材料和反应

Pipettes tips: 0。5 -μl, 10-200μl, 200-1,000μl (Greiner Bio-One目录数字:771291 739290、740290)
50毫升无菌圆锥管。
15毫升无菌锥形管。
无菌管道:2毫升，5毫升，10毫升(Greiner bio one，目录编号:710180,606180,607180)
96-无菌细胞培养u -底部板(Greiner bio one，目录编号:650180)
24-无菌细胞培养板
5 ml syringe (Terumo，目录编号:SS+05S21381)
7μm尼龙Cell strainer(猎鹰,目录:352350号)
Petri dishes (Greiner Bio-One，目录编号:664102)
Eppendorf管(Greiner Bio-One，目录编号:616201)
玻璃纤维过滤器(PerkinElmer，目录编号1205-401)
Microbeta的Sample包(PerkinElmer，目录编号:1405-432)
0。22过滤器μm(默克孔,目录:SLGV004SL号)
BALB/c female mice, 6-8周大。
兴趣的Antigens。对于本协议对脾脏的重新刺激，使用多位位多位多肽(i.e)进行。， CPA160-198和ef2 1-137)包含在实验疫苗接种中 leishman 在我们的实验室开发
RPMI-1640(生物西部，目录编号:L0501-500)
HEPES (Biowest，目录编号:L0180-100)
青霉素链霉素(100x)(生物西部，目录编号:L0022-100)
l -谷氨酸(100x) (Biowest，目录编号:X0550-100)
Fetal牛血清优质(FBS)(目录编号:LSB-015S)
生命维持系统的蓝色Trypan。，目录编号:34078)
:Ammonium chloride (so2) <潜水> 4 < /潜水> Cl),其中明确谴责reagent,≥99 5 (Sigma-Aldrich,目录:213330)号
种bicarbonate (KHCO <潜水> 3 < /潜水>),其中明确谴责reagent,≥99脂肪(Sigma-Aldrich,目录:237205)号
1米(Sigma-Aldrich，目录编号150696)
脱氢盐(Na2EDTA)， ACS反应，99 -101.0% (Sigma-Aldrich，目录编号:E4884)
氯化物钠99.9% (NaCl)(应用化学，目录编号:381659)
种chloride (KCl),其中明确谴责reagent,≥99。零(Sigma-Aldrich,目录:746336)号
Sodium phosphate dibasic (Na <潜水> 2 < /潜水潜水> HPO < > 4 < /潜水>),其中明确谴责reagent,≥99。零(Sigma-Aldrich,目录:795410)号
种phosphate monobasic (KH <潜水> 2 < /潜水潜水>阿宝< > 4 < /潜水>),其中明确谴责reagent,≥99。零(Sigma-Aldrich,目录:795488)号
钠水解(NaOH)解决方案，1米(Sigma-Aldrich，目录编号79724)
(Sigma-Aldrich，目录编号C5275)
Thymidine， [methyl-3H] (PerkinElmer，目录编号:NET27X001MC)
闪烁流体(PerkinElmer，目录编号:1200-439)
Milliplex pie MAP Kit (MerckMillipore Corporation，目录编号:MCYTOMAG-70K)
(可选)鼠标阵列Th1/Th2 Cytokine Kit (BD生物科学，目录编号551287);(Biolegend，目录编号740750);FlowCytomix鼠标Th1/Th2 10plex (Bender MedSystems，目录编号:BMS720FF)
盐酸lysis溶液(ACK, pH 7.2)(见第10页)
phosphae -buffered saline, 10x (PBS, pH 7.2)(见第10页)
完整的中小企业中位数(见第10页)
(见第10页)
0.4% (w/v) Trypan blue exclusion dye(见第10页)

设备

穿着锋利的剪刀，斯凯拉穿着整齐的剪刀，修剪整齐的剪刀，都是无菌的剪刀，有70%的民族
吉尔森烟斗(P-10, P-20, P-200, P-1000)
多通道管道(Nichiryo, Nichipet 7000)
纽鲍尔数商会(Paul Marienfeld GmbH & co .Co .)
CO2孵化器(New Brunswick, Galaxy 170)
层流罩(Telstar, Bio-II-A)
冷藏离心机(百夫长科技有限公司，专业研究)
光学显微镜(Olympus, BH)
水浴(LabTech, LSB-015S)
联合电池收割机(Skatron Instruments, 11025/11028)
微板闪烁发光计数器(Wallac, Microbeta 1450 triux)
Luminex® 200TM System with xPONENT® Software (Life Technologies, Novex®)

软件

使用xPONENT®软件(Luminex)分析细胞因子产生数据
采用GraphPad Prism v6软件进行统计检验注:各组采用单因素方差分析与Tukey多重比较试验进行比较，各组与未接种疫苗的小鼠进行比较。 < br / >

过程

从脾脏分离白细胞
1. 在无菌条件下，在预先确定的时间点取每只接种疫苗的小鼠的脾脏。< br / > 注:评价接种诱导的细胞免疫反应所选择的时间点因各实验室所遵循的接种方案不同而不同。，注射后2周)，以检测是否存在抗原特异性记忆和效应T细胞群。
2. 在无菌生物安全箱内，将每个脾脏放入含有5毫升完整RPMI培养基的培养皿中。
3. 用5ml注射器的柱塞将脾脏按在培养皿的底部，做圆周运动，直到大部分纤维组织保留(图1)。
4. 过滤器细胞避免组织碎片通过70μm尼龙细胞通过细胞悬液过滤器为15毫升无菌锥形管(图1)。< br / > < br / > 图1 。脾细胞分离的代表性方法 < br / >
5. 用完整的RPMI培养基，在350 x g的温度下，4℃离心10分钟，冲洗脾脏细胞悬液。
6. 弃上清液，用3 ml冰袋复苏细胞，溶解红细胞。
7. 室温下孵育5分钟，偶尔摇晃。
8. 停止裂解反应，加入完整的RPMI培养基，最终体积为10毫升。
9. 用完整的RPMI培养基，在350 x g离心10 min, 4℃，洗涤2次。
10. 丢弃上清液，在5ml完整的RPMI培养基中复苏细胞。
11. 细胞悬液的混合10到20μl台盼蓝排斥染料的埃普多夫管最终1:10稀释的细胞或1:20。让混合物在室温下孵育约3分钟。滴一滴台盆蓝/细胞混合物到纽鲍尔室。< br / > 注意:细胞应在无血清培养基中重新悬浮，因为血清蛋白被台盼蓝染色，产生误导的结果。此外，台盼蓝染料中细胞的最终稀释程度取决于细胞的数量。如果样品稀释不够，细胞就会过于拥挤，难以计数。如果太稀，样本量将不足以对原始混合物中的浓度做出强有力的推断。通过对第二腔室进行冗余试验，可以对结果进行比较。因此，alibauer应该包含一个方便计数的细胞数。通常，当脾分散到5ml RPMI时，细胞的最终稀释倍数为1:10。
12. 在光镜下分别计数未染色(活的)和染色(不活的)细胞。< br / > 注:台盼蓝排除试验的原理是活细胞具有完整的膜，可以排除某些染料，如台盼蓝，而死细胞没有。因此，活细胞的细胞质是透明的，而不活细胞的细胞质是蓝色的。此外，需要注意细胞与染料接触的时间，因为较长的潜伏期会导致细胞死亡和存活数减少。因此，细胞应在与台盼蓝混合后3 ~ 5分钟内计数。
13. 通过以下计算确定每毫升细胞数: 细胞/ml =每平方平均计数x稀释因子x 104 细胞总数=细胞/ml x取标本的细胞悬液原始体积常规情况下，一只小鼠脾脏产生约1×108脾细胞。< br / > 注:小鼠脾细胞的恢复随年龄、性别和品系的不同而有显著差异。
14. 在完全RPMI中-10%胎牛血清中复苏细胞，最终浓度为2 x 106 cells/ml。< br / > < div风格= "空白:nowrap;} " > < br / > < / div >
扩散分析
1. 化验纳入下列对照∶
  1. 无抗原刺激(阴性对照;完全RPMI-10%胎牛血清中的脾细胞)。
  2. 阳性对照与淋巴细胞有丝分裂原(脾细胞与有丝分裂原Concanavalin a)。
2. 使用完整的rmi -10%胎牛血清，在15 ml锥形试管中制备所选抗原的2倍稀释系列。推荐的稀释:20、10、5μg /毫升又是;
3. 96孔u型底细胞培养板中的板细胞。考虑2×105脾细胞每孔(即。 100μl脾细胞悬液)。每种情况都应进行一式三份的分析。< br / > 注:当使用未分离的近期启动小鼠脾细胞时，通常1 x 105< /em> -5 x 10 50 1 2细胞每孔镀一层，以便进行显著的增殖试验。在这种情况下，未分化的脾细胞包含巨噬细胞、树突状细胞和B细胞等附属细胞，这些细胞作为添加抗原的抗原呈递细胞，以及应答T细胞的次级信号来源，从而增强其增殖反应。
4. 添加100μl稀释抗原或ConA /好最后一卷200μl /。最后抗原浓度应该对应于10日5和2.5 ?为抗原和3 g / ml ? ConA g / ml。
5. 消极的控制增加100的边后卫μl完整的rpmi - 10%。
6. 37℃孵育72 h, 5% CO2，湿度95%。
7. 添加25μl稀释[<一口> 3 < /一口> H]胸苷完成每口井的RPMI对应0.5μCi /。[3H]-胸腺嘧啶应轻轻滴加，不要在井中混合，以免破坏细胞团簇(图2)。< br / > 注:[3H]-胸腺嘧啶是一种放射性物质。所有的程序都需要在经过认证的实验室中使用专用孵化器、抽油烟机和吸液管来完成。查阅材料安全数据以获得正确的操作说明，并接受放射性材料操作培训。
8. 37℃孵育18 h, 5% CO2，湿度95%。< br / > 注:孵育时间与所用细胞数量有关。
9. 利用半自动化的细胞收获机，裂解细胞并将其标记的DNA收获到玻璃纤维滤布上。将滤布放在干燥的烤箱中，在60°C的温度下干燥30分钟。
10. 将过滤器放入袋中，用一次性塑料吸管加入闪烁液。
11. 封袋并计数[3H]-胸苷掺入-闪烁计数器。< br / > < br / > 图2 。A)不增殖的脾脏细胞培养物(仅在完全培养基中)和B)对Concanavalin A反应增殖的脾脏细胞培养物的代表性图像。增殖T细胞簇。放大20 x。< br / > < div风格= "空白:nowrap;} " > < br / > < / div >
细胞因子检测
1. 稀释抗原在完全RPMI -10% FBS从上述开始。
2. 在24孔细胞培养皿中培养板细胞。考虑4×106脾细胞每孔(即。, resuspend细胞4 x 10 <一口> 6 < /一口>细胞将500年μl完整的边后卫rpmi - 10%)。每种情况都应至少一式两份进行分析。
3. 加上500μl稀释抗原的最终体积1毫升/。最后抗原浓度对应于10 ? g / ml。
4. 消极的控制增加500的边后卫μl完整的rpmi - 10%。
5. 37℃孵育72 h, 5% CO2，湿度95%。
6. 将上清液收集到Eppendorf管中，在2,330 x g的温度下离心5分钟，在4℃下去除细胞碎片。
7. 将无细胞的上清液收集到新的Eppendorf管中，在-70℃保存，直到使用。
8. 分析当天，在室温下解冻样品。测量细胞因子的生产用鼠标5-plex Luminex面板(2,IFN-γ,TNF-α、il - 4和il - 10)在协议Milliplex手册中列出。< br / > 注意:避免多重(>)2)解冻-冷冻循环，因为它会导致蛋白质降解，导致细胞因子的产生被低估。此外，在某些情况下，细胞因子浓度高于动态检测范围(细胞因子浓度与吸光度读数呈线性关系)的样品，培养上清可能需要稀释。
9. 使用xPONENT®软件，在Luminex® 200TM系统上运行样品。< br / > 注:在没有Luminex多分析物分析概要系统的情况下，可以使用与流式细胞仪兼容的流式细胞仪珠阵列作为替代，即，流式细胞仪小鼠Th1/Th2细胞因子试剂盒(BD Biosciences)， LEGENDplex小鼠Th1/Th2 Panel (8-plex) (Biolegend)，流式细胞仪小鼠Th1/Th2 10plex (Bender MedSystems).

数据分析

Lymphoproliferation化验:

[3H]-胸苷掺入量以每分钟计数(cpm)表示(图3A)。计算受刺激(实验或ConA脉冲)和对照(培养基)培养的cpm的差异。这是通过从三倍对照培养物的cpm平均值减去相应受刺激培养物的cpm算术平均值来实现的。结果称为“∆cpm”(表1，图3B)。
否则，将数据计算为受刺激培养物和对照培养物的cpm比值。这是通过将受刺激培养物的算术平均值除以cpm与对照培养物的算术平均值来实现的。结果参照“SI”刺激指数(表1，图3C)。< br / > 注:SI计算的缺点是背景值的小变化会导致SI的大变化，需要谨慎解释。 < br / > < br / > 表1 。[3H]-胸腺嘧啶掺入量以每分钟计数(cpm)表示，这是一个具有代表性的实验。< / >强来自免疫小鼠脾细胞治疗完全培养基,3和6μg /毫升ConA或10,20和40μg /毫升CPA <子> 160 - 189 < /订阅>或5μg /毫升N -李 EF-2。数据为每种情况下三次重复的平均值±标准差。< br / > < br / >图3 。脾细胞增殖的典型图形描绘成一个)[<一口> 3 < /一口> H]胸腺嘧啶核苷掺入,B)Δcpm和C)刺激指数(SI)。< / >强来自免疫小鼠脾细胞治疗完全培养基,3和6μg /毫升ConA或10,20和40μg /毫升CPA <子> 160 - 189 < /订阅>或12.5μg /毫升CPA <子> 160 - 189 < /订阅>。数据为每种情况下三次重复的平均值±标准差。< br / > < br / > 细胞因子检测: < br / > 细胞因子分析,计算每个样本的均值-控制被认为是背景值(脾细胞仅在完全培养基)(表2)。然后,细胞因子的均值生产抗原刺激的存在为每个样本计算(表2)。为了估计抗原细胞因子的生产,的意思是背景值减去平均值后获得的刺激(图4)。< br / > < br / > 表2 。细胞因子产生的代表性实验。< / >强脾细胞来自外地,免疫小鼠接受要么完全培养基,或5μg /毫升N -李 EF-2。数据为每种情况下三次重复的平均值±标准差。< br / > < br / > 图4 。代表人物证明抗原(N -李 EF-2)特殊技能2,IFN-γTNFα生产后脾细胞体外, 刺激完全培养基或5μg /毫升N -李 EF-2 72 h。数据为每种情况下三次重复的平均值±标准差。

笔记

增殖试验只能作为T细胞反应性的一般指标，因为这种方法只检测分裂细胞，而不能测量真正的效应T细胞功能。由于脾细胞培养中包含的大多数T细胞对添加的刺激作出反应，从而在激活时产生IL-2，因此增殖试验中反应性的差异在一定程度上反映了反应性T细胞对IL-2的差异。因此，当与细胞因子检测方法结合使用时，增殖检测方法变得更有意义。
影响脾脏细胞增殖反应大小和细胞因子产生的参数包括细胞浓度和密度、血清来源和数量、刺激/丝裂原的类型和浓度、小鼠品系和培养时间。微培养系统体积小，对细胞和丝裂原浓度特别敏感。因此，细胞计数和有丝分裂原稀释的准确性是获得最佳结果的关键。此外，由于血清的变异性，应检测多个批次，以保持所有其他条件(细胞浓度、培养时间和丝裂原浓度)稳定，并应选择控制刺激最低、支持丝裂原刺激最好的批次使用。此外，就像血清一样，为了选择能最大程度刺激细胞的ConA，需要检测多种不同浓度的ConA，以保持细胞数量的稳定。< br / >

食谱

氯化铵裂解液(ACK, pH 7.2)
1. 将8.29 g NH4Cl, 1 g KHCO3， 37.2 mg Na2EDTA溶于900 ml蒸馏水中
2. 用1m HCl将pH调至7.2，用蒸馏水将体积调至1l
3. 过滤消毒0.22μm过滤器
4. 4℃保存
磷酸盐缓冲盐水，10x (PBS, pH 7.2)
1. 溶解80 g NaCl, 2 g KCl, 11.5 g Na2HPO4， 2 g KH2PO4 至800 ml蒸馏水
2. 根据获得的pH值，用1m HCl或1m NaOH将pH值调整到7.2，用蒸馏水将体积调到1l
3. 过滤消毒0.22μm过滤器
4. 4℃保存
完整的RPMI介质
1. 谷酰胺股票< br / > 在-20°C 下，以200 mM浓度(100x)的100毫升的形式供应解冻并分散到5ml aliquots 储存在-20°C直到使用
2. Penicillin-streptomycin < br / > 提供100毫升10000 U /毫升- 10000 ?克/毫升浓度(100 x)储存在-20 ? C < br / > 解冻并分散到5ml aliquots 储存在-20°C直到使用
3. 制备完全培养基将5 ml谷氨酰胺、5 ml青霉素-链霉素和5 ml HEPES加入500 ml RPMI-1640培养基 4℃ 保存当需要时，取适量的完全培养基，将胎牛血清添加到10%的最终浓度(v/v)
4. 胎牛血清(FBS) 解冻后放入35 ml aliquots 在恒温搅拌的水浴中，56°C高温灭活储存在-20°C直到使用
Concanavalin A stock solution 向Concanavalin A粉中加入1ml PBS，最终浓度为5mg /ml 在50卷整除? l < br / > -20℃保存至3年注释:Concanavalin A是一种甘露糖结合的植物凝集素，主要作为一种强有力的T细胞有丝分裂原，在增殖试验中作为阳性对照。另外，PHA可以替代Concanavalin A. PMA/ionomycin刺激诱导多克隆刺激即。，髓细胞，B和T细胞，当使用纯化淋巴细胞时，效果更好。
0.4% (w/v)台盼蓝排斥染料溶解0.4 g至100 ml PBS 过滤消毒< br / >

致谢

这项工作得到了欧洲联盟和希腊教育和宗教事务部在业务战略参考框架(NSFR 2007-2013)和研究与技术总秘书处(GSRT)共同资助的“KRIPIS I”行动(MIS 450598)的支持。该协议改编自Agallou et al.(2014和2018)。< br / > ,增殖试验最初是由Strong 等人开发的(1973)，多年来已被多个小组修改以检测抗原特异性增殖。

相互竞争的利益

两位作者都声明他们没有利益冲突。

道德

实验方案得到了机构方案评估委员会的积极评价，并获得了Attikis县官方兽医当局的许可。在生物医学研究动物模型部、希腊巴斯德研究所(Hellenic Pasteur Institute)的批准设施中，按照注册代码EL25BIO011、EL25BIO012和EL25BIO013，在SPF(无特定病原体)条件下对实验室小鼠和体内研究进行了维护。动物饲养于室温22±2℃，相对湿度40-70%，光照/暗循环12 h。所有程序履行PD和欧洲的欧盟指令2010/63 / 56/2013,福利和伦理的使用实验动物基于3 + 1 r:更换,减少,细化和尊重和准备的指导方针(规划研究和动物实验过程:建议卓越),到达和ARRIGE(协会负责研究和创新在基因组编辑)。动物福利由有能力的使用者评估，并由机构福利团体的成员每日监察。

参考文献

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