材料和试剂

1.5 ml微离心管(Fisher Scientific，产品编号:21-402-905)
24孔板(干细胞，目录号:38021)
96口v型底井(Denville Scientific，产品编号:B1201-S)
EBV-B细胞是内部生产的，如前所述(汇源et al.， 2011)。
从新鲜血液中分离出PBMCs，如前所述(Panda et al.， 2012;熊猫和Ravindran, 2013)
Tris (MP生物医学，目录号:103133)
吐温20 (Fisher生物反应器，目录号:BP337-500)
WB剥离缓冲器(Thermo Fisher Scientific，目录号PI-21063)
20% SDS (VWR生命科学，目录号:0837-200ML)
4-12%标准TM， XT bi - tris凝胶(Bio-Rad，目录号:345-0124)
5%脱脂奶粉(Bio-Rad，目录号:170-6404)
抗cd11c - percp - cy5.5抗体(BioLegend, BU15，目录号:307624)
抗cd123 - pe - cy7抗体(BioLegend, 6H6，目录号:30601)
抗cd141 - pe抗体(BioLegend, M80，目录号:344104)
抗cd1c - apc - cy7抗体(BioLegend, L161，目录号:331520)
抗cd20 - pe抗体(BD生物科学，2H7，目录号:555623)
抗cd56 - alexa700抗体(BD生物科学，B159，目录号:557919)
抗cd74抗体(Abcam，目录号:ab97479)
抗gapdh HRP偶联抗体(Santa Cruz，目录号:sc47724 HRP)
抗hla - dr - v450抗体(BD Biosciences, L243, catalog number: 642285)
抗鼠alexa 488二抗(Life Technologies，目录号:A-21131)
兔抗hrp偶联二抗(GE健康生命科学，目录号:NA934V)
BD Cytofix/Cytoperm (BD，目录号:554722)
BioRad蛋白检测浓缩染料试剂(BioRad，目录号:5000006)
牛血清白蛋白(BSA) (Calbiochem或Millipore)
溴酚蓝(Sigma-Aldrich，目录号:B75808-5G)
CD14微珠(密腾益生物科技，目录号:130-050-201)
CD19微珠(密腾益生物科技，目录号:130-050-301)
CD3微珠(密腾益生物科技，目录号:130-050-101)
CD56微珠(密腾益生物科技，产品目录:130-050-401)
完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏，目录号:11873580001)
DAPT伽马分泌酶抑制剂(R&D Systems, 2634/10)
DMSO (MP生物医学，目录号:196055)
0.5 M EDTA (Fisher Scientific，目录号:BP2482-1)
酒精200标准(Decon实验室，目录号2716)
全系列彩虹分子量标记(GE健康生命科学，目录号:RPN88E)
甘油(Fisher Chemical，目录号:G33-500)
甘氨酸(Fisher生物反应器，目录号:BP381-1)
热灭活胎牛血清(FCS) (Thermo Fisher Scientific，目录号:A3382001)
L-685,458 (EMD Millipore公司，产品目录号:565771)
活/死固定水(生命技术，目录号:L34957)
NaCl (Fisher Scientific，目录号:S271-3)
NP40 (Sigma-Aldrich，目录号:I8896-100ML)
sup>TM MES SDS运行缓冲器(20x) (Thermo Fisher Scientific，目录号:NP0002)
PBS (Mediatech，目录编号:21-0310 CVR)
皮尔斯ECL潜艇(热费雪科学，目录编号32106)
PVDF膜(Millipore，目录编号:IPVH00010)
生命科技(目录编号:61870-127)
Saponin (Sigma-Aldrich，目录编号:47036-50G-F)
Sodium deoxycholate (Sigma-Aldrich，目录编号:d675 - 100g)
Tris-HCl
平均文化(见模式)
RIPA缓冲区(见模式)
5x Laemmli loading缓冲区(见模式)
TBS-T(见模式)
块缓冲区(见模式)
FACS缓冲区(见模式)
嵌套缓冲区(见模式)
传输缓冲区(见模式)

设备

Amersham Imager 600 (GE Healthcare，目录编号:29083461)
BD生物科学与BDFACSDIVA软件(BD生物科学)和FlowJo数据分析软件。
离心机5418 R (Eppendorf，目录编号022620304)
垂直电磁学细胞标准(Bio-Rad，目录编号:1656001)
Eppendorf离心5810R (Eppendorf，目录编号022625004)
费雪科学漩涡混频器(费雪科学，目录编号02215365)
表格TM系列3水Jacketed CO2 Incubator (Thermo Fisher，目录编号:4110)
Labnet摇杆平台摇杆，单身，230 VAC (Labnet，目录编号UX-51401-07)
管4-pack(2 .面值,100 and 1000μl volumes)和管tips (Eppendorf、目录号:05-403-151)
PowerPacTM HC高电流电力供应(BioRad，目录编号:1645052)
transblot pip SD半干传输单元(BioRad，目录编号:1703940)

程序

PBMCs和EBV-B cells中SPPL2a的化学嵌入
1. 在中等文化中，Plate 106 EBV-B cells或PBMCs(两种生长在悬浮液中的)的三倍，在24-well Plate中，106 cells/ml的密度为3倍。
2. Immediately after镀金,对待one好吧with 1μM of DMSO,第二好吧with 10μM DAPT伽玛(通用secretase inhibitor use as a消极控制因为it不inhibit SPPL2a;on交付,it应该dissolved在DMSO to(100毫米解决方案,往是然后stored at - 20°C protected against freeze-thaw诗人骑自行车循环)和第三one应该treated with 1μM解决方案of the伽玛secretase / SPPL inhibitor L-685,458(解决方案种群at 1毫米,存储at - 20°C protected against freeze-thaw诗人骑自行车)。
3. 在37℃，5% CO2的环境下，在组织培养箱中培养24小时，不摇晃。< br / > < div风格= "空白:nowrap;} " > < br / > < / div >
Western-blot分析EBV-B细胞中CD74-NTF的积累情况
1. 治疗后将EBV-B细胞移入1.5 ml微离心管，室温300 x g离心5 min。
2. 把上层的只
3. 将EBV-B细胞复苏于2ml PBS中，室温300 x g，再次离心5min。
4. 移除上层清液。
5. Resuspend EBV-B细胞30μl冰冷里帕缓冲区。
6. 涡旋30秒。
7. 在冰上孵育20分钟。
8. 18000 x g， 4℃离心20分钟。
9. 收集含有蛋白质的上清液。
10. 根据试剂盒制造商的说明，使用BioRad蛋白测定法评估蛋白浓度(BioRad蛋白测定法)。
11. 混合50μg蛋白1/5体积的5 x Laemmli加载缓冲区。
12. 55℃孵育5分钟。
13. 执行在丙烯酰胺预制4 - 12% sds - page凝胶电泳在MES缓冲区,5μl全程彩虹分子量标记的尺寸标准,根据制造商的说明(< a href = " http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf " target = "平等" >聚丙烯酰胺凝胶电泳和检测指南< / >)。
14. 根据制造商的说明将蛋白转移到PVDF膜上(Immobilon-P-PVDF膜)。
15. 在封闭缓冲液中室温孵育1小时，使膜凝固。
16. 取出阻塞缓冲液，用TBS-T冲洗膜。
17. 用抗CD74抗体(裂解的或未裂解的)在4℃下以1% BSA稀释1:10 0 %的CD74的NTF在TBS-T中摇匀孵育过夜。
18. 第二天，用TBS-T孵育膜4次，每次5分钟，室温下放置于摇床上。
19. 将兔抗hrp偶联的二抗以1% BSA在TBS-T中稀释1:5 000，于室温下在摇床上孵育30分钟。
20. 如上所述(第18点)，在室温下清洗薄膜5次。
21. 根据制造商的说明(PierceTM ECL Western Blotting substrate )，用ECL底物开发膜(PierceTM ECL Western Blotting substrate )。暴露5分钟后，信号应该是可见的。
22. 室温下用WB汽提缓冲液对膜进行剥离。
23. 在室温封闭缓冲液中孵育1小时，使膜封闭。
24. 取下封闭缓冲液，室温下用TBS-T冲洗膜。
25. 室温下，用hrp标记的抗gapdh抗体在1% BSA中稀释1:5 000，在TBS-T中孵育1小时。
26. 用TBS-T孵育膜5次，每次孵育5分钟，置于室温下的摇床上。
27. 根据制造商的说明(PierceTM ECL Western Blotting substrate )，用ECL底物开发膜(PierceTM ECL Western Blotting substrate )。暴露2分钟后，信号应该是可见的。< br / > < div风格= "空白:nowrap;} " > < br / > < / div >
不同PBMC群体中CD74-NTF积累的FACS分析
1. 以300 x g离心PBMCs 5分钟。
2. 取出上清液，在FACS缓冲液中复苏PBMCs，再次以300 x g离心5分钟。
3. 隔离CD14 <一口> + < /一口>细胞mac (CD14微磁)根据制造商的指示(< a href = " https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/macs-cell-separation/cell-separation-reagents/microbeads-and-isolation-kits/monocytes-and-macrophages/cd14-microbeads-human.html # 130-050-201”目标= "平等" > CD14微,人类< / >)。
4. 隔离CD3 <一口> + < /一口>细胞流经(CD14 <一口> - < /一口>),通过mac (CD3的微磁)根据制造商的指示(< a href = " https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/macs-cell-separation/cell-separation-reagents/microbeads-and-isolation-kits/t-cells/cd3-microbeads-human.html # 130-050-101”目标= "平等" > CD3微,人类< / >)。
5. 隔离CD19 + < /一口>和<一口> CD56 <一口> + < /一口>细胞流经(CD14 <一口> - < /一口>,CD3 <一口> - < /一口>)的mac (CD19和CD56微磁)根据制造商的指示(< a href = " https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/macs-cell-separation/cell-separation-reagents/microbeads-and-isolation-kits/b-cells/cd19-microbeads-human.html # 130-050-301”目标= "平等" > CD19微磁,人和CD56 microbeads, human)。
6. 洗这四个fractions-CD14 <一口> + < /一口>,CD3 <一口> + < /一口>,CD19 + <一口> < /一口> CD56 <一口> + < /一口>细胞和流过(CD14 <一口> - < /一口>,CD3 <一口> - < /一口>,CD19 <一口> - < /一口>,CD56 <一口> - < /一口>)两次再悬浮在2毫升的流式细胞仪缓冲和离心300 x g 5分钟,去除浮层。
7. 在96孔板上用v形底孔染色细胞。Re-suspend分数1和2 (CD14 + < /一口>和<一口> CD3 <一口> + < /一口>)在50μl流式细胞仪缓冲/死亡可以解决的Aqua 1:1,000生活。Re-suspend分数3 (CD19 + <一口> < /一口> CD56 <一口> + < /一口>)在50μl流式细胞仪缓冲生活/死可以解决的Aqua 1:1,000 anti-CD20-PE和反CD56-Alexa700抗体。Re-suspend分数4 (CD14 <一口> - < / >一同晚餐,CD3 <一口> - < /一口>,CD19 <一口> - < /一口>,CD56 <一口> - < /一口>)在50μl流式细胞仪缓冲生活/死可以解决的Aqua 1:1,000 anti-CD11c-PerCP-Cy5.5, anti-HLA-DR-V450, anti-CD123-PE-Cy7, anti-CD1c-APC-Cy7和anti-CD141-PE抗体(表1)。在1:50的稀释,使用所有的抗体和相应的培养细胞混合冰30分钟。< br / > < br / > 表1 。染色板 < br / > < br / >
8. 洗两次细胞通过添加100μl流式细胞仪缓冲区和离心法板350 x g 3分钟。
9. 细胞修复和permeabilize 100μl BD Cytofix / Cytoperm根据制造商的指示(< a href = " http://www.bdbiosciences.com/us/applications/research/t-cell-immunology/th-1-cells/intracellular-markers/cytokines-and-chemokines/buffers/fixation-and-permeabilization-solution/p/554722 " target = "平等" >固定和透化作用的解决方案< / >)。
10. 执行细胞内染色通过孵化50μl anti-CD74抗体稀释1:50 0在细胞内染色缓冲在4°C为45分钟。
11. 洗两次细胞每100μl细胞内染色缓冲区。
12. 最后染色步骤,在50μl resuspend细胞细胞内染色缓冲anti-mouse-Alexa 488二级抗体稀释1:1,000。
13. 最后,洗两次细胞流式细胞仪缓冲区和resuspend 100年μl流式细胞仪的缓冲区。
14. 在适当补偿之后，使用FACS diva软件以每秒1000个事件的速率在LSR-II中收集数据。< br / >

数据分析

在western blots上，CD74-NTF的积累可以通过仅监测L-685,458处理的样品中9 kDa带的出现来评估。(图2E中的https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6130844/)。
淋巴细胞和单核细胞是根据它们的生命状态(活的，LDA)侧散射(SSC)和正向散射(FSC)特性分别门控的。认为CD3+细胞对应T细胞，CD20+细胞对应B细胞，CD56+对应NK细胞，CD14+对应单核细胞。对于直流门控，pDCs被认为是HLA-DR+CD11c-CD123+， cDC1被认为是HLA-DR+CD11c< /sup> +CD11c< /sup >0 +1 CD1412 +4 +5 CD11c< /sup >6 +7 CD1c< /sup >8 +9。门控后，使用FlowJo软件评估CD74的MFI，使用未处理细胞和DAPT处理细胞的值作为阴性对照。我们的原始论文中给出了一个详细的门策略和预期的结果(图2H和S2见< A href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6130844/" data-ke-src="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6130844/" target="_blank">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6130844/).

笔记

我们建议对每一组条件执行一式三份的本协议，以获得可重复的、可靠的和健壮的结果。
考虑到目标蛋白的预期大小非常小(9 kDa)，请仔细检查蛋白重量标记，以确保CD74-NTF不会跑出凝胶的末端。
这里描述的FACS染色策略的选择是基于我们的试剂/设备的可用性和减少变异性的后续实验计划。然而，任何其他定制染色策略可以根据个人需要使用。此外，任何其他表达CD74/ sppl2a的细胞系或细胞类型都可以使用该协议进行研究。
我们通过western blotting分析了EBV-B细胞中CD74-NTF的积累，因为这种方法更直观，而且我们有无限数量的这些细胞可用。由于这些细胞的可用性有限，我们用流式细胞仪分析了T、B、NK、DC和单核细胞。然而，如果能够获得足够数量的PBMCs，则可以纯化单个细胞群，并通过western blotting分析CD74-NTF的积累。相反，流式细胞仪也可以研究CD74-NTF的积累。
如有任何疑问或疑问，请通过rmartinezb@rockefeller.edu. .

食谱

文化传媒< br / > RPMI培养基(Life Technologies)添加10%热灭活胎牛血清(FCS) (Thermo Fisher Scientific)
里帕缓冲< br / > 50mm Tris pH 8 1 mM EDTA NaCl 0.5%脱氧胆酸钠 1% NP40 < br / > 0.1% SDS和完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)
5x Laemmli加载缓冲区 80mm Tris-HCl pH 6.8 2% SDS 10%甘油 0.02%溴酚blue
TBS-T < br / > 20mm Tris pH 7.4 NaCl 0.1%渐变20
阻断缓冲区< br / > TBS-T 5%脱脂奶粉，BSA 2.5%
流式细胞仪缓冲< br / > PBS中2% FCS
细胞内染色缓冲液 PBS < br / > 5% BSA < br / > 0.1%的皂苷
转移缓冲< br / > 192mm甘氨酸 25 mM Tris 20%的乙醇< br / >

致谢

感谢我们原创研究文章的所有作者(Kong et al.， 2018)。R.M.B.由欧洲分子生物学组织(EMBO)长期资助。x . f . k .由Jerome Lejeune基金会、Stony Wold-Herbert基金会、Choh-Hao Li纪念基金学者奖和上海教育发展基金会资助。人类传染病遗传学实验室由圣·吉尔斯基金会(j.l. c .)、洛克菲勒大学临床和转化科学中心(国家研究资源中心和国家促进科学中心(NCATS)向R.M.-B提供的赠款UL1TR001866)资助。和X.-F.K.)、美国国立卫生研究院、美国国立过敏和传染病研究所(5R01AI089970-02和5R37AI095983 to j.l. c .)、国立de la Sante和de la Recherche Medicale (INSERM)、巴黎笛卡尔大学和洛克菲勒大学。

相互竞争的利益

作者没有相互竞争的利益需要声明。

道德

本研究经美国纽约洛克菲勒大学医院机构伦理委员会批准并按照其要求进行。所有参与本方案制定的健康对照志愿者均获得知情同意。

参考文献

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