材料和反应

1.5微腔管(定性科学塑料，目录编号509-GRD-Q)
0。22过滤器μm (Merk, Millex-GP PES,目录号:SLGP033RB)
核免费吸管tips(优质科学塑料，目录编号:T104RLS-Q, T090RLS-Q和t112nxlls - q)
Tris (AMRESCO，目录编号0497-5KG)
钠十二烷基磺酸(SDS) (AMRESCO，目录编号0227-1KG)
EDTA，去骨盐，二氢盐(Na2EDTA·2H2O) (AMRESCO，目录编号:0105-1KG)
蛋白K (AMRESCO，目录编号:0706-100MG)
6x DNA Loading Dye(热费雪科学，目录编号:R0611)
Agarose (BIOWEST, Regular Agarose G-10，目录编号:111860)
无核水(AMRESCO，目录编号:E476-1L)
双蒸馏水(ddH2O)
DNase I, RNase-free，用10x反应缓冲区与MgCl2一起执行
TRIzol(生命科技，目录编号:15596018)
1-溴-3-氯propane (Sigma-Aldrich，目录编号:B9673)
异丙醇(AMRESCO，目录编号0918-1L)
Ethanol (Sigma-Aldrich，目录编号:459836-2L)
HCl(新化学制品，分析里根等级)
NaOH(钠水仙球团)(上海生物科技，目录编号:A100173)
通用1 kb DNA Ladder(热费雪科学，目录编号SM0311)
HEPES free acid (AMRESCO，目录编号0511-1KG)
甘露醇(AMRESCO，目录编号:0122-500G)
琥珀(AMRESCO，目录编号:0335-500G)
米托普缓冲区(见模式)
10% (w/v) SDS(见模式)
1米Tris-HCl (pH 7.4)(见板)
0.5 M EDTA (pH 8.0)(见模式)
蛋白K (1 mg/ml)(见模式)
Lysis缓冲区(见模式)
1x DNase缓冲区(见模式)
75% ethanol (v/v) (see repes)

设备

吸管(RAININ, Pipet-Lite XLS)
两个加热块(杭州奥盛仪器，产品名称:干浴培养箱，产品目录号:MK200-2)
NanoDrop仪器(Thermo Fisher Scientific, NanoDrop 2000c分光光度计)
电源(Tanon，目录号:EPS 300)
凝胶成像系统(Tanon，目录号:1600)
离心机(Thermo Fisher Scientific，型号:Sorvall Legend Micro 21和Micro 21R)
pH计(Sartorius，目录号PB-10)
-80°C冰箱(Thermo Fisher Scientific)
磁性搅拌棒和磁性搅拌器
烟hood
层流柜
孵化器
4°C冰箱
-20℃冰箱

过程

该协议的流程图如图1所示。< br / > < br / > 图1 。本协议的步骤流程图

< br / >

样品预处理< br / > 注:为了检测亚线粒体定位RNA，需要不同的处理方法，如核酸酶处理或有丝分裂。我们关注线粒体RNases的失活。其他方法，如接近标记，也需要分离线粒体定位RNA从RNA污染从其他细胞隔间。 < br / > < br / >
1. 隔离从组织培养细胞线粒体黄和小王(2019)和所述测量线粒体蛋白质浓度稀释后NanoDrop仪器1 ? l的线粒体与19个样品? l 0.6% SDS。转移200μg纯化的线粒体(20μl MitoPrep缓冲区)微型离心机管和管在冰上。< br / > 注意:关于9 x 10 <一口> 6 < /一口> HEK293细胞可以从10厘米细胞培养皿收获90%的细胞密度、产量的大约250μg线粒体。
2. 将线粒体与100μl的新鲜和热裂解缓冲样品在70°C加热块5分钟。取出样本,并让它冷却到室温(RT)。
3. 加1μl 1毫克/毫升蛋白酶K的溶解产物和孵化在37°C的热块5分钟。< br / > < div风格= "空白:nowrap;} " > < br / > < / div >
RNA提取< br / > 注释:在通风柜中执行此部分。
1. 增加400 l的试剂盒和200 ? l 1-Bromo-3-chloropropane的溶解产物预处理,动摇管为1分钟,然后旋转14800 x g在RT 5分钟。
2. 将上层的无色组分转移到新的微离心管中，与等量异丙醇混合，在21000 x g温度下，4℃旋转10分钟。
3. 丢弃上清液，保存RNA颗粒。600μl冰冷的75%乙醇添加到管,轻轻地把它上下颠倒几次,和自旋在21日000 x g 5分钟在4°C。< br / > 注意:如果少量线粒体(200μg或更少),RNA颗粒可能非常小,几乎不可见的只
4. 丢弃上清液，使剩余的乙醇尽可能少。小心别把小球弄丢了。
5. 将RNA颗粒在层流箱内干燥。< br / > < div风格= "空白:nowrap;} " > < br / > < / div >
RNA治疗< br / > 注:如果线粒体DNA不干扰下游检测，DNase I处理不需要， RNA微球可直接溶解于无核酸酶水中
1. RNA颗粒溶解于40μl 1 x DNase缓冲0.5μl DNase我酝酿在37°C 10分钟,涡流管,然后旋转样品。37℃再次孵育10 min。
2. 添加0.4μl 0.5 EDTA的RNA样品加热样品在70°C一块热灭活DNase我10分钟。

数据分析

代表性数据(图2) < br / > 图2 。分离线粒体RNA的琼脂糖凝胶图像，使用或不使用DNase I处理。 300纳米g RNA。DNase I失活后，在1.5%琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色分离RNA样品。< br / > < br / > < >强数据处理< /强> < br / > 凝胶图像是用0.5 M EDTA (pH 8.0) 加入9.306 g EDTA (Mw: 372.24)至~ 40ml ddH2O，用氢氧化钠搅拌并缓慢调节pH至8.0，用ddH2O 配制至50ml 过滤器通过0.22 ? m过滤和储存在4 ? C < br / > 注:EDTA在pH值接近8.0时才会完全溶解

蛋白酶K (1mg /ml) 将1mg蛋白酶K溶解于1ml无核酸酶的水中，取下保存于-20℃

裂解缓冲< br / > 裂解缓冲液由1% SDS、10mm EDTA和10mm Tris-HCl (ph7.4) 组成为10毫升溶液: 混合8.7 ml无核酸酶水，1 ml 10% SDS, 0.2 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)， 0.1 ml 1m Tris-HCl (pH 7.4)，用无核酸酶水配制成10 ml

1x DNase buffer 将10x DNase缓冲液(MgCl2)稀释至1x无核酸水

75%乙醇(v/v) 对于100毫升溶液，将25毫升无核酸酶水加入75毫升乙醇充分搅拌，4℃ 保存

致谢

这项工作是2017年由格兰特yfa0504600优先研究项目的中国的科学技术部,由国家自然科学基金会的拨款31371439和31371439的中华人民共和国教育部基金从1000年中华人民共和国的青年人才项目。本协议由Huang et al.(2018)和Liu et al.(2017)修改而成。

相互竞争的利益

作者声明与本文内容没有利益冲突。

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