材料和试剂

4毫米比色皿（Gene Pulser比色皿，Biorad，Hercules，CA）
感兴趣的细胞系
1. 293T细胞系（ATCC，目录号：A-498）
2. Jurkat E6-1（通过NIH艾滋病试剂计划，NIH艾滋病科获得）
3. Jurkat Clone E6-1（来自Arthur Weiss博士）＆nbsp;
pNL4-3，来自艾滋病试剂计划（＃114，NIH）
pUltraHot编码mCherry（8,314 bp）是加州纳米系统研究所Jeff F. Miller的礼物
One Shot TM Stbl3 TM 化学能力 E.大肠杆菌（Thermo Scientific，目录号：C737303）
恒星细菌（Clontech，目录号：636763）＆nbsp;
Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）（Thermo Scientific，目录号：11965-092）＆nbsp;
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基（Thermo Scientific，目录号：61870127）
胎牛血清（FBS）（Omega Scientific，目录号：FB-02）
OptiMEM（Thermo Scientific，目录号：31985-070）
青霉素和链霉素（Thermo Scientific，目录号：15-140-122）＆nbsp;
L-谷氨酰胺（Invitrogen，目录号：125030-081）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Omega Scientific，目录号：FB-02）
4％多聚甲醛（PFA）（Thermo Scientific，目录号：J19943-K2）
吐温20（西格玛，目录号：P9416）
PureLink HiPure Midiprep Kit（Thermo Scientific，目录号：K210004）
DNA标签IT ® Tracker TM [异硫氰酸荧光素（FITC）]（Mirus，目录号：MIR7025）
TransIT-X2（Mirus，目录号：MIR6004）
Jet Prime（Polyplus，目录号：114-07）
Lipofectamine 2000（Thermo Scientific，目录号：11668019）
Fugene HD（Promega，目录号：E2311）
等效可溶性荧光素（MESF）的量子分子（Bangs Laboratories，目录号：647-B）
Ghost Violet 450活/死染料（Tonbo Biosciences，目录号：13-0863-T100）
抗人类免疫缺陷病毒（HIV）-1 p24单克隆抗体（71-31）（NIH AIDS试剂计划＃530）
人IgG1（Biolegend，目录号：409302）
Mix-N-Stain CF647染料（Biotium，目录号：92238）
用于293T的10％FBS完全培养基（参见食谱）
用于Jurkat细胞的10％FBS完全培养基（参见食谱）
0.02％吐温/ PBS（见食谱）

设备

37°C，5％CO ₂加湿培养箱（Thermoforma，型号：3110）
离心机（Thermo scientific，型号：ST8）
BioRad Gene Pulser Xcell电穿孔系统
LSRII Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）
分光光度计（Thermo Fisher，NanoDrop TM 2000）

软件

采集软件：BDFACSDiVa TM 软件（BD Biosciences）
分析软件：FlowJo版本10.6

程序

质粒标记
1. 使用PureLink HiPure Midiprep试剂盒（Thermo Fisher，Waltham）从stbl3 TM （Thermo Fisher，Waltham，MA）或Stellar（Clontech，Mountain View，CA）细菌中提取编码mCherry的pNL4-3和pUltraHot进行转染，嘛）。使用分光光度法测定核酸的浓度和纯度（260/280比率）。＆nbsp;
2. 根据制造商的方案，使用0.5μlFITC/1μgDNA在转染前一天用DNA标签IT ® Tracker（Mirus，Madison，WI）标记质粒DNA。使用乙醇沉淀去除未反应的标签IT ®跟踪试剂。根据制造商，每1μg质粒DNA1μl标记染料将产生每40碱基对（平均）双链DNA约一个Label分子的标记效率。用分光光度法测定标记DNA的纯度和浓度。
抗体结合
1. 根据制造商的方案，使用Mix-n-Stain CF647染料缀合抗HIV-1 p24单克隆抗体（71-31）。＆nbsp;
2. 根据制造商的方案，用Mix-n-Stain CF647染料缀合人IgG1对照。
用不同的转染试剂用FITC标记的DNA转染293T细胞
1. 板3×10 5 293T细胞<1。转染前一天将20次传代到12孔板中。在该密度下，细胞通常在24小时后以70％-80％的汇合度附着于孔的底部。
2. 接种后二十四小时，用FITC标记的和未标记的pNL4-3或编码mCherry的pUltraHot转染细胞。根据制造商的方案，转染可以在12孔板中使用1μg质粒DNA和3μlTransITX2在无血清培养基中进行。
3. 加入转染复合物6小时后，在完全培养基中培养细胞。然后将培养基更换为10％FBS完全培养基。
  注意：对于比较不同转染试剂的实验，可以用每孔1μgDNA转染不同量的转染试剂，以促进每种试剂的转染试剂与DNA的推荐比例：3μlTransITX2,4μl Lipofectamine2000,2μlJetPrime和3μlFugeneHD。＆nbsp;
4. 转染后24小时收获细胞并在PBS中洗涤一次。
  注意：对于时间过程实验，细胞可以同时转染，并在0,6,12,24,36,48和72小时收获。
5. 在室温下将细胞在4％PFA中固定15分钟。
6. 将细胞在0.2％吐温/ PBS中渗透15分钟。＆nbsp;
7. 用含有PBS / 2％BSA的100μl染色培养基中的1μg抗-p24抗体与CF647缀合，在4℃下染色HIV-1 p24蛋白的细胞30分钟。
8. 用PBS洗涤293T细胞一次。
9. 将细胞在4％PFA中固定15分钟。
用FITC标记的pUltraHot电穿孔Jurkat细胞
1. 在OptiMEM中洗涤Jurkat E6-1细胞2次，然后在OptiMEM中以1×10 6 细胞/100μl重悬细胞。＆nbsp;
2. 将1×10 6个细胞转移到4mm比色杯中，并向悬浮液中加入4μg标记或未标记的pUltraHot质粒。
3. 使用BioRad Gene Pulser Xcell电穿孔系统电穿孔Jurkat E6-1细胞，使用指数方案，250电压，350μF电容，室温下1,000电阻。
4. 将细胞立即转移到预热的培养基中并孵育细胞24小时，然后染色以获得活力和流式细胞术分析。＆nbsp;
5. 收集用pUltraHot转染的Jurkat细胞。用1μlGhostViolet 450活菌/死染料在1 ml PBS中染色Jurkat细胞，在室温下孵育30分钟。＆nbsp;
6. 用PBS中的1％FBS洗涤Jurkat细胞。＆nbsp;
7. 将Jurkat细胞在4％PFA中固定15分钟。
流式细胞术分析
1. 用BDFACSDiVa TM 软件（BD Biosciences）在LSRII Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）上获取样品。流式细胞仪配备405,488,561和635 nm激光器，太平洋蓝光发射滤光片（LP： - ，BP：450/50），Alexa fluor-488（LP：505，BP：530/30）， PE（LP： - ，BP：582/15），mCherry（LP：600 BP：610/20），PerCP-Cy5.5（LP：685，BP：695/40），APC（LP： - ，BP：十四分之六百七十〇）。 FITC荧光强度（ y -axis）以对数标度绘制，相对于荧光染料的荧光强度（x轴），用于定量蛋白质表达（例如，mCherry ）（图2）。
2. FITC和Alexa Fluor ® 647的平均荧光强度（MFIs）可以使用Quantum MESF（等效可溶性荧光染料分子）试剂盒进一步标准化，用于Alexa Fluor ® 488和Alexa如前所述的Fluor ® 647（Kapoor et al。，2009）。
  
  图2.基于两个独立的读数（DNA质粒摄取和蛋白质表达）的流式细胞术确定转染效率。显示了代表性的转染。如过程中所述，使用TransITX2转染试剂对293T细胞进行化学转染。将相同量（1μg）的DNA用于两种独立的质粒：小的（表达mCherry的B.pUltraHot，8.3kb）和大的（表达p.LN4-4的p24,14.0kb）DNA质粒。显示门控策略：A）前向和侧向散射B）双重C，D的鉴别两个独立的转染效率读数。 FITC荧光对应于FITC标记的质粒DNA的摄取（y轴）。与FITC没有光谱重叠的荧光染料用于定量蛋白质表达。可以使用荧光蛋白（例如，mCherry;显示在C中）或用荧光标记的抗体标记的蛋白质（例如，HIV-1 p24的细胞内表达）通过CF647标记的抗p24抗体检测蛋白质;显示在D）中。转染后24小时分析细胞和靶蛋白吸收的DNA的共表达。象限中的数字表示摄取FITC标记的DNA质粒的活细胞与检测到的表达蛋白的百分比。对于293T细胞中的每次化学转染显示以下点图：i）未转染的细胞（阴性对照），ii）在蛋白质表达发生之前（转染后3小时）收获的用FITC标记的DNA质粒转染的细胞，iii）用转染的细胞转染的细胞转染后24小时收获未标记的质粒（当可以定量蛋白质表达时）iv）用FITC标记的DNA质粒转染的细胞，并在转染后24小时收获（当可以定量蛋白质表达时）。在该图中，Q3象限显示许多表达蛋白质但未显示与质粒DNA摄取相关的荧光的细胞。应使用Q1 + Q2（DNA信号）或Q2 + Q3（蛋白质信号）作为转染效率的读数。 E.在用FITC标记的DNA mCherry质粒进行电穿孔后24小时收获的人淋巴细胞（Jurkat E6细胞）中定量转染效率，无需使用2种不同质粒和GFP报告基因的共转染。

数据分析

用来自未转染细胞的信号对峰值荧光测量结果进行空白校正，并将其标准化为1×10 6个 4 细胞，具有来自相同孔的相应细胞密度值。数值表示为每10个细胞的最大荧光（中值荧光强度; MFI）或相对荧光单位（rfu）。 24和48小时的细胞活力表示为细胞总数的活细胞％（基于死亡染料），并且可以与来自未转染的对照细胞的活力进行比较。该方法考虑到细胞毒性作为转染的直接结果和核酸本身并且使用两个独立的转染效率读数：a）细胞在细胞摄取过程中吸收的质粒核酸的量转染b）编码的表达蛋白的量。总之，我们提供了一种相对简单，快速和稳健的流式细胞术方法，可用作优化转染效率的工具。

食谱

10％FBS完全培养基293T
DMEM补充：
10％热灭活FBS
100单位/ ml青霉素和链霉素
2mM L-谷氨酰胺
用于Jurkat细胞的10％FBS完全培养基
RPMI1640补充：
10％热灭活FBS
100单位/ ml青霉素和链霉素
2mM L-谷氨酰胺
0.02％吐温/ PBS
在20ml PBS中的4μl吐温20

致谢

我们要感谢由美国国立卫生研究院[加州大学洛杉矶分校艾滋病研究中心（CFAR）NIH / NIAID 5P30 AI028697]和加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所支持的艾滋病研究病毒学核心实验室和基因和细胞治疗核心中心。和加州大学洛杉矶分校生物科学资源委员会。 NIH授予NIH / NCATS拨款＃UL1TR000124，NIH K08AI08272以及加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所/加州大学洛杉矶分校艾滋病研究中心（CFAR）（NIH / NIAID AI028697）的资助，支持该研究。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院或任何资助者的官方观点。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿方面没有任何作用。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益存在。

参考

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Kim，T.K。和Eberwine，J。H.（2010）。哺乳动物细胞转染：现在和将来。 Anal Bioanal Chem 397（8）：3173-3178。
Zhou，Z.L.，Sun，X.X.，Ma，J.，Man，C.H。，Wong，A.S.，Leung，A.Y。和Ngan，A.H。（2016）。机械振荡可增强基因向悬浮细胞的传递。 Sci Rep 6：22824。
Homann，S.，Hofmann，C.，Gorin，AM，Nguyen，HCX，Huynh，D.，Hamid，P.，Maithel，N.，Yacoubian，V.，Mu，W.，Kossyvakis，A.，Sen Roy ，S.，Yang，OO和Kelesidis，T。（2017）。一种新型快速，可重复的流式细胞仪方法，用于优化细胞中的转染效率。 PLoS One 12（9）：e0182941。
Kapoor，V.，Hakim，F.T.，Rehman，N.，Gress，R。E.和Telford，W。G.（2009）。量子点热稳定性通过FISH流式细胞仪改善了同时表型特异性的端粒长度测量。 J Immunol Methods 344（1）：6-14。