材料和试剂

移液器吸头（Quality Scientific Plastics）
1.5毫升管（氧气，目录号：MCT-150-C）
0.22μm注射器过滤器（MILLEX，目录号：PR03683）
200μlPCR管（Axygen，目录号：14-222-261）
琼脂糖（Thermo Fisher，目录号：R0492）
1 kb DNA plus ladder（Transgen Biotech，目录号：BM211）
Streptavidin C1 beads（Thermo Fisher，目录号：65001）
AMPure XP珠子（Axygen）
蛋白酶K（西格玛，目录号：P8044）＆nbsp;
FastPfu（Transgen Biotech，目录号：AP221-02）
dNTPs（Transgen Biotech，目录号：AD101-11）＆nbsp;
AxyPrep MAG PCR Clean-Up（Axygen，目录号：MAG-PCR-CL）
NaCl（VWR Life Sciences，目录号：97061-266）
EDTA（Amresco，目录号：BDH9232）
Tris（VWR Life Sciences，目录号：97062-420）
PEG 8000（Sigma，目录号：89510-250G-F）
T4连接酶（Thermo Fisher，目录号：EL0011）
EasyTaq（Transgen Biotech，目录号：AP111-01）
凝胶提取试剂盒（Thermo Fisher，目录号：K0691）
75％乙醇（北京化工）
异丙基（北京化工）
EDTA-Na2·2H2O（Amresco，目录号：BDH9232）
NaOH（Sigma，目录号：221465）
HCl（Sigma，目录号：7647-01-0）
SDS（Sigma，目录号：72455）
TAE（见食谱）
蛋白酶K（见食谱）＆nbsp;
5 M NaCl（参见食谱）
0.5 M EDTA（pH 8.0）（见食谱）
1 M Tris-HCl（pH 7.4）（见食谱）
细胞裂解缓冲液（见食谱）
TE缓冲区（见食谱）
50％（wt / vol）PEG 8000（参见食谱）
2x B＆amp; W缓冲区（参见食谱）
退火缓冲液（见食谱）
50 mM桥接适配器（参见食谱）

设备

泡沫浮管架
8孔磁铁支架
移液器（GILSON）
Thermomixer C（Eppendorf）
PCR热循环仪（Applied Biosystems）
Covaris（M220聚焦超声波发生器）
离心机（Eppendorf，型号：5418R）
NanoDrop（DeNOVIX，DS11）
孵化器（赛默飞世尔）
高压灭菌器

程序

设计用于iHTGTS的引物
选择Cas9生成的目标位点DSB作为“诱饵”捕获其他全基因组“猎物”DSB。为了与2×150bp Hiseq测序相容，设计用于LAM-PCR的生物素化引物以结合Cas9结合位点上游150bp;设计巢式引物与生物素化引物的下游退火，离切割位点约90bp。（图1，表1）
注意：避免在DNA重复区域设计引物。
>

图1. iHTGTS的引物设计。红色箭头表示Cas9目标切割位点。蓝色箭头表示嵌套引物，紫色表示生物素化引物。切割地点的距离如下所示。

表1.引物和桥接适配子的序列。 Phor表示磷酸化。 MID表示数据解复用的索引库。 REDPRIMER表示嵌套引物，它在不同的基因座之间变化。
提取基因组DNA（gDNA）
1. 用Cas9质粒转染HEK293T细胞48小时后，在1.5 ml管中收集107个转染的HEK293T细胞（我们也尝试了K562，HCT116和U2OS，均可正常工作）并加入500μl细胞裂解缓冲液。将管在Thermomixer中在56°C，500 x g孵育10-18 h。
  注意：蛋白酶K溶液应在使用前加入裂解缓冲液中（最终浓度为10 ng / ml）。>
2. 加入500μl异丙基，充分混合，直至看到白色絮状DNA颗粒。
3. 用移液管将颗粒转移到另一个含有1ml 70％乙醇的1.5ml管中。在13,000 x g >离心5分钟。
4. 丢弃上清液。再次离心并耗尽残留的70％乙醇。加入500μlTE，将试管在56℃，500 x g >的Thermomixer中孵育至少2小时。
  注意：调整添加TE的体积，确保DNA浓度不低于200 ng /μl。>
5. 使用NanoDrop量化DNA。 A 260 / A 280 应高于1.8。
6. 推荐20μggDNA用于iHTGTS文库构建。
通过超声处理片段gDNA
1. 将20μggDNA加入PCR管中。使用以下参数设置Covaris：PIP = 50瓦，DF = 30％，CPB = 200，时间= 60秒。
2. 超声处理后，取200 ng DNA用于1％琼脂糖页面。 DNA涂片的范围应为0.2-2kb，峰值为0.75kb。（图2）
  
  图2.超声处理后的DNA涂片模式涂片范围从300 bp到2 kb，峰值在750 bp左右。
LAM-PCR
1. 如下所示，在4 x50μlPCR管中设置反应（每个PCR反应的DNA模板可以是1-10μg）：
2. 设置PCR程序：
  95°C 2分钟
  [95°C 30 s，58°C 30 s，72°C 1.5 min]（80次循环）
  72°C 2分钟
  永远10°C
3. 使用AMPure XP珠子消耗剩余的生物素底漆
  一个群组。在每个PCR管中加入50μlAmpureXP珠子，轻轻混匀，在室温下孵育5分钟。
  ＆NBSP; ＆NBSP;注意：此步骤旨在去除小于300 bp的片段;珠子的体积可以根据＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;不同的批次。 >
  
  注意：以下所有步骤（D3b-D3f）均在RT运行。>
  B＆群组。将管放在8孔磁铁架上5分钟。
  C＆群组。除去上清液，加入200μl70％乙醇。静置30秒后，取出上清液。
  d群组。重复步骤D3c。
  E＆群组。加入50μldH 2 O，用移液管完全混合珠子，在室温下孵育2分钟。
  F＆群组。将管放在磁铁上2分钟，将上清液（约200μl）汇集到一个新的1.5 ml管中。
链霉抗生物素蛋白珠结合
1. 从最后一步向PCR产物中加入50μl5M NaCl，2.5μl0.5M EDTA。加入30μl链霉抗生物素蛋白珠并在室温下旋转4小时。（链霉抗生物素蛋白珠应在使用前用1x B＆amp; W缓冲液洗涤两次）
2. 将珠子放在1.5毫升管磁铁架上，取出上清液。每次使用400μl1xB＆amp; W缓冲液洗涤珠子三次。＆nbsp;
3. 用400μldH 2 O洗涤珠子，然后将珠子重新悬浮在80μldH 2 O中。
嵌套PCR
1. 在2x PCR管中设置PCR反应如下：
2. 设置PCR程序：
  95°C，5分钟
  [95°C 1分钟，58°C 30秒，72°C 1分钟]（15个循环）
  72°C 10分钟
  永远10°C
3. 如步骤D3所述，使用AMpure XP珠子回收PCR产物。每个PCR管用35μldH 2 O洗脱PCR产物。将PCR产物收集在一起并测量浓度。
  注意：此步骤旨在去除小于500 bp的DNA片段，根据不同批次升高珠子的体积。>
酶阻断（可选）
1. 加入8μl10x酶缓冲液，10U封闭酶，在37℃下孵育1小时或更长时间。
2. 用GeneJET柱纯化DNA，用70μldH 2 O洗脱，检查浓度。
标记PCR
1. 在2个PCR管中设置PCR反应如下：
2. 设置PCR程序：2。设置PCR程序：
  95°C 3分钟
  [95°C 20 s，60°C 30 s，72°C 1 min]（10-15次循环）
  72°C，5分钟
  永远10°C
  注意：PCR循环数取决于最后一步的DNA浓度。>
纯化的PCR产物
将DNA汇集在一起，在TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上运行所有DNA，切割500-900bp之间的产物（图3），通过凝胶提取柱纯化，用30μldH 2洗脱哦两次。现在PCR产物已准备好进行Hiseq测序。

图3. iHTGTS文库的DNA涂片模式。将DNA切割范围为500 bp至1 kb。

数据分析

用于数据分析的详细操作和机制与LAM-HTGTS相同，其可以在Hu 等人的步骤48至步骤51中找到>（2016）。

食谱

注意：本协议中使用的试剂与Hu等人的试剂几乎相同。（2016）。以下配方改编自它。>

TAE
40 mM Tris-HCl
20 mM乙酸
1 mM EDTA
蛋白酶K
将0.1g蛋白酶K粉末溶于5ml H 2 O中，制成20mg / ml原液将溶液分成0.5ml等分试样并在-20℃下储存长达3个月
5 M NaCl
将292.5克NaCl溶解在H 2 O中，并将总体积调节至1L
高压灭菌溶液并将其储存在室温（室温; 20-25°C）下长达1年
0.5 M EDTA（pH 8.0）
在H 2 O中溶解186.12g EDTA-Na 2 ·2H 2 O，用2.5N NaOH调节pH至8.0，然后调节总容量为1升
高压灭菌解决方案并将其在室温下存放长达1年
1M Tris-HCl（pH 7.4）
将121.14克Tris碱溶于H 2 O中，用HCl调节pH至7.4，然后使总体积达到1L
高压灭菌解决方案并将其在室温下存放长达1年
细胞裂解缓冲液
200 mM NaCl
10 mM Tris-HCl（pH 7.4）
2 mM EDTA（pH 8.0）
0.2％（wt / vol）SDS
在室温下储存长达6个月
TE缓冲区
10 mM Tris-HCl（pH 7.4）
0.5 mM EDTA（pH 8.0）
在室温下储存长达6个月
50％（wt / vol）PEG 8000
在56°C下将5 g PEG 8000溶解在H 2 O中，然后将总体积调节至10 ml
通过0.22μm注射器过滤器过滤溶液，准备1 ml等分试样并将其在-20°C下储存长达1年
2x B＆amp; W缓冲区
2 M NaCl
10 mM Tris-HCl（pH 7.4）
1 mM EDTA（pH 8.0）
用H 2 O稀释，制成1x B＆amp; W缓冲液。在室温下储存长达1年
退火缓冲区
25 mM NaCl
10 mM Tris-HCl（pH 7.4）
0.5 mM EDTA（pH 8.0）
在室温下储存长达1年
50 mM桥接适配器
1. 将两种DNA寡核苷酸（表1）溶解在退火缓冲液中至终浓度为400μM
2. 在一个新的1.5毫升微量管中混合等体积的两种溶解的寡核苷酸，将管放入1升沸水中，用泡沫浮管架，煮沸5分钟，然后在水中缓慢冷却至约30°C工作台（适配器浓度为200μM）。或者，寡核苷酸可以在PCR热块上退火
3. 用H 2 O稀释4倍（浓度为50μM），制备100μl等分试样并在-20°C下储存长达2个月
4. 使用前将适配器解冻在冰上

致谢

感谢J. H.和PKU-TSU生命科学中心的千人计划青年计划。
该协议改编自Hu 等人>（2016）。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突或竞争利益。

参考

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