材料和试剂

移液器吸头（Fisher Scientific，目录号：02707404）
无菌10毫升血清移液管（Santa Cruz Biotechnology Inc.，目录号：sc-200281）
无菌15毫升锥形管（BD Falcon，目录号：669993）
12孔细胞培养板（Fisher Scientific，目录号：64976）
盖玻片（Fisher Scientific，目录号：22050221）
铝箔（Fisher healthcare，目录号：01213101）
Kimwipe（不起毛的纸巾; Fisher healthcare，目录号：S47299）
人前列腺成纤维细胞和Ras V12 （Mishra et al。，2018）
注意：与普通对等体相比，这些细胞类型具有活跃的Ras活动。
胎牛血清（亚特兰大生物制品，目录号：S11550）＆nbsp;
DMEM / F12培养基（Fisher Scientific，目录号：SH300404）
四甲基罗丹明 - 共轭高分子量葡聚糖（TMR-葡聚糖，75kDa），赖氨酸可固定（Invitrogen Molecular Probes，目录号：D1818）
DQ-BSA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：D12050）
LysoTracker ®绿色DND-26（Life Technologies，目录号：L7526）
5-（N-乙基-N-异丙基）阿米洛利（EIPA）（Invitrogen Molecular Probes，目录号：e-3111）＆nbsp;
带DAPI的Vectashield Antifade安装介质（Vector Laboratories，目录号：H-1200）
甲醛溶液，ACS试剂级，37％（vol / vol）（Sigma，目录号：252549）＆nbsp;
NuSerum（Fisher Scientific，目录号：355500）
胰岛素，人重组，锌溶液（Invitrogen，目录号：12585-014）
氯化钠（NaCl）（Fisher Biosciences，目录号：BP358-1）
二甲基亚砜（DMSO）（Fisher Biosciences，目录号：D128-1）
磷酸二氢钠（NaH ₂ PO ₄）（Fisher Biosciences，目录号：ICN19550080）＆nbsp;
磷酸钠，二元，无水，Na ₂ HPO ₄（Fisher Biosciences，目录号：AC424375000）
10 -8 M睾酮（Nacalai Tesque，目录号：32811-61）
聚L-赖氨酸（Sigma，目录号：P4707）
EIPA（5-（N-乙基-N-异丙基）阿米洛利）（Sigma，目录号：A3085）＆nbsp;
无菌蒸馏水
基质完全培养基（见食谱）
PBS 1x，pH 7.4（参见食谱）
葡聚糖原液（见食谱）
EIPA库存解决方案（参见食谱）
LysoTracker绿色DND-26（见食谱）
DQ-Green BSA原液（见食谱）
葡聚糖细胞培养培养基（参见食谱）
固定缓冲液（见食谱）

设备

移液器援助
组织培养罩
用适配器离心15 ml锥形管
加湿的细胞培养箱设定为37℃和5％CO ₂
共聚焦激光扫描显微镜（德国莱卡）
细尖镊子
4°C冰箱
-20°C冰箱

程序

在盖玻片上生长成纤维细胞
1. 将无菌盖玻片放入12孔板中;用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗盖玻片，然后用培养基快速冲洗。将盖板上的细胞以约3,000 /孔的密度在500μl培养基中铺板。
2. 巨噬菌体的标记涉及血清饥饿条件下的细胞生长。因此，需要事先进行优化以找出获得50％-75％细胞融合的合适时间点。细胞的融合对于正确标记巨噬细胞并在盖玻片上扩散非常关键。
巨蛋白体标记
1. 将细胞在5％CO ₂培养箱中于37℃培养，并且所有后续处理在37℃下使用预热的培养基进行。
2. 将在12孔板中的盖玻片上生长的细胞血清饥饿18小时，然后与1mg / ml TMR-葡聚糖在CO ₂培养箱中的无血清DMEM / F12培养基中孵育30分钟。
  注意：葡聚糖有不同的颜色和分子量，可根据实验的要求和预期目标进行选择。
3. 尽可能去除培养基，用500μl冰冷的PBS洗涤细胞5次。用PBS中的150μl3.7％甲醛固定细胞。在室温下将细胞用铝箔覆盖，在黑暗中孵育20分钟。
  注意：正确冲洗样品对于避免荧光背景信号至关重要。
4. 使用镊子从12孔板上取下盖玻片。保持盖玻片垂直，底部边缘接触纸巾以吸收剩余的PBS并完全干燥盖玻片。
5. 对于核染色和安装，在每个载玻片上涂一滴DAPI封固剂。取下盖玻片，使其与滑块成一定角度，使其一边接触DAPI安装介质，然后小心地将其放在墨滴上，使盖玻片覆盖介质而不会在下方夹住气泡。使用纸巾的一角将任何多余的DAPI安装介质吸干盖玻片边缘。＆nbsp;
6. 将盖玻片放在DAPI安装介质上，使细胞朝下。确保，如果没有，细胞会变干，然后可以在室温下放置更长时间。然后用清晰的指甲油仔细密封。在室温下在黑暗中干燥密封2小时。

数据分析

我们的方案描述了前列腺成纤维细胞中巨噬细胞的可视化。这些巨噬细胞进一步融合到溶酶体中并被其酸性酶（溶菌酶）降解。为了排除标记巨噬细胞体的背景信号可能性，我们还通过用巨噬细胞增多抑制剂处理Ras过表达的小鼠成纤维细胞来包括阴性对照组。除了阴性对照之外，还建立了实验方法以观察溶酶体中的巨噬菌体融合及其通过溶菌酶的降解。为了追踪溶酶体，使用LysoTracker green和降解DQ TM -BSA。分析步骤总结如下：

我们遵循四个标准来识别巨噬细胞：
1. 右旋糖酐阳性。
2. 被排除在核心之外。
3. 被GFP阳性细胞质包围。
4. 巨噬菌体的荧光强度与细胞外空间的荧光强度相当或更高。＆nbsp;
我们使用共聚焦激光扫描显微镜（德国莱卡）对这些样品进行了最佳成像。＆nbsp;
使用60x1.4NA油浸镜头获取图像。使用不同的激光，其跨越蓝色（457,477和488纳米），绿色（514和543纳米）和红色（633和647纳米）光谱区域。在顺序模式下获得的各个通道中记录荧光，以避免使用高灵敏度的32通道砷化镓磷化物检测器进行串扰。针孔设置为1艾里单位。
作为该方案的体外实施的一个例子，我们评估了Ras过表达小鼠成纤维细胞中巨胞饮作用的程度。共焦图像的代表性示例如图1所示。

图1.监测巨噬细胞。代表性图像显示Ras V12 前列腺小鼠成纤维细胞（表达GFP）中的TMR-葡聚糖阳性巨噬细胞体（箭头）。比例尺=7.5μm。
如下所述分析验证控制：
1. 阴性对照：如方法A所述，在盖玻片上培养Ras V12 小鼠前列腺成纤维细胞。在加入无血清葡聚糖之前，用25μM的EIPA处理细胞30分钟。基质媒体。 EIPA是位于质膜中的Na + / H + 交换剂的临床抑制剂。如方法B中所述用TMR-葡聚糖标记细胞。固定细胞并通过共聚焦显微镜分析。共焦图像的代表性示例如图2所示。
  
  图2.通过EIPA减少巨胞饮作用。 Ras V12 前列腺小鼠成纤维细胞中的巨噬细胞体可视化用30分钟预处理5-（N-乙基-N-异丙基）阿米洛利（EIPA）。比例尺=24μm。
2. 监测巨噬细胞溶酶体融合：如程序A所述，在盖玻片上培养Ras V12 小鼠前列腺成纤维细胞。将细胞与Lyso跟踪绿色DND-26的混合物一起孵育（75 nM）和TMR-葡聚糖（各1mg / ml）在37℃下保持30分钟。 30分钟后，将细胞置于冰上，在冰冷的无染料培养基中洗涤3分钟三次，并在37℃下用3.7％甲醛在冰上固定20分钟。具有TMR-葡聚糖阳性染色的Lysotracker发出的荧光信号表明巨噬菌体的溶酶体降解。使用显微镜获得图像（图3）。
  
  图3.监测溶酶体中巨噬菌体的内化。通过LysoTracker（绿色）与TMR-葡聚糖的共定位监测巨噬菌体的酸化，表明巨噬菌体与溶酶体融合（参见合并图像中的橙色斑点）。图像显示代表性的显微图像。比例尺，30μm。
3. 通过巨噬细胞体和溶酶体定位测试白蛋白摄取：大粒细胞增多症从细胞外液中显着提高蛋白质如牛血清白蛋白（BSA）的摄取量（Commisso et al。，2013）。我们选择DQ TM -BSA来确认白蛋白摄取和溶酶体功能。 DQ TM -BSA是猝灭的荧光化合物，其需要在酸性细胞内区室（即，溶酶体）中进行酶促切割以获得强荧光。如方法A所述，在盖玻片上培养癌症相关的前列腺成纤维细胞。将细胞与TMR-葡聚糖和DQ TM -BSA（10μg/ ml，在无血清培养基中）在37℃温育1小时。确保巨噬细胞形成，并且试剂到达溶酶体区室。固定细胞并通过共聚焦显微镜分析。共焦图像的代表性示例如图4所示。
  
  图4.监测巨噬细胞体中细胞外白蛋白的内化。与荧光DQ-BSA（绿色）和TMR-葡聚糖（红色）共培养的CAF然后在1小时追踪后固定。具有TMR-葡聚糖阳性染色（箭头）的DQ-BSA发出的荧光信号表明巨噬菌体对白蛋白的摄取和随后的溶酶体分解。比例尺=7.5μm。

食谱

基质完全培养基
DMEM / F12媒体
5％FBS
5％NuSerum（HyClone）
0.1％胰岛素
PBS 1x，pH 7.4（1L）
NaCl 9克
NaH ₂ PO ₄ 0.23 g
Na ₂ HPO ₄ 1.15 g
无菌蒸馏水，最高1升
Dextran库存解决方案
将25毫克荧光标记的70-kDa葡聚糖溶于1.25毫升PBS中，得到最终浓度为20毫克/毫升的葡聚糖原液
在-20°C黑暗中以100μl等分试样储存储备溶液
注意：确保右旋糖酐溶液变得清澈透明。通过上下移液，葡聚糖需要10-15分钟才能完全溶解。
EIPA股票解决方案
在二甲基亚砜（DMSO）中制备EIPA储备溶液（10mM），并以25mM的工作浓度使用
LysoTracker绿色DND-26绿色
1. 将一小瓶1mM LysoTracker DND-26溶液（50μl，在DMSO中）（Invitrogen L7526）温热至室温
2. 在打开之前，简单地离心以将溶液沉积在小瓶的底部
3. 从1mM溶液中，使用分子级H ₂ O制备500nM储备溶液
4. 用铝箔覆盖，以尽量减少光线照射
5. 储存溶液低于-20°C
6. 在即将使用之前，通过将1.5μl的500nM储备溶液与8μl分子级H ₂ O组合，制备大约75nM LysoTracker Green的染色溶液。
DQ-Green BSA库存解决方案
1. 将1 mg DQ-BSA冻干粉末溶于500μlPBS中，制成2 mg / ml DQ-Green BSA原液
2. 通过涡旋和移液彻底混合
3. 重新配制后，用铝箔包裹以保护其免受光照，并在4°C下储存。
固定缓冲区
向PBS中加入37％（体积/体积）ACS试剂级甲醛溶液至终浓度为3.7％（体积/体积）
注意：使用新制备的解决方案。

致谢

这项工作得到了国家癌症研究所（CA108646至NAB）和退伍军人事务部（BX001040至NAB）的资助。感谢印度拉贾斯坦邦斋浦尔马尼帕尔大学的增强种子资助EF / 2018-19 / QE04-11（至R.M.）。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

伦理

根据机构动物护理和使用委员会批准，收获原代小鼠成纤维细胞并使用批准的程序生长。

参考

Bar-Sagi，D。和Feramisco，J.R。（1986）。通过ras蛋白诱导静息成纤维细胞膜起皱和液相胞饮作用。 Science 233（4768）：1061-1068。
Commisso，C.，Davidson，SM，Soydaner-Azeloglu，RG，Parker，SJ，Kamphorst，JJ，Hackett，S.，Grabocka，E.，Nofal，M.，Drebin，JA，Thompson，CB，Rabinowitz，JD， Metallo，CM，Vander Heiden，MG和Bar-Sagi，D。（2013）。蛋白质的细胞增多症是Ras转化细胞中的一种氨基酸供应途径。自然 497（7451）：633-637。
Davidson，SM，Jonas，O.，Keibler，MA，Hou，HW，Luengo，A.，Mayers，JR，Wyckoff，J.，Del Rosario，AM，Whitman，M.，Chin，CR，Condon，KJ，Lammers ，A.，Kellersberger，KA，Stall，BK，Stephanopoulos，G.，Bar-Sagi，D.，Han，J.，Rabinowitz，JD，Cima，MJ，Langer，R。和Vander Heiden，MG（2017）。胰腺肿瘤中癌细胞自主细胞外蛋白分解代谢的直接证据。 Nat Med 23（2）：235-241。
Lim，J。P.和Gleeson，P。A.（2011）。大粒细胞增多症：内吞大口的内吞途径。 Immunol Cell Biol 89（8）：836-843。
Mishra，R.，Haldar，S.，Placencio，V.，Madhav，A.，Rohena-Rivera，K.，Agarwal，P.，Duong，F.，Angara，B.，Tripathi，M.，Liu，Z 。，Gottlieb，RA，Wagner，S.，Posadas，EM和Bhowmick，NA（2018）。基质表观遗传改变驱动代谢和神经内分泌前列腺癌重编程。 J Clin Invest 128（10）：4472-4484。
Swanson，J。A.和Watts，C。（1995）。大粒细胞增多症。趋势细胞生物学 5（11）： 424-428。