在显微镜下达到100-150μm的大小时，对神经球进行传代培养
  1. 使用血清移液管将具有培养基的神经球转移至15ml锥形管中，在100μL离心下离心1分钟。去除上清液。
  2. 将神经球重悬于5 ml Dulbecco's PBS（DPBS）中，不含钙和镁。
  3. 在100 x g 下离心1分钟。去除上清液。
  4. 在室温下加入1ml Accutase（Thermo Fisher Scientific）3-5分钟，然后用1ml移液管轻轻研磨直至看不到大的团块。
    注意：轻轻通过1 ml移液器约20次，避免形成气泡。
  5. 加入5ml NGM以中和Accutase，将管留在支架上5分钟以使剩余的细胞团块沉淀在底部，收集含有解离的单细胞的溶液用于细胞计数。在200-300 x g 离心4分钟。去除上清液。
    注意：在此步骤中，细胞可以在含有10％DMSO的NGM中冷冻保存。
  6. 用NGM重悬细胞至终浓度为每毫升2-3×10 4个细胞。将4ml细胞悬浮液转移到6孔板的每个孔中。
  7. 如步骤A1n所述，每隔一天用新鲜NGM替换半培养基，当球体达到100-150μm（通常3-4天）时，重复传代培养过程。
胶质祖细胞的诱导和培养
1. 从Oligosphere培养基（OM）中的神经球的第2至6代培养单细胞悬浮液2-3×10 4个细胞/ ml，以诱导胶质细胞谱系分化。
  注意：我们发现当使用神经球的单细胞悬液而不是使用未离解的神经球时，诱导效率更高。避免在培养基中加入睫状神经营养因子（CNTF）以防止星形胶质细胞谱系分化。＆nbsp;
2. 如步骤A1n所述，每隔一天用新鲜OM替换半培养基。
3. 每5-7天进行一次亚培养至少12天。此时球体应由> 95％的神经胶质祖细胞组成（Li et al。，2015）。
建立体外迁移试验
1. 制备聚-L-鸟氨酸（PLO）涂覆的玻璃底皿（MatTek）。
  1. 向玻璃底皿中加入200μlPLO溶液（Sigma）。将培养皿置于37℃的组织培养箱中1小时。
  2. 除去PLO溶液，让培养皿在组织培养罩上干燥5-10分钟。
  3. 用无菌水冲洗碗碟两次。
    注意：PLO涂层玻璃底盘可在室温下储存2周。
2. 将细胞接种到PLO涂覆的玻璃底盘上。
  1. 用无菌水稀释小鼠层粘连蛋白（Thermo Fisher Scientific）至终浓度为2μg/ ml。在玻璃底皿上加入150μl稀释的层粘连蛋白。将培养皿置于组织培养箱中1小时，然后除去层粘连蛋白，并在组织培养罩中用含钙和镁的DPBS冲洗培养皿一次。
  2. 在PLO /层粘连蛋白包被的培养皿底部加入100μlNGM。
  3. 使用10μl移液管在显微镜下小心地将100-150μm球体转移至PLO /层粘连蛋白涂覆的玻璃底皿。
    注意：我们通常会播种至少8个球体并同时成像6-8个球体。
  4. 让球体在37℃下在组织培养箱中连接到培养皿底部15分钟，然后小心地加入2ml预热的NGM。
    注意：通过慢慢地从盘子边缘添加NGM来避免干扰球体。
用于延时成像的显微镜设置
注意：这里我们演示如何使用Invitrogen EVOS TM FL自动成像系统和EVOS TM Onstage Incubator进行延时图像。有关显微镜安装和操作程序的详细信息，请参阅EVOS TM 用户手册。
1. 显微镜设置
  1. 打开EVOS TM FL倒置显微镜和连接的计算机，选择合适的平台支架，将环境室连接到显微镜，然后将加热软管和传感器电缆连接到环境室。＆nbsp ;
  2. 将水加到蓄水池的“最大填充”线上，然后打开Onstage Incubator以及空气和CO 2 水箱。＆nbsp;
  3. 打开EVOS TM FL Auto软件，将温度设定在37°C，湿度＆gt; 80％和CO 2 为5％。预热约2小时。
    注意：为防止水在物镜周围积聚，应在系统预热期间使用空盘/井。另外，请确保在实验过程中有足够的气体供应。
2. 活细胞成像
  1. 打开软件。选择10x物镜并打开Trans灯。
  2. 放置一个玻璃底盘，在舞台底部附有神经球。通过单击“添加信标”，选择大小介于100和150μm之间的6-8个神经球。
    注意：请确保碟子在舞台边缘紧密密封。任何空间都会让水蒸发，造成图像模糊并损坏物镜。
  3. 延时图像采集的持续时间约为2小时，捕获间隔为2分钟（对于在表面上涂覆20μg/ ml层粘连蛋白的细胞）。
    注意：对于统计分析，我们使用在2小时内每4分钟拍摄的图像。总成像持续时间部分取决于细胞迁移的速度。当层粘连蛋白的浓度低（例如，0.5μg/ ml）时，细胞迁移得更慢。因此，应相应调整延时成像的持续时间和间隔。

数据分析

在下一节中，我们将演示分析三种细胞运动参数 - 速度，速度和直线度的程序。此外，我们还将演示使用kymography评估前沿动态（图1）。

图1.神经和神经胶质祖细胞的细胞运动性分析的示意图。（A-B）在延时图像采集后，将图像堆叠加载到ImageJ上。（C-E）跟踪迁移细胞的路径。（F-H）在ibidi Chemotaxis软件中打开跟踪数据以进行绘图和分析。（I）将结果导出到电子表格以进行绘图和统计比较。

速度：速度是一个矢量，通过每次的位移来评估。＆nbsp;
1. 打开ImageJ（免费软件），单击“文件”下拉菜单中的“导入”，然后单击“图像序列”。选择包含定时图像的文件（视频2）。
  
  视频2. ImageJ设置迁移分析
2. 在“插件”下，单击“跟踪”，然后单击“手动跟踪”。设置参数与用于获取延时图像的参数相同。＆nbsp;
3. 选中“显示路径？”并单击“添加轨道”，然后沿其迁移路径标记感兴趣的单元格。跟踪详细信息将显示在新窗口中。
  注意：我们通常选择位于球体边缘的细胞，我们避免选择在迁移过程中进行细胞分裂的细胞。＆nbsp;
4. 再次单击“添加轨道”，并沿其迁移路径标记下一个感兴趣的单元格。通常跟踪来自每个神经球的至少六个细胞。以电子表格格式保存所有单元格的跟踪结果。
5. 打开ibidi Chemotaxis软件，单击导航栏中的“导入数据”以导入跟踪结果。
  注意：ibidi Chemotaxis是一款免费软件。请访问ibidi网站（ https://ibidi.com/44-software-and-image - 分析）并按照用户说明进行操作。
6. 设置参数与“启动”选项卡下用于获取延时图像的参数相同。单击“应用设置”。
7. 单击导航栏中的“绘图数据”。将弹出一个显示跟踪路径的窗口。
8. 单击导航栏中的“统计”，然后单击“速度”选项卡以显示速度结果。
速度：速度是标量，量化为每次的距离
1. 如果需要，重复步骤A1到A7。
2. 单击导航栏中的“统计”。单击“距离”可在新窗口中显示每个跟踪单元格的迁移距离。＆nbsp;
3. 粘贴并将结果保存到电子表格中。将距离除以总时间，以获得每个细胞的速度。
直线度：迁移的直线度可以称为ibidi趋化性的直接性。如果细胞在没有转动的情况下迁移，则直线度为1.另一方面，如果细胞继续转动，则直线度将接近0。
1. 如果需要，重复步骤A1到A7。
2. 单击“统计”窗口中的“直接性”以显示每个跟踪单元格的方向性。＆nbsp;
3. 将结果粘贴并保存到Excel中以进行进一步分析。
Kymography：kymograph是空间位置随时间的图形表示。 Kymography是一种在迁移过程中显示前沿动态的方法（图2和视频3）。

视频3. ImageJ的Kymography分析
1. 将相位对比图像导入ImageJ。
  注意：我们通常使用从20倍物镜（或更高）拍摄的图像进行Kymography分析。＆nbsp;
2. 使用线条工具在迁移单元格的边缘绘制线条。
  注意：该线应覆盖从延时图像的开始到结束的前沿的整个范围。
3. 在下拉菜单“插件”下，单击“Kymograph”，然后单击“KymographBuilder”。
  注意：另一种方法是从“图像”下拉菜单中单击“堆栈”，然后单击“Reslice”。
图2. Kymography分析的示意图。（A，B）在延时成像采集之后，将图像堆栈加载到ImageJ上。（C，D）沿着迁移前缘的轨迹绘制直线或分段线，然后通过使用KymographBuilder或Reslice函数获得kymograph。（E）在二维kymograph中，x轴表示前缘的距离，y轴表示时间。

食谱

神经生长培养基（NGM）
DMEM / F12具有以下补充剂和生长因子的最终浓度 1％N2
2％B27
20 ng / ml上皮生长因子（EGF）
20ng / ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）
添加EGF和bFGF后，NGM在4°C的保质期约为一周
Oligosphere Medium（OM）
DMEM / F12具有以下补充剂和生长因子的最终浓度 1％N2
2％B27
20 ng / ml上皮生长因子（EGF）
20ng / ml血小板衍生生长因子AA（PDGF-AA）
添加EGF和PDGF-AA后，OM在4°C的保质期约为一周

致谢

这项工作得到了儿童慈善儿童研究所的资助。

利益争夺

作者没有披露利益冲突。

伦理

堪萨斯大学医学中心动物护理和使用委员会批准了所有执行的方案（ACUP编号：2016 - 2，359，2016年8月16日 - 2019年8月1日）。

参考

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