材料和反应

1.5微腔管(定性科学塑料，目录编号509-GRD-Q)
0。22过滤器μm (Merk, Millex-GP PES,目录号:SLGP033RB)
核无核管道tips(优质科学塑料，目录编号:T104RLS-Q, T090RLS-Q，和t112nxlls - q)
甘露醇(AMRESCO，目录编号:0122-500G)
琥珀(AMRESCO，目录编号:0335-500G)
HEPES free acid (AMRESCO，目录编号0511-1KG)
钠十二烷基磺酸(SDS) (AMRESCO，目录编号0227-1KG)
EDTA，去骨盐，二氢盐(Na2EDTA·2H2O) (AMRESCO，目录编号:0105-1KG)
Agarose (BIOWEST, Regular Agarose G-10，目录编号:111860)
蛋白K (AMRESCO，目录编号:0706-100MG)
溴苯诺蓝(AMRESCO, ACS等级，目录编号0449-25G)
Tris (AMRESCO，目录编号0497-5KG)
冰川学酸性(北京化学制品，分析里根等级)
无核水(AMRESCO，目录编号:E476-1L)
Glycerol (AMRESCO，目录编号0854-1L)
KOH (Sigma-Aldrich，目录编号:P1767-500G)
双蒸馏水(ddH2O)
NaOH(钠水仙球团)(上海生物科技，目录编号:A100173)
Tween20 (AMRESCO，产品代码:07771 - 1l)
NaCl (AMRESCO，目录编号:0241-1KG)
PBS (Corning，目录编号:21-040-CVR)
鲁米诺/Enhancer解决方案。
(西格玛-奥尔德里奇，目录编号:G4045)
(细胞信号技术，目录编号2433S)
抗鼠鼠IgG(全分子)- Peroxidase (Sigma-Aldrich，目录编号:A0545)
预先确定的蛋白质梯度(热费雪科学，PageRuler，目录编号26616)
HEK293(卡拉·M·科勒在加州大学洛杉矶分校的实验室)
10%的SDS-PAGE凝胶(Homemade, refer to He, 2011年详细协议)
Skim milk powder (OXOID，目录编号:LP0031)
BSA (Sigma-Aldrich，目录编号:P3761)
米托普缓冲区(见模式)
10% (w/v) SDS(见模式)
0.5 M EDTA (pH 8.0)(见模式)
2x DNA-SDS-EDTA缓冲区(见模式)
蛋白K (1 mg/ml)(见模式)
50x TAE(见配件)
1x TBS-T(见模式)
蛋白质负荷缓存(见模式)

设备

Pipettes (RAININ, pipelite XLS)
两个燃烧块(杭州Allsheng仪器，产品名称:干巴斯incubator，目录编号:MK200-2)
NanoDrop仪器。
电力供应(Tanon，目录编号:EPS 300)
凝胶成像系统(Tanon，目录编号1600)
离心机
pH meter (Sartorius，目录编号:PB-10)
80度C冰柜
硝基纤维素膜(默克，目录编号:HATF00010)
垂直电泳(Tanon，目录编号:v -180)
玻璃/特氟隆homogenizer(惠顿，目录编号358034)
Incubator
第四冷却器
-20度

软件

Tanon成像(Tanon MP)和处理(Tanon GIS)软件
ImageJ
图形板棱镜5
微软PowerPoint 2010

程序

注意:在所有步骤中使用无核管和tips(材料和反应部分)

Crude mitochondria和ER isolation 注释:米托邦德的隔离方法从先前描述的协议(Wang et al.， 2015)中进行了调整，修改较少。在有机分离过程中，线粒体缓冲区的pH值是7.4，如果不指定。
1. 2分钟房间温度(RT)。卸载supernatant，并用1ml PBS替换细胞。旋转1000 x g 2分钟< / br / > 注释:HEK293细胞是15厘米细胞文化的文化。密度为90% ~3×107细胞是harvested
2. 将细胞固定在1.5毫升冷冻线粒体缓冲区，并将混合物转移到5毫升玻璃/特氟龙homogenizer在冰浴前冷却。在冰上打30杆。
3. 将匀浆移入1.5 ml微离心管，800 x g， 4℃离心5 min。将上清液转移到新的微离心管中。
4. 在1.5 ml MitoPrep缓冲液中复苏小球。在冰上划20下。将匀浆移入1.5 ml微离心管，800 x g， 4℃离心5 min。将上清液转移到新的微离心管中。
5. 在800 x g温度下，从Steps1c和1d旋转上清5分钟。
6. 将上清液转移到新的微离心管中，11000 x g， 4℃离心5min。由此产生的微丸是粗糙的线粒体。
7. 将上清液转移到两个新的微离心管中，在21,000 x g温度下，4℃旋转10分钟。这些球团矿比较粗。
8. 将线粒体或ER颗粒从两管中分离出来，在1 ml MitoPrep缓冲液中复苏。自旋11000 x g 5 min或21000 x g 10 min，分别自旋线粒体或ER。
9. 丢弃的上层清液和resuspend线粒体或ER 30μl MitoPrep缓冲区(pH值7.4)。< br / > 注:如果需要更纯净的组分，可以使用Optiprep梯度进一步纯化。
10. 测定蛋白质浓度稀释后NanoDrop仪器1μl蛋白质样品19μl 0.6% (w / v) SDS。原始蛋白浓度是测量值乘以20。< br / > 注意:加1后的蛋白质样品19μlμl 0.6% SDS,总量成为20μl,这意味着这个稀释蛋白质样品的浓度是原浓度的1/20。所以，我们可以计算原始蛋白质浓度的20倍。通常,3 x 10 <一口> < /一口>细胞能产生800 ?克线粒体和150 ?克。
拿出200μg线粒体(约15μl MitoPrep缓冲区,pH值7.4),或50μg ER(大约10μl MitoPrep缓冲区,pH值7.4),和带卷60μl MitoPrep缓冲与感兴趣的pH值(pH值7.4和6.5是我们经常使用的两个值)。把样品放在冰上。< br / > 指出:
1. 金属离子，金属螯合剂，或其他条件可以添加到样品前的下一步。表1列出了一些影响线粒体相关细胞质rRNAs降解的条件。 < br / > < br / > 表1 。影响线粒体相关细胞质rRNAs降解的条件 < br / >
2. 对于er相关的rRNA降解，MitoPrep缓冲液的pH值很重要:当pH值为7.4时，降解较慢;当pH值降低到6.5时，降解速度加快。所有这些影响都在原始论文中描述过(Huang et al.， 2018)。
将每个样本(60μl)分成3微型离心机管(20μl /管)。在-80°C冰箱中储存一管作为第一个时间点(0分钟)。将另外两根管子转移到37°C的加热块中。将两个样品分别孵育30分钟和60分钟。在每个时间点，转移一管到-80°C冰箱。将样品在-80℃保存至少15分钟，然后进行下一步。< br / > 注意:为了质量控制，准备另一组样品，并执行相同的降解步骤。将等量2x蛋白缓冲液与DTT混合，95℃加热5 min，用10% SDS-PAGE凝胶分离样品中的蛋白。将凝胶以150 V运行60 min后，将凝胶中的蛋白转移到450 mA的硝化纤维素膜上70 min，用标准western blotting方法对膜进行印迹。总之,孵化的膜的1 h RT 5%脱脂牛奶,探针与主要抗体在1 x TBS-T RT 1 h,洗4次1 x TBS-T(5分钟/时间),孵化与二次抗体在1 x TBS-T RT 1 h,然后用1 x TBS-T洗4次(5分钟/时间)。使用鲁米诺/增强剂溶液检测蛋白质。线粒体和ER组分的标记蛋白分别为Mortalin (73.7 kDa)和Calnexin (~68 kDa)。Mortalin在凝胶上的实际位置在70 - 100kda之间，Calnexin的实际位置在100kda左右。
冰箱取出样本-80°C和添加20μl 2 x DNA-SDS-EDTA缓冲区。涡旋，70℃孵育5 min，冷却至RT。
添加0.5μl 1毫克/毫升蛋白酶K的每个样本和孵化它在37°C的加热块5分钟。
运行样本1.5% (w / v)琼脂糖凝胶与溴化乙锭(EB)为15分钟(0.5 ? g / ml)在1 x 150 v TAE缓冲区。利用基于uv的凝胶成像系统捕捉凝胶图像，检查RNA降解模式。
该协议的流程图如图1所示。< br / > < br / > 图1 。本协议流程表

数据分析

代表性数据(图2-4) < br / > 图2 。对线粒体相关的胞质rRNAs的降解。 A.线粒体悬浮于MitoPrep缓冲液中，孵育0,30或60min。顶部面板为线粒体相关胞质rRNAs在三个时间点的琼脂糖凝胶图像。两个主要的谱带是胞质28S rRNA和18S rRNA。下面板为线粒体基质蛋白Mortalin免疫印迹(Mw: 73.7 kDa)，作为加载对照。B. A图中rRNAs的定量。< br / > < br / > 图3 。EDTA对线粒体相关细胞质rRNAs 降解的影响。 A.线粒体悬浮于MitoPrep缓冲液中，加入或不加入2mm EDTA孵育0、20或40min。顶部面板显示了线粒体相关的胞质rRNAs在三个时间点的琼脂糖凝胶图像。两个主要的谱带是胞质28S rRNA和18S rRNA。下面板为线粒体基质蛋白Mortalin免疫印迹(Mw: 73.7 kDa)，作为加载对照。B.定量28S rRNA在a.c.抗体特异性确证中，用SDS-PAGE凝胶分离A蛋白加载对照样品，转移到硝基膜上。用抗死亡蛋白抗体检测全膜(上膜)或切短膜(下膜)。< br / > < br / >图4 。pH对er相关胞质rRNAs 降解的影响 a . ER悬浮在pH为7.4或6.5的MitoPrep缓冲液中，孵育0、30或60 min。顶部面板为三个时间点ER相关胞质rRNAs的琼脂糖凝胶图像。两个主要的谱带是胞质28S rRNA和18S rRNA。底板为ER蛋白Calnexin免疫印迹(蛋白在凝胶上的位置约为100 kDa)，作为加载对照。B.定量28S rRNA在a.c.抗体特异性确证中，用SDS-PAGE凝胶分离A蛋白加载对照样品，转移到硝基膜上。用抗钙黏蛋白抗体检测全膜(上膜)或切短膜(下膜)。< br / > < br / > < >强数据处理 < br / > 凝胶图像采用Tanon 1600凝胶图像系统(Tanon)拍摄，Photoshop裁剪。< br / > < br / > 数据分析用ImageJ法测定凝胶上的条带强度，归一化为蛋白加载控制，用GraphPad棱镜分析条带强度。< br / > ,对于在凝胶图像系统上捕获的原始图像(背景为黑色，条带为白色)，下面简要介绍如何使用ImageJ进行量化。开放软件ImageJ。选择“矩形”工具(这是默认选项)，在第一个时间点绘制一个覆盖RNA带的矩形。按快捷键Ctrl + M测量光带强度。在第二个或第三个时间点将相同的矩形水平移动到RNA波段，然后按快捷键Ctrl + M测量波段强度。测量完所有的时间点后，将相同的矩形移动到一个典型的背景区域，然后按快捷键“Ctrl + M”来测量背景强度。< br / > ,计算方法:用带强度减去背景强度来测量RNA信号，得到每个带的绝对强度。将第一个时间点的信号设为100，将RNA带的绝对信号除以第一个时间点的绝对信号，计算第二个和第三个时间点的信号。< br / > ,采用非配对t-test (n = 3)进行统计学比较;* P & lt;0.05,* * P & lt;0.01 * * * P & lt;0.001 * * * * P & lt;0.0001。数据以均数±标准差(S.D.)表示。对每个时间点的数据集分别进行分析。

食谱

MitoPrep缓冲< br / > 0.225 M甘露醇 0.075 M蔗糖 20mm HEPES (ph7.4或ph6.5)
1. 将2.05 g甘露醇(分子量:182.17)、1.28 g蔗糖(分子量:342.3)、0.2383 g HEPES(分子量:238.3)溶于~45 ml ddH2O
2. 将pH值调整到7.4或6.5，并加入ddH2O到最终体积为50 ml
3. 通过0.22μm过滤器过滤,储存在4°C
10% (w / v) SDS
1. 将10克SDS溶解于100毫升ddH2O中，搅拌至完全溶解。在RT商店
2. 用ddH2O稀释10% SDS至0.6% SDS。在RT商店
0.5 M EDTA (pH 8.0)
1. 加入9.306 g EDTA (Mw: 372.24)至~ 40ml ddH2O，用氢氧化钠搅拌并缓慢调节pH至8.0，用ddH2O配制至50ml
2. 透过0.22μm过滤和储存在4°C
注:EDTA在pH值接近8.0时才会完全溶解
2x DNA-SDS-EDTA缓冲器 2倍DNA缓冲液，加入0.5% SDS和15mm EDTA 首先准备10x DNA缓冲液: 取10ml溶液，将0.2 g SDS和0.01 g溴酚蓝溶于5ml ddH2O中，与5ml甘油混合。存储在RT 准备100μl 2 x DNA-SDS-EDTA缓冲区: < br / > 混合72μl nuclease-free水20μl 10 x DNA加载缓冲区,加5μl 0.5的10% SDS和3μl EDTA (pH值8.0)
蛋白酶K (1mg /ml) 将1mg蛋白酶K溶解于1ml无核酸酶的水中，取下保存于-20℃
50 x TAE < br / > 2 M 1 M醋酸 50 mM EDTA
1. 溶解242克三羟甲基氨基甲烷(Mw: 121.14),液37.2 g的Na <子> < /订阅> EDTA·2 h <子> 2 < /订阅> O (Mw: 372.24)和57.1毫升的冰醋酸(摩尔浓度:17.5米)~ 900毫升ddH 2 <子> < /订阅> O,添加ddH <子> 2 < /订阅> O的最终体积1 l .存储在RT
2. 用ddH2O稀释50x TAE制备1x TAE
1 x TBS-T
1. 用0.1% (v/v)的Tween20和ddH2O稀释10x TBS原料药，制成1x TBS- t
2. 制备10x TBS (1 L)，将24.2 g Tris和80 g NaCl溶解在~900 ml ddH2O中，用盐酸调pH至7.6
2x蛋白缓冲液
1. 首先准备100毫升0.5 M三氯化氢(pH 6.8)。将6.05 g Tris(分子量:121.14)溶于ddH2O ~ 90ml中，用盐酸调pH至6.8。将ddH2O添加到最终100ml的体积中
2. 制备10 ml 2x蛋白缓冲液，将1.25 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)、0.2 ml 0.5%溴酚蓝(w/v)、2.5 ml甘油、2 ml 10% SDS和3.55 ml ddH2O混合保存于RT
3. 在使用前，将最终浓度为30mm的DTT添加到2x蛋白加载缓冲液中

致谢

这项工作是2017年由格兰特yfa0504600优先研究项目的中国的科学技术部,由国家自然科学基金会的拨款31371439和31371439的中华人民共和国教育部基金从1000年中华人民共和国的青年人才项目。本协议由Huang 等人(2018)修改而成。

相互竞争的利益

作者声明与本文内容没有利益冲突。

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