材料和试剂

注意：这些可以来自任何提供细胞培养级材料或试剂的供应商，除非另有说明。所有培养瓶和培养皿都是标准的，除非另有说明，否则可以从任何供应商处获得。
所有胎牛血清（FBS）应在56°C下加热灭活30分钟。

脊椎动物和无脊椎动物细胞的亚培养
BHK-21细胞的亚培养
1. 6孔板
2. 无菌组织培养用品（移液管，通气或塞帽烧瓶和15毫升锥形管）
3. 热灭活胎牛血清（FBS）
4. 胰蛋白胨磷酸盐肉汤
5. L-谷氨酰胺
6. 庆大霉素硫酸盐
7. 氯化钾
8. KH <子> 2 PO <子> 4
9. 氯化钠＆NBSP;
10. Na ₂ HPO ₄或Na ₂ HPO ₄·7H ₂ O
11. CaCl ₂或CaCl ₂·2H ₂ O
12. 的MgCl <子> 2 ·6H <子> 2 0
13. 完成E-MEM，温热至37°C（伯爵盐最低必需培养基，10％热灭活胎牛血清，FBS完成）＆nbsp;
14. 1x PBS-D（见食谱）
15. 胰蛋白酶原液，0.25％，温热至37°C（见食谱）
C7-10细胞的亚培养
1. 无菌组织培养用品（移液管，通气或塞帽烧瓶和15毫升锥形管）
2. 70％乙醇
3. 1x MEM
病毒生长和滴定
库存病毒准备
1. 血清移液器（5毫升，10毫升和25毫升）
2. FBS（胎牛血清）
3. 无菌组织培养级水：有关纯净水的详细讨论以及细胞培养和其他等级水的规格，请参阅实验室用水（国家卫生研究院，2013年3月）
4. 庆大霉素硫酸盐
5. L-谷氨酰胺
6. 氯化钾
7. KH <子> 2 PO <子> 4
8. 氯化钠＆NBSP;
9. Na ₂ HPO ₄或Na ₂ HPO ₄·7H ₂ O
10. CaCl ₂或CaCl ₂·2H ₂ O
11. 的MgCl <子> 2 ·6H <子> 2 0
12. 中性红
13. 完整的E-MEM，1x和2x（参见食谱）
14. 硫酸庆大霉素，100x（仅哺乳动物细胞）（见食谱）
15. L-谷氨酰胺100x（见食谱）
16. HEPES（pH 7.2-7.4），1 M（见食谱）
17. 2％中性红色原液（见食谱）
18. PBS-D（10x）（见食谱）
19. SVHR稀释剂（见食谱）
20. 胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB）（ATCC细胞可选）（见食谱）
BHK细胞斑块形成的病毒滴定
BHK细胞制备
1. 无菌组织培养用品（移液管，通气或塞帽烧瓶和15毫升锥形管）
2. 热灭活胎牛血清（FBS）
3. 胰蛋白胨磷酸盐肉汤
4. L-谷氨酰胺
5. 庆大霉素硫酸盐
6. 胰蛋白酶
7. 氯化钾
8. KH <子> 2 PO <子> 4
9. 氯化钠＆NBSP;
10. Na ₂ HPO ₄或Na ₂ HPO ₄·7H ₂ O
11. 氯化钙<子> 2
12. 氯化钙<子> 2 ·2H <子> 2 0
13. KH <子> 2 PO <子> 4
14. 的MgCl <子> 2 ·6H <子> 2 0
15. 完整的E-MEM，温度升至37°C（参见食谱）
16. 1x PBS-D（见食谱）
17. 胰蛋白酶原液，0.25％，温热至37°C（见食谱）
斑块检测的病毒滴定
1. 2％琼脂糖
2. 热灭活的胎牛血清（FBS）
3. 100％甘油
4. 热灭活胎牛血清（FBS）
5. 胰蛋白胨磷酸盐肉汤
6. L-谷氨酰胺
7. 庆大霉素硫酸盐
8. 胰蛋白酶
9. 氯化钾
10. KH <子> 2 PO <子> 4
11. 氯化钠＆NBSP;
12. Na ₂ HPO ₄或Na ₂ HPO ₄·7H ₂ O
13. CaCl ₂或CaCl ₂·2H ₂ O
14. KH <子> 2 PO <子> 4
15. 中性红
16. 完整的E-MEM 2x（参见食谱）
17. 2％中性红（见食谱）
18. SVHR Diluent（见食谱）
19. 1x PBS-D（见食谱）
20. 1 M HEPES（pH 7.4）（见食谱）
辛德毕斯病毒感染脊椎动物和无脊椎动物细胞辛德毕斯病毒感染BHK细胞
1. 离心管（Corning，15 ml Fisherbrand，目录号：05-539-5）
2. 辛德毕斯病毒感染C7-10细胞
3. 100％甘油（无菌）
4. 组织培养级水
5. 热灭活胎牛血清（FBS）
6. 胰蛋白胨磷酸盐肉汤
7. L-谷氨酰胺
8. 庆大霉素硫酸盐
9. 胰蛋白酶
10. 氯化钾
11. KH <子> 2 PO <子> 4
12. 氯化钠＆NBSP;
13. Na ₂ HPO ₄或Na ₂ HPO ₄·7H ₂ O
14. CaCl ₂或CaCl ₂·2H ₂ O
15. KH <子> 2 PO <子> 4
16. 的MgCl <子> 2 ·6H <子> 2 0
17. 胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB; Difco）
18. 完整的E-MEM（参见食谱）
19. 硫酸庆大霉素100x（见食谱）
20. L-谷氨酰胺100x（见食谱）
21. 1 M HEPES（见食谱）
22. TPB-胰蛋白胨磷酸盐肉汤（见食谱）
23. PBS-D（10x）（见食谱）
辛德毕斯病毒感染C7-10细胞
1. 甘油
2. 液体N ₂
3. 热灭活胎牛血清（FBS）
4. 胰蛋白胨磷酸盐肉汤
5. L-谷氨酰胺
6. 庆大霉素硫酸盐
7. 胰蛋白酶
8. 氯化钾
9. KH <子> 2 PO <子> 4
10. 氯化钠＆NBSP;
11. Na ₂ HPO ₄或Na ₂ HPO ₄·7H ₂ O
12. CaCl ₂或CaCl ₂·2H ₂ O
13. KH <子> 2 PO <子> 4
14. 的MgCl <子> 2 ·6H <子> 2 0
15. 完成的E-MEM培养基（参见食谱）
16. 1x PBS-D（见食谱）
辛德毕斯病毒的纯化
通过等密度离心纯化和浓缩
1. 离心管（超清）＆nbsp;
2. 小管夹
3. 废烧杯
4. 2毫升冷冻管
5. PBS-D中15％酒石酸钾（二元，半水合物）（过滤灭菌以储存并储存在4°C）
6. PBS-D中35％酒石酸钾（过滤除菌以储存并储存在4°C）
7. BCA测定（Pierce TM Rapid Gold BCA Protein Assay Kit）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A53225）
8. 氯化钾
9. KH <子> 2 PO <子> 4
10. 氯化钠＆NBSP;
11. Na ₂ HPO ₄或Na ₂ HPO ₄·7H ₂ O
12. CaCl ₂或CaCl ₂·2H ₂ O
13. KH <子> 2 PO <子> 4
14. 的MgCl <子> 2 ·6H <子> 2 0
15. PBS-D pH 7.4（见食谱）
聚乙二醇（PEG）沉淀病毒浓度
1. Kimax高强度玻璃离心管（Kimax，目录号：＃Z2514888）（普通30毫升）
2. 聚合物离心管
3. 聚乙二醇-8000（PEG-8000）
4. PBS-D中15％酒石酸钾（二元，半水合物）＆nbsp;
5. PBS-D中35％酒石酸钾
6. BCA测定（Pierce TM Rapid Gold BCA Protein Assay Kit）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A53225）
7. 氯化钾
8. KH <子> 2 PO <子> 4
9. 氯化钠＆NBSP;
10. Na ₂ HPO ₄或Na ₂ HPO ₄·7H ₂ O
11. CaCl ₂或CaCl ₂·2H ₂ O
12. KH <子> 2 PO <子> 4
13. 的MgCl <子> 2 ·6H <子> 2 0
14. Tris缓冲液，pH 7.0
15. EDTA
16. PBS-D，pH 7.4（参见食谱）
17. PEG缓冲液（见食谱）
18. 2 M NaCl（见食谱）
颗粒与PFU比的计算
没有
质谱和蛋白质组学分析
注意：所有试剂应为LCV-MS级。
蛋白质提取和消化
1. Lo-bind离心管（Eppendorf）＆nbsp;
2. 旋转过滤器（Millipore-Ultracell YM-30）
3. Pierce C18离心柱（赛默飞世尔科技）
4. 封口膜
5. Pierce BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：A53225）
6. 哺乳动物蛋白质提取试剂（M-PER）补充有50mM二硫苏糖醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：78501）＆nbsp;
7. UA缓冲液中的0.05M碘乙酰胺
8. 用100mM TEAB至10μg/ ml制备的胰蛋白酶/ Lys-C＆nbsp;
9. DTT＆NBSP;
10. 氯化钙<子> 2
11. 氯化钙<子> 2 ·2H <子> 2 0
12. KH <子> 2 PO <子> 4
13. 的MgCl <子> 2 ·6H <子> 2 0
14. 氯化钠＆NBSP;
15. 尿素
16. Tris-HCl pH 8.5
17. TEAB（Sigma，目录号：T7408-100ML）
18. 100％三氟乙酸＆nbsp;
19. IAA粉末＆nbsp;
20. 无菌1x PBS（见食谱）
21. UA缓冲区（参见食谱）
22. 100 mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）（见食谱）
23. 0.5 M NaCl（参见食谱）
24. 10％三氟乙酸（TFA）（见食谱）
25. M-PER补充50 mM二硫苏糖醇（DTT）
26. 碘乙酰胺（IAA）溶液（UA缓冲液中0.05 M IAA）（见食谱）
27. 胰蛋白酶消化液（见食谱）
LC-MS / MS数据采集
1. Picofrit 15 cm x75μmIDHPLC色谱柱，填充5μmBioBasicC18颗粒300Å（新目标）
2. 3％乙腈/0.1%甲酸
3. 100％甲酸（Thermo Scientific，目录号：28905）
4. 100％乙腈
5. 缓冲区（参见食谱）
6. B缓冲液（见食谱）

设备

脊椎动物和无脊椎动物细胞的亚培养
1. 25cm 2 烧瓶
2. 75cm 2 烧瓶
3. CO ₂细胞培养箱（任何供应商都足够）
  注意：任何供应商都足够;选择的是价格/质量和容量。所有必要的是一个水套式培养箱，可在水饱和的环境中调节至5％CO ₂ 。这将需要医疗级CO ₂ 罐（压力下的液态气体）和专用于该罐的压力调节器。如果要同时培养细胞，将需要两个培养箱，因为脊椎动物细胞在38°C温育并在28°C下无脊椎动物细胞。
4. 生物安全细胞培养罩
5. 倒置显微镜
6. 血细胞计数器
病毒生长和滴定
库存病毒准备
1. CO ₂细胞培养箱
通过噬菌斑检测进行病毒滴定
1. 摇杆平台（Bellco Biotechnology）
2. 37°C水浴
3. 稀释管架
4. 冰桶
辛德毕斯病毒感染脊椎动物和无脊椎动物细胞辛德毕斯病毒感染BHK细胞
1. 平台摇杆（Bellco Biotechnology）
2. 血细胞计数器
辛德毕斯病毒感染C7-10细胞
1. 75厘米 2 烧瓶
2. 离心分离机
3. 血细胞计数器
辛德毕斯病毒的纯化
通过等密度离心纯化和浓缩
1. 倒置显微镜
2. 平台摇杆（Bellco Biotechnology）
3. 血细胞计数器或细胞计数装置
4. 康宁 TM 聚丙烯管（微型离心管，自立式和锥形）＆nbsp;
5. Sorvall RC-5B超高速离心机
6. 贝克曼超速离心机＆nbsp;
7. Beckman SW-28转子
8. 聚合物38毫升管
9. Beckman SW-55Ti
10. 聚合物5毫升管
11. 戒指架＆nbsp;
12. 小管夹＆nbsp;
13. 手持低强度灯＆nbsp;
14. 30-100毫升梯度成型剂（Bio-Rad，型号385）
15. 中型搅拌盘
聚乙二醇（PEG）沉淀病毒浓度
1. Sorvall RC-5B超高速离心机
2. Beckman超速离心机和适当的转子和管用于所用的体积
3. 30-100毫升梯度形成剂（Bio-Rad，型号385）
颗粒与PFU比的计算
没有
质谱和蛋白质组学分析
蛋白质提取和消化
1. 台式离心机能够达到14,000 x g
2. 振动器加热块
3. 涡流
4. SpeedVac集中器
LC-MS / MS数据采集
1. Orbitrap ELITE质谱仪（或等效物; 例如，Orbitrap QE +，Orbitrap Fusion，Orbitrap Fusion Lumos）
2. Easy-nLC II液相色谱系统（或等效的HPLC / UHPLC纳流泵系统）

软件

数据处理：

符合最低规格的高性能计算机，可运行Proteome Discoverer软件（目前可用版本：2.2; Thermo Fisher Scientific）
PANTHER分类系统（ http://www.pantherdb.org/ ）

程序

协议大纲：

脊椎动物和无脊椎动物细胞的亚培养
1. BHK细胞的亚培养
2. C7-10细胞的亚培养
病毒生长和滴定
1. 库存病毒的制备
2. 通过噬斑测定进行病毒滴定
辛德毕斯病毒感染脊椎动物和无脊椎动物细胞
1. 辛德毕斯病毒感染BHK细胞
2. 辛德毕斯病毒感染C7-10细胞
辛德毕斯病毒的纯化
1. 通过等密度离心浓缩
2. 通过聚乙二醇（PEG）沉淀浓缩
计算颗粒/ PFU比率
质谱和蛋白质组学分析
1. 蛋白质提取和消化
2. LC-MS / MS数据采集
3. 数据处理

脊椎动物和无脊椎动物细胞的亚培养
BHK-21细胞的亚培养
BHK细胞的个体存量可能需要不同的传代方案，并且可能具有不同水平的存活传代。优良作法是跟踪单个培养物可以传代培养的传代次数，以便建立细胞解冻和储存的时间表。
＆NBSP;新鲜解冻的细胞可以传代多达30次。如果您不打算立即将它们分开，可将细胞在28°C温育2至3天，但必须至少分裂一次以恢复正常生长，然后再进行实验。
1. 用1x PBS-D洗涤汇合的BHK细胞单层一次，使用5ml用于25cm 2 烧瓶或15ml用于75cm 2 烧瓶。
2. 倾析PBS-D并将胰蛋白酶加入单层中。将2ml加入25cm 2 烧瓶中，或加入5ml至75cm 2 烧瓶中。在室温下孵育直至细胞开始从烧瓶中分离。使用5至10 ml血清移液管上下移液来破坏细胞团块。＆nbsp;
3. 加入BHK细胞培养基至1：1的体积以停止胰蛋白酶。重悬胰蛋白酶溶液中的细胞，并在显微镜下检查细胞团块。如果有大量残留的团块，使用5至10毫升血清移液管上下移液。＆nbsp;
4. 将细胞溶液吸移到适当大小的锥形管中。
5. 将旋转管以500 x g （台式离心机中速）旋转3至5分钟以形成坚固的颗粒。不要过度填充管。不要将管倒置混合。
6. 倒出上清液，并用适量的培养基替换。＆nbsp;
  1. 为制备单个25cm 2 烧瓶：重悬于3ml E-MEM中。将1ml细胞加入烧瓶中的10ml培养基中。可以从一个初始的25cm 2 烧瓶中以1：3的分流比（烧瓶面积）制备多达3个烧瓶。＆nbsp;
  2. 为了制备大量25cm 2 烧瓶（噬斑烧瓶或平板）：在每个待制备的烧瓶中，向无菌瓶中加入10ml E-MEM。如果您使用6孔板，则使用2毫升/孔。从瓶子中取出一些培养基并重悬细胞。加回到培养基的其余部分并充分混合。为了制备多个烧瓶或平板，将10ml细胞混合物等分到每个烧瓶25-cm 2 烧瓶中，连续旋转。一个75 cm 2 烧瓶将制成9-25 cm 2 烧瓶或4-6孔板（9.5 cm 2 / well x 6使用2ml /孔，使孔= 57cm 2 。
    注意：该方案确保细胞单层均匀并含有大致相同数量的细胞。将烧瓶放入培养箱时应小心，以免干扰细胞悬液。
  3. 为制备单个75-cm 2 烧瓶：将1ml来自单个25cm 2 烧瓶的细胞分装到30ml完全E-MEM中。
7. 将细胞在37℃的烧瓶中孵育24小时或直至融合。
8. 如果培养基不能保持pH <1。 8，用1M HEPES调节pH至终浓度为8mM HEPES。这通常不是必需的，但是如果需要调节pH，那么它应该在pH 7和8之间。
C7-10细胞的亚培养
1. 在28℃，5％CO ₂湿润环境中，在组织培养瓶中保持半悬浮的蚊子细胞系。如下所述，每隔一天进行一次亚文化。细胞在开始结块或漂浮时需要分裂。这些细胞喜欢浓缩;不要超过单层面积的1/3。
  注意：
  1. 半悬浮细胞最初松散地粘附在基质上，然后随着它们的老化而开始漂浮。有些细胞可能会紧紧粘在基质上。
  2. 不要试图完全破坏团块或刮伤细胞，这会破坏细胞。
2. 用70％乙醇清洁引擎盖下的区域。使用70％乙醇清洁引擎盖下的所有材料，并清除不需要的材料。
3. 将介质置于室温下加热。
4. 从培养箱中取出细胞瓶。观察细胞培养基的颜色（红色）和透明度的变化。
5. 在显微镜下以20x放大率观察细胞以检查单层是否有不规则性和汇合。在传代之前，细胞需要95％-100％汇合。细胞在25ml培养基中的密度为~2×10 8个细胞/ 75cm 2 烧瓶。
6. 在任何柔软的表面上猛烈地击打烧瓶侧面几次，以松开粘在烧瓶表面的任何细胞。
  注意：
  1. 如果细胞聚集成团块，尝试使用5-10 ml移液管通过上下移液几次来破碎团块，然后将细胞转移到新的烧瓶中。
  2. 可以接受小块。
7. 将25ml细胞悬浮液培养基的三分之一转移至三个烧瓶中的每一个。在每个烧瓶中加入新鲜培养基，使体积增加到原来的25毫升。如果需要细胞，如果剩下许多粘附细胞，则向原始烧瓶中加入25ml新鲜的1x MEM。如果没有，请省略此步骤。
8. 如果盖子是通风的，则盖子会紧紧地烧开，对于不通气的盖子而言松开。
9. 将烧瓶放回不高于26°C的培养箱中。蚊子细胞会在高于34°C的温度下发生热休克。
病毒生长和滴定
股票病毒准备
标准做法是在病毒的任何额外工作之前种植病毒库，从中培育出额外的病毒库存。这种做法避免了有缺陷的干扰颗粒的产生，这些干扰颗粒在连续连续通过高浓度病毒时会累积。通常，生产原种病毒需要每个细胞0.01PFU（噬斑形成单位）的MOI（感染复数）。要计算正确的MOI，必须知道要感染的细胞数量。然后将细胞数乘以所需的MOI，例如，10 6 要感染的总细胞x MOI为0.01 = 10 4 PFU of需要病毒接种物。
如果您的原种病毒为1 x 10 9 PFU / ml且您需要10 4 PFU接种物，请执行以下操作：
1. 对原种病毒进行连续稀释，首先将原种病毒1:10稀释至总共1 ml。这将是900μlPBS-D + 3％FBS中的100μl病毒上清液。这是10 -1 病毒稀释液。＆nbsp;
2. 对该样品进行连续稀释，以便在5个单独的管中进行-1至-4稀释（参见图3）。您需要的病毒量在-4稀释管中，1毫升10 -4 PFU / ml的病毒。
  
  图3.串行通道方案。该图是从 http://www.virology.ws/2009/07/06/detecting-viruses-the-plaque-assay/ 。这项工作是根据＆lt; a rel =“license”href =“http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/”＆gt; Creative Commons Attribution 3.0 Unported License＆lt; / a＆gt;许可的。
3. 尽可能多地使用1 ml / 75 cm 2 烧瓶感染所有烧瓶。不要尝试使用小于50μl病毒测量的接种物，因为稀释病毒的唯一正确方法是进行连续稀释。病毒颗粒不会进入真正的解决方案，必须小心正确地暂停它们，否则计数将被人为地高或低。或者，您可以使用100μl的-5稀释液至1 ml的体积，或使用整个-5稀释液制备10 ml的病毒并达到正确的MOI。
4. 重新冷冻你的初始病毒;这是您的主要股票，您将从中增加后续股票。通过对病毒产生CPE的细胞进行噬斑测定来定量病毒，CPE通常是产生CPE的细胞系（在这种情况下是BHK）。然而，辛德毕斯病毒在许多昆虫细胞（例如，C4-10细胞的U4.4）中不产生CPE，其不能用于噬斑测定。
  注意：
  1. 股票病毒可以从脊椎动物或无脊椎动物细胞中生长。
  2. 辛德比斯病毒非常粘，会与玻璃和塑料表面结合。我们发现康宁 TM 聚丙烯管（微量离心管，自立式和锥形）比其他品牌的塑料结合更少的病毒颗粒。一次性玻璃管用于制备噬斑测定所需的病毒稀释液。
  3. 已发现来自所有主要供应商的组织培养级试剂适用于本协议的细胞培养和病毒生产部分。
BHK细胞斑块形成的病毒滴定
BHK细胞的制备
注意：来自ATCC的个体BHK细胞库可能需要不同的传代时间表，并且可能有不同数量的可行传代。
1. 用1x PBS-D洗涤汇合的BHK细胞单层一次，使用5ml用于25cm 2 烧瓶或15ml用于75cm 2 烧瓶。
2. 倾析PBS-D并将胰蛋白酶加入单层中。将2ml加入25cm 2 烧瓶中，或加入5ml至75cm 2 烧瓶中。在室温下孵育直至细胞开始从烧瓶中分离。使用5至10 ml血清移液管上下移液来破坏细胞团块。＆nbsp;
3. 加入BHK培养基1：1以停止胰蛋白酶。重悬胰蛋白酶溶液中的细胞，并在显微镜下检查细胞团块。如果有大量残留的团块，使用5至10毫升血清移液管上下移液。＆nbsp;
4. 将细胞溶液吸移到适当大小的锥形管中，例如，10或50ml管。
5. 将旋转管以500 x g （台式离心机中速）旋转3至5分钟以形成坚固的颗粒。不要过度填充管。不要将管倒置混合。
6. 倒出上清液，用适量的培养基替换3ml用于25-cm 2 烧瓶，用9ml替换75cm 2 烧瓶。
  1. 制备单个25cm 2 烧瓶：重悬于3ml E-MEM中。将1ml细胞加入烧瓶中的10ml培养基中。可以从1个初始的25cm 2 烧瓶中以1：3的分流比（烧瓶面积）制备多达3个烧瓶。盖帽紧紧（通气盖帽，松散的非通气盖帽）。
  2. 可以从1-75cm 2 烧瓶制备9-25cm 2 烧瓶。
斑块检测的材料
用于噬斑测定的许多材料用于哺乳动物和蚊子细胞测定。重要的是在感染噬斑测定试剂瓶/平板之前立即进行病毒的连续稀释，以限制病毒与试管结合的量。
1. 确定所需的平板/烧瓶的数量，每个稀释的病毒两个孔（一式两份铺板），加上一些对照板或孔。在噬斑测定前一天，将BHK细胞分成含有~6×10 6个细胞/平板= 1×10 6个/孔细胞/孔的6孔板。通常，使用6孔板代替了单个烧瓶的使用;然而，当学习技术时，使用烧瓶要简单得多。
  注意：所需细胞数量由测定时所需的汇合度决定。由于融合与细胞覆盖的区域有关，因此通过了解细胞将在其上生长的血管区域来操纵该数量。因此，烧瓶（矩形）或孔（圆形）的面积将变化，但细胞数/ cm 2 是恒定的。（例如，1 x 10 6 细胞。对于6孔板，每口井为9.6厘米 2 播种1 x 10 6 细胞/孔×6孔，总共~58 cm 2 ，总共~6 x 10 6 细胞是种子。这些数字与任何细胞系的每种特定培养物相关，可能需要上调或下调。重要的是是测定当天的百分比汇合，在此期间细胞仍应处于对数期。
2. 在噬斑测定时，允许细胞单层变为~80％-90％汇合。
  注意：如果早晨准备好细胞并且下午进行测定，可以将细胞保存在室温下，盖子盖紧，或移到28°C培养箱中以减缓生长。
3. 从冰箱中取出要滴定的病毒并在冰上融化。＆nbsp;
4. 用900μl稀释剂（SVHR稀释剂; 1x PBS-D / 3％FBS（见食谱））填充所需数量的稀释管。需要一管/稀释液。一管用于对照（未感染），一管用于阳性感染控制。
5. 通过向含有900μl稀释剂（10 -1 ）的第一个管中加入100μl病毒制备病毒的连续稀释液，以全速涡旋稀释，去除100μl，并将其加入下一个稀释管（10 -2 ）。继续此过程，直到达到所需的稀释度。每次更换移液器吸头以避免污染病毒的“遗留”效应。
  注意：稀释应在使用前立即进行。病毒和稀释液应始终保持在冰上。＆nbsp;
6. 稀释完成后，将生长培养基倒入烧瓶中（放入无菌废物烧杯中），用血清移液管吸出平板（留下足够的液体覆盖单层）并感染每个烧瓶或6孔板的孔。用200μl适当的稀释液。在这种情况下，容器的面积不再重要，因为计算将每个稀释度的噬斑转换为PFU / ml。
7. 添加病毒时不要让单层干燥 - 即，不要一次倒入/吸取过多烧瓶/盘子的介质或尝试排出每滴水。干燥的单层是单层单层。
8. 将烧瓶在室温下放置在摇动平台上一小时。不要摇板;液体只会围绕井边旋转。将板放置在38℃的适当温度下，用于BHK细胞，每15分钟手动摇动一次。
  注意：烧瓶上的瓶盖应在摇摆时拧紧，因为它们不在适当的CO ₂ 环境中，除非它们放空，然后将它们放在培养箱中。
9. 摇动/孵育一小时后，取出接种物（移液管）并用7ml 1％的2％琼脂糖在dH ₂ O中的混合物覆盖单层，并完成2x EMEM和7ml用于T-25cm 2 烧瓶，6孔板的每个孔2ml。
  注意：
  1. 琼脂糖应该足够热，以至于它不会太快凝固，但足够冷却，以便在与培养基（~60-70°C）混合之前让人接触瓶子。在正确温度下的瓶子介质不应该感觉过热。在覆盖层固化之前不要尝试移动烧瓶/板，因为细胞单层会撕裂。凝固的琼脂会出现混浊。
  2. 培养细胞不能耐受所有琼脂糖。通常，配制用于凝胶电泳或色谱法的琼脂糖不适用于组织培养。使用Sigma琼脂糖（）（Sigma-Aldrich，St Louis，MO，目录号：A6013）。
10. 将培养瓶在37℃，5％CO ₂下孵育2天。
  注意：在染色单层膜之前，将烧瓶放在光线下，看是否可见斑块。斑块看起来比单层其他部分更不透明。可见斑块表明该测定已完成此步骤。
11. 为了染色单层，加入5毫升2％琼脂糖在dH ₂ O和1x PBS-D中的1：1混合物和3％中性红染色（需要琼脂糖总量的3％）。盖住烧瓶以保护细胞免受光照。
  注意：细胞在吸收中性红色后变得对光敏感，应避光。
12. 如有必要，当斑块微弱时，将烧瓶（平板）放回37°C保持4小时或28°C过夜，然后再计数斑块。
  注意：您应该看到被红色活细胞包围的清晰斑块。每个烧瓶的斑块数量应大致遵循所做的稀释（例如，10斑块 -6 < / sup> 烧瓶，10个 -5 烧瓶中的10个噬菌斑，以及10个 <上的100个噬菌斑 -4 烧瓶）。平板可用于生产重复（6孔板）或一式三份（24孔板）。如果没有斑块，检查显微镜下的单层细胞，可能会裂解细胞。
13. 计数斑块并计算滴度。
14. 为了计算病毒滴度：例如，在-7稀释的2个噬菌斑和200μl的接种物，将其转化为噬菌斑/ ml或2个噬菌斑x1 /200μl×10 3 < / sup>μl/ 1 ml =来自1/10 -7 稀释度的10个噬菌斑/ ml = 10 x 10 7 或1 x 10 8 PFU / ml。因此，方程式为＃斑块/稀释因子（ml）×接种体积（ml）= PFU / ml。除非病毒颗粒的数量=斑块数/ ml，否则该单位是斑块形成单位。这将在计算颗粒与PFU比率的部分中进行解释。
  注意：如果没有斑块，但阳性对照起作用，那么样品没有病毒或不正确的稀释液被接种。如果对照样品中没有斑块，则在显微镜下检查细胞裂解，裂解的细胞不会吸收污渍或产生斑块。如果培养物的渗透压和张力不正确，将发生细胞裂解。污渍晶体意味着加入时琼脂糖太热。太热的琼脂糖也会杀死细胞。
辛德毕斯病毒感染脊椎动物和无脊椎动物细胞辛德毕斯病毒感染BHK细胞
1. 在感染前一天对BHK细胞进行传代培养，使得单层在感染时约90％融合。＆nbsp;
2. 计算所需多重感染（MOI）所需的病毒量。
  编号为x MOI = PFU。
  对于单个循环MOI = 10，原种病毒MOI = 0.01
  对于75 cm 2 烧瓶，细胞数量为~2 x 10 7 细胞
  对于25 cm 2 烧瓶，细胞数量为~6 x 10 6 细胞
  对于6孔板，细胞数约为1×10 6个细胞/板。
  如果使用少量接种物，也使用平板，例如，储备病毒体积滴度太低而不能感染太多细胞，并且在使用前必须扩增病毒。
3. 从-80°C冰箱中取出病毒并在冰上解冻小瓶。在1x PBS-D / 3％FBS中将接种物稀释至所需浓度。重新冷冻未使用的病毒。
  注意：
  1. 感染75 cm 2 单层需要至少1 ml的总体积，并且至少需要200μl对于25 cm 2 单层。 6孔板至少需要200μl。盖紧盖子并固定在摇臂平台上。不要摇板。
  2. SVHR是热稳定的，但辛德毕斯的许多其他菌株和突变体都没有，因此必须在冰上解冻以保持感染性。
4. 将烧瓶置于摇动平台上，在室温下放置1小时，盖上盖子。或者，在37°C的培养箱中感染间歇性手摇。＆nbsp;
5. 取出接种物并加入新鲜，完整的1x E-MEM培养基。将5-7ml培养基加入75-cm 2 单层或3ml加入25-cm 2 单层。在孵育期间使帽松开以允许CO ₂交换。如果需要更浓缩的病毒，则将3ml培养基加入75-cm 2 单层中。不要让单层干燥。
6. 一旦CPE变得明显，应该收获病毒，通常在感染后18（BHK）和24小时（C7-10）之间。
  注意：细胞系在演示CPE的时间段内会有所不同。 BHK细胞中CPE的一些指标包括细胞变得长而细，具有“泡沫”外观的细胞质，细胞核的聚集，以及在晚期阶段的细胞裂解。不允许细胞裂解任何类型的病毒分析工作。
7. 将培养基从烧瓶中取出至锥形离心管（Corning，15ml Fisherbrand Cat＃05-539-5或50ml离心管，Fisherbrand Cat＃05-539-6）。如果需要，可以组合样品。在台式离心机中以~700 x g 旋转样品10分钟以除去细胞碎片。将病毒倒入新管中，将溶液加入10％甘油中，作为冷冻保护剂。使用液体N ₂将病毒上清液等分到适于冷冻和快速冷冻病毒的试管中。＆nbsp;
8. 将病毒储存在-80°C。
  注意：由于冰中的相变，含有膜的病毒将在-65°C进行冻融。因此，应该将导致升温至-65°C的冷冻机故障视为解冻。辛德毕斯病毒在冻融后会失去一些滴度（约0.5个对数），但仍具有传染性。
辛德毕斯病毒感染C7-10细胞
当需要对来自无脊椎动物宿主的病毒滴度进行比较分析时，使用蚊子细胞。为了感染蚊子细胞，必须形成单细胞的汇合单层（无团块）。蚊子细胞不能很好地粘附到基质上，并且无论使用何种介质，都倾向于从烧瓶中提起。为了暂时避免这个问题，蚊子培养物可以缺乏血清1小时，这导致细胞更紧密地粘附到基质上。我们实验室中的蚊子培养已经适用于E-MEM，然而，细胞的所有其他处理与其他昆虫培养基中的细胞一致。
1. 在感染所需的每1-75 cm 2 烧瓶的200-500 xg 约1½-75 cm 2 细胞瓶中旋转5分钟。
  注意：蚊子细胞生长为半悬浮培养物，通过在硬质表面上轻敲烧瓶，或者用5-10ml移液管上下吸移，可以很容易地从烧瓶中取出。不要过度旋转，因为在造粒或重新悬浮期间细胞会死亡。在此过程中，某些单元格将丢失。
2. 用1x PBS-D洗涤细胞沉淀一次以除去任何剩余的培养基。＆nbsp;
3. 将最终细胞沉淀重悬于感染所需的1ml /瓶中，缺乏FBS的E-MEM培养基。
4. 使用血细胞计数器计数细胞。＆nbsp;
5. 将每个75-cm 2 烧瓶中的大约6×10 6个细胞等分，用足够的培养基（不含FBS）覆盖单层。＆nbsp;
6. 将细胞培养瓶在28°C孵育1小时，或直至细胞牢固地附着在烧瓶表面上。＆nbsp;
7. 一旦附着细胞，移除培养基并将所需量的病毒添加到单层中。严密关闭帽子。＆nbsp;
8. 在室温下缓慢摇动烧瓶一小时。
  注意：缓慢摇动对于保持最小数量的细胞不会从烧瓶中提升至关重要。
9. 摇动后，大多数细胞应保持附着在烧瓶上。如果细胞从单层中提起，则应使用接种物将其移除。＆nbsp;
10. 应在每个烧瓶中加入新鲜，完整的E-MEM培养基。
  注意：为了增加病毒浓度，尽量减少添加到烧瓶中的新鲜培养基的体积。需要至少3 ml培养基/ 75 cm 2 来覆盖细胞并支持新陈代谢。注意烧瓶是水平的，以确保完全覆盖单层。
11. 根据使用的多重性（MOI），可以从24至72hpi收获病毒。细胞病变效应（CPE）在蚊子细胞中不明显，在这种情况下，病毒将根据感染后的时间而不是CPE来收获。＆nbsp;
12. 对于正常储存：收获病毒并储存在无菌的10％甘油中。为了最好地保存液体N ₂中的病毒滴度快速冷冻管。
  注意：病毒冷冻和解冻将失去1/3至1/5 log的滴度。这不是用于感染细胞的重大损失。为了保持最高的感染性水平，病毒可以在中性pH缓冲液中在4°C下储存长达5天。该方法保留了最大的感染性，用于在结构研究中分析病毒以及计算颗粒与PFU的比率。
辛德毕斯病毒的纯化
通过等密度离心纯化和浓缩
将病毒上清液收获到锥形管中，通过低速离心从上清液中除去细胞碎片。这是一个关键步骤，如果省略，过多的碎片会干扰下面的梯度纯化步骤。通过在适当大小的锥形管中以1,800 x g 离心10分钟来澄清病毒上清液。
1. 将病毒上清液合并到适当大小的容器中，省略添加甘油。
  注意：从这一步开始，您不应该认为您的样品是无菌的。这通常不是问题，并且抗生素被添加到2x E-MEM介质中。＆nbsp;
2. 确定所需的渐变数。
  通常，将20ml病毒分层到38ml管中的初始酒石酸钾步骤梯度上。通过将12ml 15％酒石酸钾小心地层压到6ml 35％酒石酸钾层上，或制成10％至35％连续酒石酸钾梯度，形成该梯度。有关使用梯度成形器的说明，请阅读制造商手册。将管放入转子叶片中并直立称重（我们使用带有纸巾的小烧杯）。逐滴添加PBS-D以平衡管。特别注意称重铲斗和管子，并根据制造商的公差和规格装载离心机转子。否则可能会导致转子和仪器严重损坏。
  注意：转子，铲斗和溶液应预先冷却至4°C。如果需要奇数个梯度，则制作“空白”梯度并用缓冲液覆盖以平衡转子。＆nbsp;
3. 将梯度在SW-28 Beckman转子（或10,000 x g ）和4℃下以24,000rpm离心过夜（这纯粹是为了方便）。＆nbsp;
4. 运行完成后，小心地从桶中取出管，并使用小管夹将其固定到环形支架上。当用20瓦的手持光从侧面照射梯度时，在酒石酸钾15％-35％阶梯界面处应该可以看到虹彩蓝的病毒带。参见图4密度梯度纯化的辛德毕斯病毒带。对每个渐变重复。＆nbsp;
5. 通过刺穿管底部并让酒石酸盐溶液流入废烧杯收集带子，同时将病毒带收集到2ml冷冻管中。丢弃剩余的解决方案。或者，可以使用针和注射器从管的侧面收集带。
6. 将含有病毒的样品汇集并用1.5体积的冰冷PBS-D稀释。该溶液的密度应小于15％酒石酸钾。要检查您的浓度是否正确，您的病毒溶液不应沉入15％酒石酸钾的等分试样中。＆nbsp;
7. 然后将该稀释的病毒在连续的15％-35％酒石酸钾线性梯度上分层，体积不小于添加的病毒样品的3/4。第一梯度可以是阶梯或线性梯度，但第二梯度应该是线性梯度。不要过满。＆nbsp;
8. 连续梯度在SW 40ti Beckman转子（12,000 x g ）中以26,000rpm运行2小时，并如上述步骤D6中所述收集病毒带。病毒带应出现在管长度的1/3左右。病毒带可以在4℃下储存在酒石酸盐溶液中。最终病毒 - 酒石酸盐溶液的折射率为1.3665，其为〜28％酒石酸盐（Rumble，2005）。＆nbsp;
9. 通过噬斑测定收集病毒样品以滴定，并通过BCA测定法测定蛋白质浓度（Pierce TM Rapid Gold BCA Protein Assay Kit，Thermo Fisher）。
  注意：正确生长和纯化的SVHR应该使颗粒/ PFU值为~1。
  
  图4.显示纯化的辛德毕斯病毒在15-35％酒石酸钾梯度中的乳白色蓝带。注意管底部的絮状颗粒。在第二次K-酒石酸盐梯度后，这将被删除。
聚乙二醇（PEG）沉淀病毒浓度
注意：这是用于浓缩病毒颗粒的替代纯化步骤，但传染性将会丧失。
1. 如前所述用Sindbis病毒感染BHK细胞用于病毒纯化。感染的烧瓶数量取决于您需要多少病毒。＆nbsp;
2. 将培养基倒入离心管中。＆nbsp;
3. 旋转上清液用于澄清，除去细胞和细胞碎片（从该步骤开始，如在病毒纯化方案中的步骤D2-D9中那样进行。
4. 将上清液转移到新管中。
5. 在2M NaCl中加入0.25体积的40％聚乙二醇-8000并充分混合。
6. 在4°C孵育约24小时以进行病毒沉淀。
7. 以10,000rpm（12,000 xg ）离心10分钟。
8. 将上清液丢弃到废物烧杯中并排干（将管倒置并用kimwipe吸收任何痕量的PEG）。＆nbsp;
9. 将沉淀重新溶解在5ml的1x PEG缓冲液中。
10. 转移到Kimax玻璃离心管。
11. 在12,000 x g 离心10分钟（Sorval） - 这是进一步的澄清步骤。
12. 如上所述使用上清液进行梯度纯化（从该步骤开始，按照病毒纯化方案中的步骤D2-D9进行。
注意：
1. 我们没有在我们的蛋白质组学方案中使用辛德毕斯病毒的PEG浓度，但包括该方案中的结果，以证明与非感染性颗粒相比纯化感染性病毒颗粒的重要性，以推断有关病毒系统功能的结论＆NBSP;
2. 我们发现使用辛德毕斯病毒的SVHR菌株，PEG浓度随后进行等密度纯化使颗粒/ PFU比率增加10倍。应该认真评估实验结果解释中非感染性颗粒数量的增加，并在结果中注明。
计算颗粒与PFU的比率
1. 为了使该计算值准确，需要精制蛋白质浓度的纯化病毒。酒石酸盐溶液或PEG将干扰该测定;样品必须1:10稀释。
2. SVHR病毒蛋白MW以道尔顿为单位=结构蛋白的总重量（ C，E2和E1 ）= 130 KDa（通过直接BCA测量，使用此测量数而不是计算值）。＆nbsp;
3. 该值乘以240拷贝/病毒颗粒（T = 4颗粒：60T = 240拷贝）。参见Johnson和Speir（1997）的T计算。
  130KDa（总病毒蛋白，参见步骤E2）×240（拷贝/颗粒参见上述步骤E3）= 3.12×10 7 Da蛋白/病毒颗粒
  从Da转换为克[1道尔顿= 1.66 x 10 -24 g（CRC表）]
  3.12×10 7 Da /病毒颗粒x 1.66 x 10 -24 g / Da = 5.18 x 10 -17 g /颗粒例如，如果您有10 11 PFU / ml SVHR，您将获得208μg/ ml蛋白质（通过BCA测定法测量）
  = 2.08×10 -4 g / ml。
  注意：PFU和颗粒不是同一个单位。 PFU或噬斑形成单位是病毒感染性的量度，因为所有病毒颗粒都不具有传染性。颗粒数是指溶液中物理颗粒的数量，通常大于PFU的数量。
  计算颗粒/ ml：
  2.08×10 -4 g / ml /5.18×10 -17 g /颗粒= 0.4×10 13 颗粒/ ml
  0.4×10 13 颗粒/ ml / 1×10 11 PFU / ml = 0.4×10 2 颗粒/ PFU = 40颗粒/ PFU <
  注意：对于Sindbis SVHR，BHK或C7-10细胞的颗粒/ PFU比例应为~1份/ PFU。
质谱和蛋白质组学分析
1. 为了目测确定样品是否含有污染物，然后通过透射电子显微镜观察纯化群体的样品以检查污染的细胞器或膜片段（Coombs和Brown，1987）。该方法超出了本协议的范围，但在上面提供的参考文献中有详细说明。
2. 另外，为了检查共纯化的蛋白质污染物，如制造商所述，通过在4-12％Bis-Tris SDS-PAGE梯度凝胶（Invitrogen，Novex）上运行~10μl病毒来检查蛋白质含量。
3. 在Wray方法或考马斯蓝中用银染色凝胶（Wray 等，，1981）。在进行蛋白质鉴定的LC-MS / MS分析之前，切除可视化条带（仅银色染色）并进行凝胶内消化（Glaros et al。，2015）。
蛋白质提取和消化
使用过滤辅助样品制备（FASP）方法处理病毒制剂及其各自的阴性对照，来自感染前收获的细胞单层的培养基用于LC-MS / MS分析（Wiśniewski等人， 2009）。
1. 纯化后，按照制造商的说明，使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒测定总蛋白质浓度。
2. 使用无菌PBS将所有制剂标准化至0.5μg/μl;将10μg每种样品等分到Lo-binding Eppendorf管中。
3. 对于每个样品，将10μg总蛋白（20μl）1：1与补充有50mM二硫苏糖醇（DTT）的M-PER混合，并在95℃下在加热块中以400rpm加热10分钟以减少和变性蛋白质。
4. 将样品冷却至室温，并与200μlUA缓冲液（8M尿素，100mM Tris-HCl，pH8.5）混合。
5. 将每种制剂施加到30kDa过滤器旋转柱（Millipore-Ultracell YM-30）上，并在室温下以14,000 x g 离心30分钟以将所有蛋白质收集到滤膜上。
6. 通过向每个滤膜加入100μl碘乙酰胺（IAA）溶液（在UA缓冲液中0.05M IAA）烷基化蛋白质，并在室温下在黑暗中孵育20分钟。烷基化后，将样品在14,000 x g 离心20分钟以除去烷基化溶液。
7. 通过向过滤器施加100μlUA缓冲液并在室温下以14,000 x g 离心30分钟来洗涤每个样品。重复该洗涤步骤两次，总共洗涤三次。然后用100μl100mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）洗涤三次。
8. 为了消化捕获的蛋白质，在每个膜上施加100μl胰蛋白酶消化溶液（在100mM TEAB中制备的胰蛋白酶/ Lys-C至10μg/ ml）并在密封管中孵育过夜（用封口膜包裹封闭的管帽用于更好的密封）在37℃，400转/分钟的加热块中。
9. 孵育后，收集肽用于LC-MS / MS分析。将过滤器单元放入新的干净管中，并在室温下以14,000 x g 离心每个管30分钟。通过用50μl100mMTEAB离心一次洗涤膜，用50μl0.5MNaCl离心一次。用最终的肽洗脱液收集这些洗涤液和池。
10. 用10％三氟乙酸酸化每个样品直至最终pH为~2-3。
11. 在进行质谱分析之前，根据制造商的说明，使用Pierce C18离心柱对每个样品进行脱盐。脱盐过程中的洗脱液应在30℃下使用SpeedVac在干净的Lo-bind Eppendorf微量离心管中干燥至完全，并储存在-80°C直至LC-MS / MS分析。
LC-MS / MS数据采集
1. 在“A缓冲液”（3％乙腈/0.1%甲酸）中重构干燥的肽，并使用多步梯度[例如在VIRGIN Picofrit 15 cmx75μmIDHPLC色谱柱上分离，填充5μmBioBasicC18颗粒300Å ，130分钟; 0-5分钟：5-10％B，6-110分钟：10-35％B，和111-130分钟：35-95％B]。原始或未使用的色谱柱对于确保所有鉴定的肽均来自样品而非先前的LC-MS / MS运行非常重要，如果使用已经应用样品的色谱柱，则可能会导致“残留”。应选择液相色谱梯度，以便在没有过多时间的情况下进行充分分离。这些参数取决于用于分析的色谱柱和仪器。对于梯度，A缓冲液是3％乙腈/0.1%甲酸，B缓冲液是95％乙腈/0.1%甲酸。应至少在技术上一式三份地分析胰蛋白酶肽。
2. 对于Orbitrap ELITE，使用以下配置。如果使用其他质谱仪，这应作为类似仪器参数的指南。这些参数是仪器特定的，您应该查阅仪器的制造商或文献以获取建议。从用于自下而上（胰蛋白酶肽分析）蛋白质组学的文献建立的通用设置可能是足够的。各种仪器方法已经过策划和同行评审，可在 www.massspectrometrymethods.org 上找到。
  
  用于轨道阱ELITE的仪器设置示例
  1. Orbitrap MS1扫描以1200 m / z的分辨率120,000进行，扫描范围为110 -2 ，000 m / z。
  2. 选择前20种前体用于MS2数据依赖性片段化。在正常模式下使用离子阱扫描获取MS2光谱（Top 20方法）。
  3. 触发数据相关扫描所需的最小信号为5000。
  4. 碰撞诱导解离（CID）用于产生具有以下设置的MS2光谱：标准化碰撞能量35％，默认电荷状态2，隔离宽度2m / z和激活时间10ms。
  5. 对于MS，AGC目标设定为1×10 6 ，对于MS / MS，AGC目标设定为5×10 4 ，最大累积时间为200ms。
  6. 动态排除设置为60秒，最多500个目标，质量窗口为5 ppm。
  7. 锁定质量为445.120025用于内部校准，以提高质量准确度。
数据处理
1. 使用Proteome Discoverer处理光谱数据，其具有针对辛德毕斯病毒多蛋白数据库（Uniprot ID：P03317）的嵌入式SEQUEST搜索算法，其与智人（RefSeq Tax ID：9606）或灰仓鼠（Cricetulus griseus）（RefSeq Tax ID：10029）合并。从VectorBase（Giraldo-Calderón等人，2015）下载白纹伊蚊 - 蛋白质组扣除的蛋白质组（Chen et al。，2015）数据和来自NCBI TSA数据库的其他多肽。
2. 在excel电子表格上组织非冗余蛋白质组（Ribeiro et al。，2004）并如前所述进行注释（Karim et al。，2011）。将得到的FASTA文件与SINV多蛋白合并，并用它来搜索SINV蚊子制剂。
3. 设定半胱氨酸[+ 57.02 Da]的氨基甲酰化，甲硫氨酸氧化[+15.99 Da]和N-末端乙酰化[+42.011]的动态修饰。
4. 搜索MS / MS谱，前体质量公差为10ppm，片段质量公差为0.6Da。
5. 胰蛋白酶被指定为蛋白酶，其最大错过切割数设置为2。
6. 使用PERCOLATOR（Kall 等人，2007）的错误发现率设定为＆lt; 1％得分高信度肽鉴定。
7. 仅使用每种蛋白质id的登录号，使用PANTHER分类系统对人类背景进行分组和功能分析（Mi et al。，2016）。

食谱

完整的E-MEM，1x和2x
注意：在添加补充剂之前不要加热2x MEM，它会沉淀。
10％热灭活的胎牛血清（FBS;任何合适的FBS，我们在购买之前测试样品批次的FBS）
5％胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB;见配方11;这只添加到BHK细胞中）
0.02％L-谷氨酰胺（参见配方3为100x）
1x硫酸庆大霉素（参见配方2 100x）

适用于1x中等
混合以下内容：
400毫升2x E-MEM（见配方1）
400毫升TC H ₂ O
80毫升FBS
8毫升L-谷氨酰胺
* 8毫升庆大霉素硫酸盐
在4°C下储存长达2周
*注意：庆大霉素仅添加到培养基中用于病毒生长，而不是用于任何细胞培养物的一般维护。
对于2x培养基（用于通过噬斑测定滴定病毒）
通过混合以下物质制备536 ml培养基：
400毫升2x E-MEM（不完全，无血清;参见配方1）
80毫升FBS
40毫升TPB
8毫升100倍L-谷氨酰胺
8毫升100倍硫酸庆大霉素
存放长达6个月
重要提示：含有补充剂的完整培养基不是真正的百分比溶液。指示的百分比表示原始介质体积的百分比。这也适用于添加到培养基中的任何其他补充剂。例如，如果培养基的初始体积是400ml，则10％FBS是40ml。添加其他补充剂，例如5％TPB，将是20ml TPB，使总体积达到460ml。如果细胞培养物出现问题，病毒生长或斑块形成，则丢弃旧溶液并制作新溶液。＆nbsp;
硫酸庆大霉素，100x
在组织培养级水中稀释0.5 g庆大霉素硫酸盐至100 ml
在4°C下储存长达6个月
稀释至1x将得到50μg/ ml的终浓度。如有必要，可以使用100μg/ ml
注意：抗生素可能会被污染。如果污染培养物出现持续性问题，请在没有抗生素的情况下测试所有溶液。
L-谷氨酰胺，100x
称取2.92克L-谷氨酰胺，溶于总体积为100毫升的1×PBS-D（见配方7中10倍）
过滤灭菌并在100毫升瓶中分成50毫升等分试样
储存冷冻长达6个月;一旦解冻，2周后丢弃
注意：谷氨酰胺是必需的，非常不稳定。因此，作为预防措施，它已添加到已经完整的介质中。
HEPES（pH 7.2-7.4），1 M
称出238.3克HEPES并溶解于总体积为1升的组织培养级水中用NaOH调节pH至7.2-7.4
高压灭菌30分钟消毒
在室温下储存长达1年
PEG缓冲液
0.4 M NaCl
0.01 M Tris Buffer pH 7.0
0.001 M EDTA
中性红色原液，2％
溶解2克中性红，用组织培养级水将体积调节至100毫升
在室温下搅拌过夜并过滤灭菌
在室温下储存长达1年
注意：
1. 过滤过程中会丢失一些污渍，每批可能会有所不同。这种污渍非常粘稠，可能需要一个以上的过滤器来消毒整个数量。
2. 或者，可以从许多供应商处购买中性红色原液。
PBS-D，10x
2.0克KCl
2.0克KH ₂ PO ₄
80.0克NaCl
11.3g Na ₂ HPO ₄或21.6 g Na ₂ HPO ₄·7H ₂ O
组织培养级H ₂ O至1L
高压灭菌20分钟
用无菌组织培养级水稀释至1倍
在室温下储存长达1年
注意：PBS-D是缺乏钙和镁的PBS（磷酸盐缓冲盐水）。这可以作为1x解决方案。另请参阅含钙和镁的PBS配方注释。至关重要的是1x溶液的pH值为~7.4，因为低pH会使所有的Alphaviruses失活。
含钙和镁的PBS，1x
准备溶液1和2（10倍储备溶液）并分别高压灭菌20分钟
注意：PBS不能作为浓缩溶液制成，它会沉淀。
解决方案1：
1.0克CaCl ₂
1.3g CaCl ₂·2H ₂ O
2.0克KH ₂ PO ₄（分别溶解，然后加入混合物中）
1.0g MgCl ₂·6H ₂ O
80.0克NaCl
用组织培养级H ₂ O将体积调节至1L 解决方案2：
21.6g Na ₂ HPO ₄·7H ₂ O或11.3g无水Na ₂ HPO ₄
用组织培养级H ₂ O将体积调节至1L
适用于1x解决方案：
加入50毫升溶液1至400毫升组织培养级水
混合，然后加入50毫升溶液2
不要将溶液1和2直接混合在一起：盐会沉淀出来在室温下储存溶液长达1年或直到盐开始沉淀为止检查1x溶液的最终pH值是否为7.2到7.4
重要注意事项：不要调整10x溶液1和2的pH值，因为这会导致1x溶液的pH值错误。至关重要的是，辛德毕斯病毒与之接触的所有溶液都是中性pH值。酸性pH值会迅速使病毒失活。＆nbsp;
酚红，0.5％
注意：不要与中性红混淆。
将1克酚红溶于200毫升组织培养级水中过滤灭菌并在室温下储存长达1年
SVHR稀释剂（用于稀释通过噬斑测定滴定的病毒）
使用热灭活的胎牛血清（FBS）补充1x PBS-D（参见配方7的10倍）至3％FBS
在4°C下储存长达2个月
胰蛋白酶原料，0.25％
0.5克胰蛋白酶
0.2克EDTA二钠
0.6克酚红
用1x PBS-D将体积调节至200 ml（参见配方7 10倍）
用1N NaOH调节pH直至达到樱桃红色
分成25毫升的等分试样
在-20°C下冷藏最多6个月
注意：使用前，在37°C水浴中解冻，用versene溶液稀释至100 ml（参见配方13）。不要在37℃下加热胰蛋白酶> 20分钟，因为酶会自动消化。＆nbsp;
胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB）
称出29.5克胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB; Difco）
溶于总体积为1 L的组织培养级水中高压灭菌TPB在两个独立的500毫升体积中灭菌20分钟进行灭菌不要在高压灭菌器中放置更长时间，因为这种解决方案会焦糖化冷却并在4°C下储存长达6个月
Versene解决方案
500毫升1x PBS-D（见配方7 10倍）
5毫升0.1M EDTA（见配方14）
1.5毫升0.5％酚红（见配方9）
用NaOH调节pH至7.4 过滤消毒（如果不使用无菌储备溶液）
在室温下储存长达6个月
0.1 M EDTA溶液
使用3.36克/ 100毫升的二钠盐形式
pH将降至5.3以下并且溶液将保持混浊直至其pH调节至7.0。用NaOH调节pH值至8.0 高压灭菌消毒
M-PER补充50mM二硫苏糖醇（DTT）
注意：＆NBSP;
1. 您处理的每个样品都需要至少20μl补充DTT的M-PER。＆nbsp;
2. 剩余1 M DTT原液可在-20°C下储存长达30天（最好制作50-100μl等分试样以防止任何冻/融循环）。
UA缓冲液（8M尿素，100mM Tris-HCl pH8.5）（10ml）
注意：每个样品需要大约500μl的UA缓冲液。
将4.8048克尿素（Thermo Scientific）加入6毫升质谱级水中并溶解（溶液变冷，因此可能需要在水浴中温和加热溶液以使尿素完全溶解）。加入1 ml 1 M Tris-HCl pH 8.5，加入10 mL质谱级水
IAA溶液（UA缓冲液中0.05M碘乙酰胺）（1 ml）
100mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）（3ml）
将300μl1M TEAB（Sigma）加入2.7 ml质谱级水中并涡旋振荡建议将溶液保存在冰上
胰蛋白酶消化液（在100 mM TEAB至10μg/ ml制备的胰蛋白酶/ Lys-C）
将2,000μl100mMTEAB加入单个20μg小瓶胰蛋白酶/ Lys-C（Promega）中，终浓度为10μg/ ml，轻轻移液混合直至完全溶解。不要VORTEX。建议将溶液保存在冰上
0.5 M NaCl（5 ml）
注意：这将是一个过剩的解决方案，但是对于这个体积来说，更容易控制NaCl。）
称出146.1 mg NaCl（Sigma）并将质谱级水加入5 ml
涡旋直至溶解
10％三氟乙酸
将1ml 100％三氟乙酸（Thermo Scientific）加入9ml质谱级水中并涡旋
缓冲液（3％乙腈/0.1%甲酸）
将1 ml 100％甲酸（Thermo Scientific）加入30 ml 100％乙腈中，然后加入质谱级别的水至1 L
B缓冲液（95％乙腈/0.1%甲酸）
将1ml 100％甲酸加入950ml 100％乙腈中，然后加入质谱级水至1L

致谢

RH和DF由Clayton Foundation for Research，Carson City NV和北卡罗来纳州立大学农业与自然科学学院提供支持。 TG和GR由美国陆军作战能力发展指挥部（CCDC）化学生物中心通过内部基础研究补助金支持。这里提出的意见是作者的意见，不是美国陆军，CCDC或美国政府的官方政策。本报告中的信息已公开发布，分发无限制。该协议改编自该出版物。 Schuchman R，Kilianski A，Piper A，Vancini R，Ribeiro JMC，Sprague TR，Nasar F，Boyd G，Hernandez R，Glaros T. 2018.来自哺乳动物和无脊椎动物宿主的辛德比斯病毒蛋白质组的比较表征将nsP2鉴定为病毒和排序Nexin 5作为甲病毒复制的重要宿主因子。 J Virol 92。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

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