图1 。 S 如何形成肿瘤球 HCC1954细胞孵育7天后。固体圆形形式代表肿瘤球（a）。个人或不考虑聚合细胞肿瘤球（b）。

注意：肿瘤球应该是实心的圆形结构，但尺寸 i> 到约250 μ span> = span> 使用聚合单元格仍然可以看到彼此附着的单个细胞。肿瘤球细胞出现融合在一起，很难将它们区分为个别单元格

材料和试剂

50x B27补充物（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：17504-044）
碱性成纤维细胞生长因子（Sigma-Aldrich，目录号：F0291）
表皮生长因子（Sigma-Aldrich，目录号：E5036）
胰岛素（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：A11429IJ）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A9576）
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12（Sigma-Aldrich，目录号：D8437）
无菌1×Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
台盼蓝（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15250-061）}
肿瘤球培养基（500ml）（见配方）

设备

带CO ₂输入的培养箱
计数室/血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：3200）
96孔超低附着板（Corning Incorporated，目录号：3474）

程序

添加B27补充（50x）肿瘤球培养基进行1x浓度为实验所需。 B27应在每次实验前新添加注意：添加B27已显示增加肿瘤球形成并维持球形培养物的几次传代（Gu等人，2011）。
收获细胞并将所得沉淀悬浮于5ml 1x PBS中。保持细胞在冰上，而不是在实验期间使用。
轻轻混合悬浮液和吸管20微升的悬浮液到eppendorf管
向eppendorf管中的细胞中加入20μl（1:1比例）的台盼蓝，并混匀。
吸取大约10微升的混合物到血细胞计数器
只计数活细胞计数的计数室的四个角象限内的亮细胞
取所需数量的细胞，加入适当体积的肿瘤球培养基，使细胞浓度为1个细胞/L。将此悬浮液保持在冰上，混匀后进行电镀
向96孔板的第一列和最后一列（第1列和第12列）加入1 x PBS，以帮助最小化培养基蒸发。这将为每一行留出10口井
种子200微升悬浮在肿瘤球培养基中的细胞（每孔200个细胞）注意：用于肿瘤球形成测定的细胞数可以随细胞类型而变化。
对于每个细胞系或处理，将种子细胞接种到2行的孔中，总共20个孔。这将等于4,000个单元格。
用实验室胶带密封96孔板的上边缘和下边缘，以避免培养基的蒸发，并将细胞置于设定为37℃的培养箱中，并向细胞提供5％CO 2 周。
注意：不更改或添加介质，以免干扰肿瘤球的形成。
在一周孵育后，使用40倍放大透镜在相差显微镜下计数肿瘤数目（参见图1）。
结果可以表示为存在的肿瘤球的数目除以接种的细胞的初始数目（4,000个细胞）的百分比。

食谱

肿瘤球培养基（500ml）
20ng/ml表皮生长因子 10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子 5μg/ml胰岛素
0.4％牛血清白蛋白
500ml Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12

致谢

该方案首先在Lo等人（2012）中描述。这项工作得到了Elsa U. Pardee癌症基金会资助（B94AFFAA），美国癌症协会研究奖（RSG-10-067-01-TBE）到HC和NIH资助（3P20RR017698-08）到HC和QW的支持。

参考文献

Gu，Y.，Fu，J.，Lo，P.，Wang，S.，Wang，Q.，Chen，H。（2011）。 B27补充对在vitr中促进的效果 o Her2/neutransformed mammary tumorspheres的繁殖。生物技术研究3：7-18。
Liu，J.C.，T.Deng，R.S.Lahal，J.Kim和E.Zacksenhaus（2007）。在HER2/Neu诱导的乳腺肿瘤中鉴定肿瘤球和肿瘤起始细胞。 Cancer Res 67（18）：8671-8681。
Lo，PK，D. Kanojia，X. Liu，UP Singh，FG Berger，Q.Wang和H.Chen（2012）。 CD49f和CD61鉴定了可能源自鲁米那祖细胞并由整联蛋白-TGFβ信号传导维持的Her2/neu诱导的乳腺肿瘤起始细胞。 em> Oncogene 31（21）：2614-2626。