材料和反应

PCR
1. 管tips
2. 0.2 ml PCR Tubes (SARSTEDT，目录编号:72.737.002)
3. 来自龙的完整人类基因组DNA (Amsbio，目录编号:HG-601)
4. 高保真DNA聚合物(Thermo Fisher，目录编号:F530S)
5. dNTPs混合(Thermo Fisher，目录编号:R0192) < div风格= " white-space: nowrap; " > < / br / > < / div >
凝胶electrophoresis
1. TAE缓流器(40mm Tris基，20mm乙酸，1mm EDTA)
2. Agarose (Sigma-Aldrich，目录编号:A9539)
3. 溴酰胺(Sigma-Aldrich，目录编号:E7637)
4. 1 kb DNA梯度(Thermo Fisher，目录编号:SM0311)
5. 100 bp DNA梯子。
6. Loading Dye DNA (Thermo Fisher，目录编号:R0611) < div风格= " white-space: nowrap; " > < / br / > < / div >
克隆
1. 1.5 ml微管(SARSTEDT，目录编号:72,706,700)
2. Petri dishes (SARSTEDT，目录编号:82.1472.001)
3. 15毫升聚丙烯管(SARSTEDT，目录编号:62,554,002)
4. 内布< sup >®< / sup > 5α主管 E。大肠杆菌 (NEB，目录编号:C2987I)
5. pSPL3向量。
6. pSpCas9(BB)-2 - gfp PX458 (Addgene #48138)
7. NheI (Thermo Fisher，目录编号:ER0971)
8. XhoI (Thermo Fisher，目录编号:ER0691)
9. XbaI (Thermo Fisher，目录编号:ER0681)
10. BbsI(热费雪，目录编号:ER1011)
11. T4 ligase DNA (NEB，目录编号:M0202S)
12. 高纯度PCR产品净化工具包(Sigma-Aldrich，目录编号:11732668001)
13. StrataPrep DNA凝胶提取试剂盒(Agilent，目录编号400766)
14. QuikChange II工具包(目录编号200523)
15. LB Broth Lennox (Sigma-Aldrich，目录编号:L3022)
16. 含琼脂的LB溴(Sigma-Aldrich，目录编号:L2897)
17. 氨苄西林钠盐(Sigma-Aldrich，目录编号:A0166) < div风格= " white-space: nowrap; " > < / br / > < / div >
玛玛莲细胞文化
1. T75细胞文化flash (SARSTEDT，目录编号:83.1813.002)
2. 12-well plates (SARSTEDT，目录编号:83.3921.005)
3. HEK293T cells，人类胚胎肾细胞线(ATCC pip ，目录编号:CRL-3216)
4. CFTE cells, cystic fibrosis气管上皮细胞line (Gruenert et al. >， 2004)
5. dubelcco修改鹰的媒介(DMEM, Sigma-Aldrich，目录编号:D5796)
6. 最低限度的基本媒介鹰(MEM, Sigma-Aldrich，目录编号:M2279)
7. Fetal牛血清(Sigma-Aldrich，目录编号:F7524)
8. phosphae -buffered saline PBS (Sigma-Aldrich，目录编号:P5493)
9. 盘尼西林链霉素(Sigma-Aldrich，目录编号:P433)
10. Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich，目录编号:T3924)
11. Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher，目录编号:11668027)
12. Opti-MEM (Thermo Fisher，目录编号:31985070) < div风格= " white-space: nowrap; " > < / br / > < / div >
质粒DNA和全DNA提取
1. 核质粒试剂盒(machery - nagel，目录编号:740588150)
2. DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN，目录编号:69506) < div风格= " white-space: nowrap; " > < / br / > < / div >
RNA提取和RT-PCR
1. 0.5 ml PCR Tubes (SARSTEDT，目录编号:70,704,400)
2. 核RNA (MACHEREY-NAGEL，目录编号:740955150)
3. 高容量cDNA反向转录试剂盒(Thermo Fisher，目录编号15561175)
4. dNTPs混合(Thermo Fisher，目录编号:R0192)
5. 高保真DNA聚合物(Thermo Fisher，目录编号:F530S)

设备

Pipettes
PCR热自行车Eppendorf大师自行车
博士系统(Bio-Rad)
马桶巴斯
Bacterial Incubator和shaker
marmalian cell incubator (37.5% CO2)
本森Burner
NanoDrop 2000光谱仪(Thermo Fisher Scientific meter, model: NanoDropTM 2000)
Microcentrifuge
电容器和电源包
高压釜
生物安全 class

软件

Primer-blast ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/< a>)
CRISPR-Design (http://crispr.mit.edu/)
SnapGene Viewer (http://www.snapgene.com/products/snapgene_viewer/)
Tm Calculator (https://www.thermofisher.com< a>)
峰扫描器2 (https://www.thermofisher.com< a>)
Eurofins (Oligo synthesis, Sanger序列和片段分析[FLA]服务)(https://www.eurofinsgenomics.eu)

程序

Minigene建筑公司
1. “https://www.ncbi.nlm.nih /’target=“空白”> https://www.ncbi.nlm.nih.nih /tools/primer-blast/< a>从wt DNA序列中扩展感兴趣的区域。在我们的案例中，在CFTR基因中有三个内部区域:第一，在内向12和内向13之间的1.522 bp区域，其中包括核苷酸c.1679+1634。第二，一个2.012 bp的区域在内向18和内向20之间，其中包括核苷酸c。包括核苷酸c.3718-2477。狭窄的位置包括5氧化的Fw和Rv引物的末端，以促进克隆到pSPL3等离子体。我们把XhoI放在三个Fw引物上，NheI放在前两个Rv引物上;XbaI曾经在第三个基因序列中使用过，就像一个NheI站点已经存在一样。用收缩酶来帮助digestion。< / br / > < / br / > < tbody > < tr > < td > 小型克隆引物 < / td > < td > < / br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MGin12-in13fw < br / > < / td > < td > CACACACTCGAGTGTGTTGTCCAGTTTTGGATGA < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MGin12-in13rv < br / > < / td > < td > CTCACAGCTAGCACTGGTTTAGCATGAGGCGG < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MGin18-in20fw < br / > < / td > < td > CTCACTCTCGAGTGACTAGGAATAGAATGGGGAGAG < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MGin18-in20rv < br / > < / td > < td > CACACAGCTAGCACAATGGAAATTCAAAGAAATCACT < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MGin22-in23fw < br / > < / td > < td > CACACACTCGAGACAGTACTGGATAGTCCTCTGA < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MGin22-in23rv < br / > < / td > < td > CACACATCTAGAGCCTATGAGAAAACTGCACTGG < br / > < / td > < / tr > < / tbody > < /桌> < / br / >
2. 来自单一捐赠者，Amsbio, Abingdon，英国的基因组DNA样本(基因组DNA DNA正常组织长度)的放大目标区域< / br / >< / br / > PCR基因组DNA放大到构建混合小型学 < tbody > < tr > < td > DNA模板(20 ng /μl) < / br / > < / td > < td > 3μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 5x Phusion缓冲区 < / td > < td > 4μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10mm dNTPS < / td > < td > 0。4μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10μM FW引物来自< br / > < / td > < td > . 5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10μM RV引物< br / > < / td > < td > . 5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Phusion polymerase < / td > < td > . 5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 无核水 < / td > < td > 了20μl < br / > < / td > < / tr > < / tbody > < /桌> < / br / > PCR项目 < tbody > < tr > < td > 初始变性 < / td > < td > 98度 < / td > < td > 30 s < / td > < / tr > < tr > < td > 35循环 < / td > < td > 98度 < / td > < td > 30 s < / td > < / tr > < tr > < td > < / br / > < / td > < td > 57度C < / td > < td > 30 s < / td > < / tr > < tr > < td > < / br / > < / td > < td > 72度C < / td > < td > 2分钟 < / td > < / tr > < tr > < td > 最终扩展 < / td > < td > 72度C < / td > < td > 10分钟 < / td > < / tr > < tr > < td > 抱着< br / > < / td > < td > 4 C < / td > < td > < / br / > < / td > < / tr > < / tbody > < /桌> < / br / >
3. 在TAE缓冲区，运行100 bp和1 kb梯度作为标准和净化PCR产品使用QIAquick PCR清洗工具包(QIAGEN)。
4. 与选定的内切酶消化1μg每个净化产品和净化凝胶萃取正确大小的乐队在1%的琼脂糖凝胶电泳后TAE缓冲区使用StrataPrep DNA凝胶萃取设备(安捷伦)。
5. 消化2μg质粒与XhoI pSPL3 NheI酶和特许权和净化pSPL3质粒骨架(5 kb)的大乐队的琼脂糖电泳(TAE缓冲1%琼脂糖)后,使用StrataPrep DNA凝胶萃取工具包(安捷伦)。
6. 用10单位T4连接酶(NEB)，分别用150 ng纯化的XhoI/Nhei酶解pSPL3主链，分别用50 ng的PCR扩增产物和50 ng的PCR扩增产物制备连接体，在16℃孵育4 h。
7. 使用三种结扎2μl反应变换1瓶50μl DH5α主管 E。杆菌(内)。种子改变了 E。杆菌 100年LB-agar培养皿包含μg /毫升的氨苄青霉素选择标记与pSPL3-derived质粒转化殖民地。37℃孵育16小时
8. 选择和成长5克隆扩增子的殖民地从每个5毫升的磅与氨苄青霉素(100μg /毫升)15毫升聚丙烯管,24 h后净化plasmidic文化使用NucleoSpin质粒DNA工具包(MACHEREY-NAGEL)。
9. 序列质粒DNA (TubeSeq service, Eurofins)使用选定的引物SEQpspfw和SEQpsprv，并通过以下PCR设置和程序，在至少一个纯化质粒中成功克隆每个wt扩增序列到pSPL3质粒。我们将这些质粒分别称为wt minigenes, pMG-in12-wt, pMG-in19-wt和pMG-in22-wt，因为它们分别包含内含子12、19和22的序列。< br / > < br / > 测序pSPL3引物 tbody > < < tr > < td > SEQpspfw < br / > < / td > < td > TCACAGTCTATTATGGGGTACGG < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > SEQpsprv < br / > < / td > < td > AATTTCTGGGTCCCCTCCTGA < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > PCR反应建立 tbody > < < tr > < td > 中提取DNA (20 ng /μl) < br / > < / td > < td > 3μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 5x灌注缓冲液 < / td > < td > 4 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10mm dNTPs < / td > < td > 0.4μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10 ?米FW底漆< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10μM房车底漆< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Phusion聚合酶< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Nuclease-free水< br / > < / td > < td > 20μl < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > PCR程序 < br / > tbody > < < tr > < td > 最初的变性< br / > < / td > < td > 98°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 35个循环 < / td > < td > 98°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 57°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 72°C < br / > < / td > < td > 2分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 最后扩展< br / > < / td > < td > 72°C < br / > < / td > < td > 5分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 持有< br / > < / td > < td > 4°C < br / > < / td > < td > < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / >
10. 进行位点定向突变，创建包含所需突变的微型基因质粒，通过使用QuikChange II试剂盒(Agilent)和选择包含所需突变的PCR引物对，实现位点定向突变。< br / > < br / > tbody > < < tr > < td > 定向诱变 < br / > < / td > < td > < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MD1811 + 1.6 kba> Gfw < br / > < / td > < td > CCTATGTACTTGAGATGTAAGTAAGGTTACTATC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MD1811 + 1.6 kba> Grv < br / > < / td > < td > GATAGTAACCTTACTTACATCTCAAGTACATAGG < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MD3272-26A> Gfw < br / > < / td > < td > GTGTTTATGTTATTTGCAGTGTTTTCTATGG < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MD3272-26A> Grv < br / > < / td > < td > CCATAGAAAACACTGCAAATAACATAAACAC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MD3849 + 10 kbc> Tfw < br / > < / td > < td > CTGTTGCAGTATTAAAATGGtGAGTAAGACACCCTGAAAG < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > MD3849 + 10 kbc>和< br / > < / td > < td > CTTTCAGGGTGTCTTACTCaCCATTTTAATACTGCAACAG < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > 位点定向诱变反应装置 tbody > < < tr > < td > 5x反应缓冲液 < / td > < td > 5 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Pfu Turbo DNA聚合酶 < / td > < td > 1 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10μM马里兰州弗雷德里克底漆< br / > < / td > < td > 1.25μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10 ?米MD房车底漆< br / > < / td > < td > 1.25μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 质粒DNA (25 ng /μl) < br / > < / td > < td > 1 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Nuclease-free水< br / > < / td > < td > 50μl < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > 定向诱变程序 tbody > < < tr > < td > 最初的变性< br / > < / td > < td > 95°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 16个循环 < / td > < td > 95°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 56°C < br / > < / td > < td > 1分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 68°C < br / > < / td > < td > 6分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 最后扩展< br / > < / td > < td > 68°C < br / > < / td > < td > 2分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 持有< br / > < / td > < td > 4°C < br / > < / td > < td > < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > 消化质粒模板加1 ? l DpnI酶直接向每个PCR反应;37℃消化1小时。< br / > < br / >
11. 使用2μl每个定点诱变的反应,现在包含mini-gene质粒与所需的突变,将1瓶50μl 5股alpha主管 E。大肠杆菌 (NEB)，转化后的大肠杆菌E。杆菌包含100μg /毫升的LB-agar培养皿中氨苄青霉素的选择改变了殖民地的标志。37℃孵育16小时。
12. 选择5殖民地来自每个定向诱变反应,和生长在5毫升的磅与氨苄青霉素(100µg /毫升)的24小时15毫升聚丙烯管,然后使用NucleoSpin提取质粒DNA质粒工具包(MACHEREY-NAGEL)。
13. 序列质粒DNA样本(TubeSeq service, Eurofins)，使用选定的筛选引物，在至少一个菌落的每个目标质粒上确认所需的突变序列。< br / > 筛选引物< br / >< / br / > 筛选底盘 < tbody > < tr > < td > in12Ufw < br / > < / td > < td > AAGAACAGAGTGTGGGGAAGA < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > in12Drv < br / > < / td > < td > GCATTTTGTTCCTTGTAGTTTCAG < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > in19Ufw < br / > < / td > < td > ACTCCCAGTGGTAGCCAAGA < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > in19Drv < br / > < / td > < td > GCACGAAGTGTCCATAGTCCT < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > in22Ufw < br / > < / td > < td > TCATTCAGTGGGTATAAGCAGCA < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > in22Drv < br / > < / td > < td > GACATACCCTAAATCTAAGTCAGTG < br / > < / td > < / tr > < / tbody > < /桌> < / br / >
在CFTR中克隆原始序列
1. 使用CRISPR设计网站工具( http://crysr.mit.edu )在感兴趣基因的内区域内识别和选择gRNAs序列我们选择了三个不同的RNA目标序列上游指南(b1 - u3)和三个不同的RNA序列下游指南(D1-D3)我们有RNAs pairs指南，他们生产的目标尺寸可以很容易地检测到标准的agarose凝胶。如果有更多的灵媒探测方法被使用，像碎片分析(FLA)一样，它可以选择RNAs指南来消除任何必要的大小。应该注意到这样的指导方针接近于神圣的剪切地点或分支点不应该被使用。CRISPR设计网站工具为特定区域的每一个可能的RNA指南提供一个分数，这可以帮助选择使用的最佳RNAs指南。
2. CRISPR设计网站工具也将证明产生dsDNA碎片对克隆使用BbsI覆盖体液pSpCas9-(BB)- 2a - gfp (Addgene.org PX458)的金门策略的愿望和压倒性的顺序。金门克隆依赖于使用狭窄的酶，清除他们识别序列的外部，创造了四个侧翼重叠的基地。当它被BbsI酶分解时，它们被设计成可怜的叠加形式，这样它们就可以在正确的方向上被复制到等离子体中。随着成功的溶解分解BbsI的每一个循环BbsI digestion的位置将会增加成功克隆。
3. 退火和反义益生元(1μg /μl)通过混合5μl每85μl nuclease-free水和5μl T4连接酶缓冲管(内)在1.5毫升、和加热管在一块95°C的5分钟。关掉加热块之后让管慢慢冷却。< br / > < br / > 寡核苷酸表达gRNAS切除内含子12区 tbody > < < tr > < td > gin12U1fw < br / > < / td > < td > CACCGGAAACTGTGTACATTTTGAT < br / > < / td > < td > gin12U1rv < br / > < / td > < td > AAACATCAAAATGTACACAGTTTCC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin12U2fw < br / > < / td > < td > CACCGAGTATGCAAGAGCTACATAA < br / > < / td > < td > gin12U2rv < br / > < / td > < td > AAACTTATGTAGCTCTTGCATACTC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin12U3fw < br / > < / td > < td > CACCGGACTTTTAAAGTTTTGCCAT < br / > < / td > < td > gin12U3rv < br / > < / td > < td > AAACATGGCAAAACTTTAAAAGTCC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin12D1fw < br / > < / td > < td > CACCGATGTACTTGAGATGTAAGTA < br / > < / td > < td > gin12D1rv < br / > < / td > < td > AAACTACTTACATCTCAAGTACATC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin12D2fw < br / > < / td > < td > CACCGTTACTCATACTTTCCTTATT < br / > < / td > < td > gin12D2rv < br / > < / td > < td > AAACAATAAGGAAAGTATGAGTAAC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin12D3fw < br / > < / td > < td > CACCGTTATCTCATTTCTATTAATA < br / > < / td > < td > gin12D3rv < br / > < / td > < td > AAACTATTAATAGAAATGAGATAAC < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > 寡核苷酸表达gRNAS切除内含子19区 tbody > < < tr > < td > gin19U1fw < br / > < / td > < td > CACCGTTTACTTGGCTACCAGAGAT < br / > < / td > < td > gin19U1rv < br / > < / td > < td > AAACATCTCTGGTAGCCAAGTAAAC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin19U2fw < br / > < / td > < td > CACCGAGTTACCCTCTTTTTTTACT < br / > < / td > < td > gin19U2rv < br / > < / td > < td > AAACAGTAAAAAAAGAGGGTAACTC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin19D1fw < br / > < / td > < td > CACCGGTTATTTGCAGTGTTTTCTA < br / > < / td > < td > gin19D1rv < br / > < / td > < td > AAACTAGAAAACACTGCAAATAACC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin19D2fw < br / > < / td > < td > CACCGTTTCTATGGAAATATTTCAC < br / > < / td > < td > gin19D2rv < br / > < / td > < td > AAACGTGAAATATTTCCATAGAAAC < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > 寡核苷酸表达gRNAS，切除内含子22区 tbody > < < tr > < td > gin22U1fw < br / > < / td > < td > CACCGCATTTTAATACTGCAACAGA < br / > < / td > < td > gin22U1rv < br / > < / td > < td > AAACTCTGTTGCAGTATTAAAATGC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin22U2fw < br / > < / td > < td > CACCGCATCTGTTGCAGTATTAAAA < br / > < / td > < td > gin22U2rv < br / > < / td > < td > AAACTTTTAATACTGCAACAGATGC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin22U3fw < br / > < / td > < td > CACCGCTTGATTTCTGGAGACCACA < br / > < / td > < td > gin22U3rv < br / > < / td > < td > AAACTGTGGTCTCCAGAAATCAAGC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin22D1fw < br / > < / td > < td > CACCGTTGATCCAACATTCTCAGGG < br / > < / td > < td > gin22D1rv < br / > < / td > < td > AAACCCCTGAGAATGTTGGATCAAC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > gin22D2fw < br / > < / td > < td > CACCGATCCAACATTCTCAGGGAGG < br / > < / td > < td > gin22D2rv < br / > < / td > < td > AAACCCTCCCTGAGAATGTTGGATC < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / >
4. 每个以前退火混合50 ng gRNA-encoding益生元对150 ng的质粒pSpCas9——(BB) 2 a-gfp 2μl 10 x T4DNA连接酶缓冲区,µl T4 DNA连接酶和1μl BbsI酶和水总量的20μl。为了将退火后的双链片段克隆到pSpCas9-(BB)- 2a - gfp质粒中，使用以下的golden gate克隆热循环程序: < br / > <退火后寡核苷酸强>金门克隆成pSpCas9-(BB)- 2a - gfp质粒 tbody > < < tr > < td > 10个循环 < / td > < td > 37°C < br / > < / td > < td > 5分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 16°C < br / > < / td > < td > 10分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 37°C < br / > < / td > < td > 20分钟 < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 80°C < / td > < td > 20分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 持有< br / > < / td > < td > 4°C < br / > < / td > < td > < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / >
5. 变换50μl主管DH5α E。杆菌(内)使用2μl之前的反应和板与100磅琼脂培养皿μg /毫升氨苄青霉素。37℃孵育16小时。
6. 取5菌落于含氨苄青霉素的5 ml选择性LB培养基中，15 ml聚丙烯管中，培养24 h后提取质粒DNA。
7. 序列质粒(Tubeseq, Eurofins)使用pcas9SEQfw和pcas9SEQrv引物在至少一个选定的菌落中成功克隆退火寡核苷酸。< br / > < br / > pcas9序列引物 < div风格= "空白:nowrap;} " > tbody > < < tr > < td > pcas9SEQfw < br / > < / td > < td > GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > pcas9SEQrv < br / > < / td > < td > GTCTGCAGAATTGGCGCAC < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > < / div >
构建表达质粒的gRNAs/Cas9对CFTE细胞共转染
1. 转染前，将CFTE细胞置于培养瓶中，MEM + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素，37℃，5% CO2，用胰蛋白酶- edta每周传代2次。
2. 转染前24小时，在免费抗生素MEM + 10% FBS培养基中，将10万个CFTE细胞接种于12孔板中。对于其他类型的细胞，种子足够的细胞有大约90%的融合后24小时。
3. 用程序B中构建的表达质粒Cas9/gRNA的配对质粒转染细胞，其中一个质粒表达突变上游的一个guideRNA，另一个表达突变下游的一个guideRNA，从而切除两个gRNA靶序列之间的区域。由于gRNA对的切除效率可能不同，因此对不同的gRNA对组合进行检测是值得的。我们用4μl Lipofectamine 2000和0.8μg每个质粒。其他细胞类型可能需要不同的转染试剂或不同的转染条件。
4. 使用DNeasy Blood and Tissue kit转染48小时后从转染细胞中提取总DNA。使用Nanodrop 2000检查总核酸浓度。< br / > 注:RNase可按DNeasy kit协议中的描述添加，用于从样本中去除RNA，以便更准确地测量DNA浓度。
5. 使用以下设置反应和PCR程序对三个不同的靶向内含子区域进行PCR，检测CFTE细胞基因组DNA中产生的切口。使用程序A中描述的筛选引物和下列PCR条件。< br / > < br / > PCR反应建立 tbody > < < tr > < td > 中提取DNA (~ 20 ng /μl) < br / > < / td > < td > 3μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 5x灌注缓冲液 < / td > < td > 4 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10mm dNTPS < / td > < td > 0.4μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10 ?米FW底漆< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10μM房车底漆< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Phusion聚合酶< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Nuclease-free水< br / > < / td > < td > 20μl < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > PCR程序 < br / > tbody > < < tr > < td > 最初的变性< br / > < / td > < td > 98°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 35个循环 < / td > < td > 98°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 57°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 72°C < br / > < / td > < td > 1分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 最后扩展< br / > < / td > < td > 72°C < br / > < / td > < td > 5分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 持有< br / > < / td > < td > 4°C < br / > < / td > < td > < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / >
6. 执行1.5%的琼脂糖凝胶电泳TAE缓冲看到产品较小的大小对应于不同的产生(图1)割断。选择最有效的质粒对生产切除的三个目标intronic区域上使用微密度分析软件(Bio-Rad) Bio-Rad凝胶文档系统。< br / > < br / > 图1 。在基因组CFTR的内含子12(上)、内含子19(中)或内含子22(下)中表达质粒的不同对Cas9/gRNA产生的切除。 gin12U2和gin12D1被认为是去除内含子12中选定序列效率最高的一对，同时gin19U1和gin19D1被认为是去除内含子19和22中目标序列效率最高的一对。< br / >< div风格= "空白:nowrap;} " > < br / > < / div >
(可选)构建p串联式质粒曾经最有效的一双gRNAs特许权感兴趣的特定的intronic地区已确定,可以克隆表达磁带从质粒表达gRNAs目标序列上游(gin12U2, gin19U1和gin22U1)和sub-clone成NheI / XbaI网站针对序列的质粒表达gRNAs在同一intronic下游地区(gin12D1, 19 d1和gin22D1)分别获得三个质粒(pTandem-in12,pTandem-in19和pTandem-in22)表达每对grna中的两个grna。此细化可选为将表达一个gRNA的两个质粒作为一对，在所有感兴趣的三个区域的切除效率是相似的。
1. PCR扩增上游表达gRNA (gin12U2, gin19U1和gin22U1)质粒的gRNA表达盒，引物分别在每个PCR产物的5 '和3 '处加入NheI和XbaI。< br / > < br / > 寡核苷酸用于p串联质粒构建 tbody > < < tr > < td > Pc9tand fwNheI < br / > < / td > < td > CACACAGCTAGCGAGGGCCTATTTCCCATGATT < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Pc9tand rvXbaI < br / > < / td > < td > CACACATCTAGATCTAGCTCTAAAACAAAAAAGC < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > PCR反应建立扩增gRNA表达盒 tbody > < < tr > < td > 质粒(~ 20 ng / ? l) < br / > < / td > < td > 3μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 5x灌注缓冲液 < / td > < td > 4 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10mm dNTPS < / td > < td > 0.4μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10 ?米Pc9tand fwNheI < br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10μM Pc9tand rvXbaI < br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Phusion聚合酶< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 无核酸酶水 < / td > < td > 20μl < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > PCR程序 < br / > tbody > < < tr > < td > 最初的变性< br / > < / td > < td > 98°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 35个循环 < / td > < td > 98°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 57°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 72°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 最后扩展< br / > < / td > < td > 72°C < br / > < / td > < td > 2分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 持有< br / > < / td > < td > 4°C < br / > < / td > < td > < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / >
2. 用高纯PCR产品纯化试剂盒(Sigma-Aldrich)纯化PCR产品。
3. 消化1μg三种PCR产品和1的质粒表达相应的下游gRNAμg该地区(gin12D1, gin19D1和gin22D1) NheI和XbaI酶。< br / > < br / > 酶消化 < br / > tbody > < < tr > < td > DNA(1μg /μl) < br / > < / td > < td > 1 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > XbaI (10 U /μl) < br / > < / td > < td > 1 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > NheI (10 U / ? l) < br / > < / td > < td > 1 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 探戈缓冲< br / > < / td > < td > 1 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr >< td > 无核酸酶水 < / td > < td > 10 ? l < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / >
4. 使用高纯PCR产品纯化试剂盒纯化消化PCR和质粒(Sigma-Aldrich)
5. 建立连接反应，每个纯化的酶切PCR产物分别来自上游gRNA表达质粒(gin12U2, gin19U1, gin22U1)和相应的酶切下游表达质粒(gin12D1, gin19D1, gin22D1)。将反应温度保持在16℃，持续4小时。< br / > < br / > 结扎反应装置 tbody > < < tr > < td > 纯化消化PCR产物 < / td > < td > 1 ? l (50 ng / ? l) < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 纯化消化质粒 < / td > < td > 1μl (150 ng /μl) < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > T4连接酶缓冲液 < / td > < td > 1 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > T4连接酶< br / > < / td > < td > 1 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 无核酸酶水 < / td > < td > 10μl < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / >
6. 改变一个瓶50μl主管 E。杆菌(内)和3 ? l每个结扎的反应,和种子在磅琼脂菜肴氨苄青霉素(100 ? g / ml)。37℃孵育16小时。
7. 选择为每个转换和生长在殖民地5毫升的磅中等15毫升聚丙烯管(100μg /毫升的氨苄青霉素)24 h。提取质粒DNA。
8. 使用特定引物提取质粒DNA序列，以确定克隆构建物在至少一个群体中的正确序列。< br / > < br / > 寡核苷酸用于p串联质粒测序 < div风格= "空白:nowrap;} " > tbody > < < tr > < td > pcas9tandemSEQfw < br / > < / td > < td > TTTGTGATGCTCGTCAGGGG < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > pcas9tandemSEQrv < br / > < / td > < td > TGGAAAGTCCCTATTGGCGT < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > < / div >
用wt共转染HEK293T细胞、突变小基因组和突变小基因组，并选择表达质粒的Cas9/gRNAs对
1. 转染前，将HEK293T细胞置于T75细胞培养瓶中，DMEM + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素，37℃，5% CO2，用胰蛋白酶- edta每周传代2次。
2. 转染前24小时，在DMEM + 10% FBS培养基中12孔板中，种子1×105 HEK293T细胞。
3. 对于每个内含子变体，转染HEK293T细胞时，使用(i) just wild type minigene construct， (ii) just mutant minigene construct，或(iii)突变的minigene construct和相应的pTandem质粒。使用4 l Lipofectamine 2000和1.6 ? g的质粒DNA,与一个克分子数相等的分布,当使用一个以上的质粒。表1总结了不同的实验条件。< br / > < br / > 表1 。minigenes法不同实验条件小结 < br / >
4. 转染48小时后，分别用DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN)和NucleoSpin RNA (MACHEREY-NAGEL)从每个转染的HEK293T样本中提取总DNA和总RNA。
5. 从转染了突变体minigene和相应的pTandem质粒的细胞中提取总DNA。
6. 建立以下PCR扩增，检测每个突变体中相应的p串连质粒产生的切除。为了得到可以在琼脂电泳中区分的来自已切除和未切除的微小基因组的PCR产物，使用载体的一个测序引物(步骤A9)和相应克隆序列的一个筛选引物(步骤A13)，如下图所示: < br / > 引物用于检测突变体的切除在pMG-in12中:pspSEQrv和in12Drv 在pMG-in19中:in19Ufw和pspSEQrv 在pMG-in23中:pspSEQfw和in22Drv < div > < br / > < / div > PCR反应建立 tbody > < < tr > < td > 中提取DNA (~ 20 ng /μl) < br / > < / td > < td > 3μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 5x灌注缓冲液 < / td > < td > 4 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10mm dNTPS < / td > < td > 0.4μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10μM fw底漆< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10μM房车底漆< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Phusion聚合酶< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 无核酸酶水 < / td > < td > 20μl < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > PCR程序 < br / > tbody > < < tr > < td > 初始变性 < / td > < td > 98°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 35个循环 < / td > < td > 98°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 57°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 72°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 最后扩展< br / > < / td > < td > 72°C < br / > < / td > < td > 2分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 持有< br / > < / td > < td > 4°C < br / > < / td > < td > < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / >
7. p串联式质粒在突变的小型基因组中产生的切除可以在1.5%琼脂糖凝胶TAE缓冲液中检测到，作为一个较小的扩增产物(图2F、3F和4F)。由于已切除的PCR产物与未切除的PCR产物之间存在同源性，在电泳中可能会出现与异型双链产物相对应的额外条带。
8. 使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher)从提取的RNA样本中产生cDNA。使用Nanodrop 2000检测产生的cDNA浓度。
9. PCR扩增cDNA样本使用特定引物为外显子序列的pSPL3。< br / > < br / > RT-PCR pSPL3引物 tbody > < < tr > < td > RTpspfw < br / > < / td > < td > TCTGAGTCACCTGGACAACC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > RTpsprv < br / > < / td > < td > ATCTCAGTGGTATTTGTGAGC < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 5 ' FAM- RTpspfw < / td > < td > FAM-TCTGAGTCACCTGGACAACC < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > PCR反应建立 tbody > < < tr > < td > 互补脱氧核糖核酸(~ 20 ng /μl) < br / > < / td > < td > 3μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 5x灌注缓冲液 < / td > < td > 4 ? l < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10mm dNTPS < / td > < td > 0.4μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10μM RTpspfw < br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 10μM RTpsprv < br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > Phusion聚合酶< br / > < / td > < td > 0.5μl < br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 无核酸酶水 < / td > < td > 20μl < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / > PCR程序 < br / > tbody > < < tr > < td > 最初的变性< br / > < / td > < td > 98°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 35个循环 < / td > < td > 98°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 57°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > < br / > < / td > < td > 72°C < br / > < / td > < td > 30年代< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 最后扩展< br / > < / td > < td > 72°C < br / > < / td > < td > 2分钟< br / > < / td > < / tr > < tr > < td > 持有< br / > < / td > < td > 4°C < br / > < / td > < td > < br / > < / td > < / tr > tbody > < / < /表> < br / >
10. 对RT-PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用StrataPrep试剂盒(Agilent)对不同大小的片段进行凝胶提取纯化。
11. 用RTpspfw引物和RTpsprv引物对提取的条带进行测序，对比wt minigene和wt minigene对引入突变的剪接效果，并了解Cas9/ grna切除对每个突变的minigene恢复畸变剪接的效果。
12. 重复上述RT-PCR，但使用5 ' FAM RTpspfw标记引物(Eurofins)和非标记标准RTpsprv获得5 ' FAM标记PCR反应。
13. 使用高纯PCR产物纯化(Sigma-Aldrich)纯化5 ' FAM标记PCR反应，并进行片段长度分析(Eurofins)，以量化每个RT-PCR产物的百分比作为峰面积。在片段长度分析中，荧光标记PCR产物通过毛细管电泳分离，并与尺寸标准进行比较。

数据分析

实验一式三份。< br / > ,通过PCR和琼脂糖凝胶电泳，利用GelDoc软件分析(Bio-Rad)对CFTE细胞中gRNA对产生的靶向性切除进行定量。所选择的gRNA对能够在基因组CFTR基因中产生切除效果，效率分别为33%、30%和47%，以缩小尺寸PCR产物的百分比来衡量(图1)。< br / > ,图2F、3F和4F显示了来自切除质粒的缩小大小扩增子的百分比;使用GelDoc软件分析(Bio-Rad)对这一比例进行量化。< br / > ,图2-4中的FLA电图显示了(i)来自突变的小分子igene (2B, 3B, 4B)的wt minigene (2B, 3B, 4B)的转录本的大小和百分比，(ii)来自突变的小分子igene (2D, 3D, 4D)，以及(iii)经过相应的切除标记物pTandem-In质粒(2G, 3G, 4G)处理的突变小分子igene。这些百分比由FLA服务提供，与上述峰的面积相对应，与电图中峰的总面积相对应。三个感兴趣的突变均产生异常剪接，正常转录本不产生(2D、3D)或部分产生(4D);当pTandem-in质粒切除包含目标突变的内含子区域时，这种异常剪接几乎完全恢复到正常转录本的90% (2G、3G、4G)。< br / > < br / > 图2 。c.1679+1634 > G突变的微基因分析。 a . pMG-in12-WT质粒示意图，该质粒由CFTR的连续~1.5 kb区域组成，包含部分内含子12、外显子13和部分内含子13克隆自pSPL3载体的5’至3’外显子。外显子显示为方框，内含子显示为行，预测转录本显示为下面较粗的行。下面的箭头表示逆转录聚合酶链反应的pspRTfw和pspRTrv引物。B.转染pMG-in12-WT的HEK293T细胞产生的RT-PCR产物(填充峰)的电泳分析及大小标记物(未填充峰)。C.通过点箭头所示的A > G变化，可以看出与pMG-in12-WT不同的pMG-in12-A > G突变示意图。A> G改变创建一个伪外显子(?交货),包含一个在坐标系终止密码子(TAA)。三角形Cas9迂回Ψ-EX表示目标站点/ gRNAs由pTandem-in12编码向量。上面的箭头表示PCR的pspSEQfw和in12Drv引物。D.转染pMG-in12-A > G的HEK293T细胞产生的RT-PCR产物的电泳分析。E. pMG-in12-A > G靶向切除修复后突变示意图。F.琼脂糖凝胶电泳分析PCR检测pMG-in12-A > G的靶向缺失。“-”lane是仅转染pMG-in12-A > G的HEK293T细胞产生的PCR产物，“+”lane是转染pMG-in12-A > G和ptandim -in12的HEK293T细胞产生的PCR产物。顶部的条带是由非靶标DNA产生的，底部的条带是由含有靶标缺失的DNA产生的，中间的条带最有可能是在PCR后期形成的异型双链。G.与pMG-in12-A > G和pTandem-in12载体共转染HEK293T细胞产生的RT-PCR产物的电泳分析。< br / > < br / >图3 。c.3140-26A > G突变的微基因分析。 a . pMG-in19-WT质粒示意图质粒由CFTR的连续~2.0 kb区域组成，包含部分内含子18、外显子19、全部内含子19、外显子20和部分内含子20在pSPL3载体的5’和3’外显子之间克隆得到。B. pMG-in19-WT转染HEK293T细胞后RT-PCR产物的电泳分析。C. pMG-in19-A > G突变与pMG-in19-WT的区别示意图，用点箭头表示的A > G的变化。A > G的变化扩展了外显子20×25 bp，从而改变了读取帧，最终导致帧内停止密码子(TGA)。三角形表示由pTandem-in19向量编码的Cas9/gRNAs的目标位置。上面的箭头表示in19Ufw和pspSEQrv引物用于PCR。D.转染pMG-in19-A > G的HEK293T细胞产生的RT-PCR产物的电泳分析。E. pMG-in19-A > G靶向切除修复后突变示意图。F.琼脂糖凝胶电泳法检测pMG-in19-A > G的靶向缺失。“-”lane是仅转染pMGin19-A > G的HEK293T细胞产生的PCR产物，“+”lane是转染pMG-in19-A > G和ptandim -in12的HEK293T细胞产生的PCR产物。G. HEK293T细胞与pMG-in19-A > G和pTandem-in19载体共转染产生的RT-PCR产物的电泳分析。< br / > < br / > 图4 。c.3718-2477C > T突变的微基因分析。 a . pMG-in22-WT质粒示意图，包含CFTR的连续~3.2 kb区域，其中包含部分内含子22、外显子23和部分内含子23克隆自pSPL3载体的5’至3’外显子。B.转染pMG-in22-WT的HEK293T细胞产生的RT-PCR产物(填充峰)的电泳分析。C. pMG-in22-C > T突变与pMG-in22-WT的区别示意图，用点箭头表示的C > T变化。C> T改变创建一个伪外显子(Ψ-EX)包含一个在坐标系终止密码子(TAA)。三角形Cas9迂回Ψ-EX表示目标站点/ gRNAs由pTandem-in22编码向量。上面的箭头表示PCR的pspSEQfw和in22Drv引物。D.转染pMGin22-C > T的HEK293T细胞产生的RT-PCR产物的电泳分析。E.靶向切除修复后pMG-in22-C > T突变示意图。F.琼脂糖凝胶电泳分析PCR检测pMG-in22-C > T的靶向缺失。“-”lane是仅转染pMG-in22-C > T的HEK293T细胞产生的PCR产物，“+”lane是转染pMG-in22-C > T和ptandim -in22的HEK293T细胞产生的PCR产物。G.与pMG-in22-C > T和pTandem-in22载体共转染HEK293T细胞产生的RT-PCR产物的电泳分析。

致谢

该协议用于之前发表在PLOS ONE上的工作(Sanz et al.， 2017)。我们要感谢Dieter Gruenert的CFTE细胞系，感谢Feng Zhang(波士顿Broad Institute, MA)的pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒。囊性纤维化基金会(美国贝塞斯达医学博士)和囊性纤维化信托基金(英国伦敦)资助了这项工作。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

参考文献

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