材料和试剂

移液器吸头
无菌1.5毫升微量离心管
无菌15毫升锥形管
6孔细胞培养板（Fisher Scientific，目录号：08-772-49）
平底96孔板（Fisher Scientific，目录号：07-200-90）＆nbsp;
10厘米组织培养皿（Fisher Scientific，目录号：08-772E）
尼龙网格方形切割2厘米x 2厘米（Elko Filtering Co.，目录号：03-80 / 37）
金属网格，切割2厘米x 2厘米，消毒（木炭铝屏补丁，Phifer合并，3025123）
FACS管（Corning，目录号：352235）
原代培养的小鼠野生型前列腺成纤维细胞（如先前由Kato 等人>，2018; Mishra et al。>，2018所述）产生。
人CWR22Rv1上皮细胞（ATCC，目录号：CRL-2505）
10x DMEM培养基（Fisher Scientific，目录号：SH3000203）
胰蛋白酶（Fisher Scientific，目录号：MT25053CI）
RPMI培养基（Fisher Scientific，目录号：SH3001103）
DME / F12介质（Fisher Scientific，目录号：SH300404）
胎牛血清（亚特兰大生物制品，目录号：S11550）
NuSerum（Fisher Scientific，目录号：355500）
胶原酶I型（Invitrogen，目录号：17100-017）
Dispase（Invitrogen，目录编号：17105-041）
BSA（MP Biomedicals，目录号：810034）
戊二醛，25％溶液（Sigma，目录号：G6257）
庆大霉素（Life Technologies，目录号：15710-064）
胰岛素（人类重组锌，Gibco Life Technologies，目录号：12585-014）
睾酮（来自Sigma-Aldrich的丙酸睾酮C-IIIN，目录号：T1875-5g）
抗人类CD105-APC抗体（eBiosciences，目录编号：17-1057-41）
抗人EpCAM-PE抗体（eBiosciences，目录编号：12-9326-41）
大鼠尾胶原蛋白I（如前所述[Kato et al。>，2018; Mishra et al。>，2018]生成，在4°C下保存6个月）
Matrigel（BD Biosciences，目录号：354234）
EBSS，10x（Sigma-Aldrich，目录号：E7510）
的NaHCO <子> 3
氢氧化钠
无菌蒸馏水
氯化钠
将NaH <子> 2 PO <子> 4
娜<子> 2 HPO <子> 4
RPMI完全上皮培养基（用于CWR22Rv1）（见食谱）
DME / F12基质完全培养基（用于小鼠WT成纤维细胞）（见食谱）
设置解决方案（参见食谱）
1x PBS（参见食谱）
消化液（见食谱）

设备

无菌镊子（精细科学工具，目录号：11254-20）
无菌剪刀（精细科学工具，目录号：14060-09）
无菌10毫升血清移液管
用于组织培养工作的生物安全柜
移液器援助
使用15 ml锥形管适配器离心，在室温下使用
加湿的细胞培养箱设定为37℃和5％CO 2
加湿的细胞培养箱设定为37°C，5％CO 2 和2％O 2
BD LSRII用于流式细胞仪＆nbsp;
Eppendorf管离心机

软件

FlowJo软件v10.3用于FACS分析

程序

第1天>
注意：第一步可能会在前一天执行，保持无效> 。>

胶原蛋白涂层尼龙的制备（用于第2天第1步，每根尼龙需要100-200μl）
1毫升（保持在冰上）：
胶原蛋白，I型70％（700μl）（浓度范围在1 mg / ml至10 mg / ml之间）
10x DMEM 10％（100μl）
1x DME / F12基质完全培养基5％（50μl）
1x完整的上皮RPMI培养基（50μl）
FBS 5％（50μl）
NuSerum 5％（50μl）
设定溶液（通常25％-35％的胶原蛋白量为粉红色，类似于中等）
使用干燥程序，高压灭菌尼龙网格正方形~2 cm x 2 cm。在任何可通过镊子进入的可高压灭菌的容器中高压灭菌所有方块，一次移除一个尼龙。
将高压灭菌的尼龙网状物正方形放置在10cm的无菌组织培养板上。
1. 使用无菌移液管将尼龙方块涂上胶原蛋白基质（每个100-200μl），参见图1，顶行。
2. 在37°C孵育30分钟，5％CO 2 。＆nbsp;
3. 加入1％戊二醛（在无菌H 2 O中稀释）以浸没尼龙方块（对于一个10cm板使用约10ml总体积），在4℃下孵育1小时。
4. 固定后，用无菌1x PBS洗涤4次，并用1x DME / F12洗涤1次，并加入1x DME / F12直至使用，储存于4℃。＆nbsp;
胰蛋白酶消化细胞*
根据所需的凝胶塞的总数，推荐每种细胞类型至少一个10cm的板，并且每种细胞类型都会有所不同。建议亚汇合，因为活跃的增殖细胞是最好的。将细胞用胰蛋白酶消化并重悬于1x完全RPMI或DME / F12培养基中。
注意：最好使用活跃增殖且不融合的细胞。>
统计细胞
在1x PBS中洗涤细胞沉淀两次，保持在冰上。每个凝胶塞具有6×10 5个基质成纤维细胞+ 2×10 5个上皮细胞。制作上皮与成纤维细胞的单一主混合物，并在添加基质之前沉淀。准备1个额外凝胶的细胞，因为移液塞会损失一些体积。
矩阵的准备
注意：保持在冰上，*在胰蛋白酶消化或洗涤步骤的等待期间，此步骤可与细胞胰蛋白酶消化步骤（*步骤4）同时开始。>
1毫升：
胶原蛋白50％（500μl）（浓度范围在1 mg / ml至10 mg / ml之间）
基质胶20％（200μl）
10x DMEM 10％（100μl）
1x DME / F12基质完全培养基5％（50μl）
1x完全上皮RPMI培养基5％（50μl）
FBS 5％（50μl）
NuSerum 5％（50μl）
在所有其他成分之后添加凝固溶液，并且将使基质的总体积增加超过1ml（添加25％-35％的胶原蛋白量（125μl至175μl，取决于胶原蛋白起始浓度，更浓缩的胶原蛋白可能需要）更多设置解决方案）使粉红色的颜色）。这将使基质达到适当的pH值，以保持细胞活力和固化。>
将基质添加到吸入的细胞沉淀中，充分混合并避免产生气泡。＆nbsp;
凝胶塞中的种子细胞：在平底96孔培养皿中移取150μl细胞 - 基质混合物（建议在板的外边缘进行板材混合，在37°C下孵育30分钟（不超过60分钟以避免干燥）。建议每种处理条件下镀3个凝胶塞。
当凝胶塞在30分钟后固化后，每孔加入100μl培养基（如配方中所述的配方+ DME / F12完全培养基中所述的RPMI完全培养基，每种培养基的等体积）。将平板放回37°C孵育过夜。

第2天>

3D系统的组装。在6孔板中组装3D系统。在每个孔中，使用无菌镊子，将1个高压灭菌的金属网格切成略大于2厘米×2厘米（并弯曲成像桌子一样，见图1，第二排），小心地直立在井中，网格可能会滑动，所以尝试定位在井的中心。然后将胶原蛋白涂在尼龙上面。
使用200μl移液管，通过在每个孔的侧面移取200μl培养基，用细胞混合物（见图1，底行）制备前一天制备的细胞 - 基质凝胶塞。当它们从孔中滑出时，在含有培养基的无菌10cm培养皿中捕获凝胶。＆nbsp;
将凝胶塞放在网格上。用无菌镊子将3个凝胶转移到每个涂有胶原蛋白的尼龙上，并在周围添加2-3毫升培养基，只需触摸尼龙底部即可吸收芯吸每个凝胶塞。不要将凝胶完全浸入介质中，它们的顶面必须暴露在空气中。可以将处理添加到媒体中，并根据需要随时更改。＆nbsp;
如果中等水平低于尼龙并且在低氧条件下培养10天（2％O 2 ），则每隔一天补充培养基或根据需要补充培养基。
注意：>
1. 保持凝胶塞的限制已经持续了10天。活性细胞开始消化基质，并且凝胶塞形式被缓慢溶解掉，可能是细胞消化和降解基质组分。因此，3D结构减少了10天，我们觉得这与早期时间点的3D结构无法比较。我们通常使用24到72小时之间的时间点，有时最多使用5天。>
2. 对于涉及CD105的实验，需要缺氧，因为它更好地模拟体内的体内条件。其他读数可能不需要缺氧。＆nbsp; >

E > nd of Experiment >

细胞收获：实验结束后，准备新鲜的消化液。
用500μl消化溶液将凝胶置于Eppendorf管中。用剪刀将凝胶切成小块，在37℃下孵育15分钟。在孵化期间用手摇一次管（或保持旋转装置以连续温和混合;不建议涡旋）。如果凝胶在15分钟后未溶解，则再孵育5分钟。＆nbsp;
旋转至沉淀细胞，在300 x g >下2分钟。
FACS分析：使用任何标准FACS方案（如下面提供的方法）染色细胞，将细胞保存在冰上。

图1. 3D共培养系统组装。使用无菌条件，将尼龙网涂覆在胶原基质中，使其固化，用戊二醛交联，并如所述洗涤。弯曲金属网格以形成适合6孔板的桌子。胶原涂覆的尼龙以每个金属网格台为中心。从96孔板中取出凝胶塞，并将其保持在培养基中以防止干燥。然后将凝胶塞转移到涂有胶原蛋白的尼龙的顶部，如图所示。然后将培养基添加到每个孔中以接触胶原涂覆的尼龙，而不完全浸没凝胶塞。

FACS细胞外染色>

用500μlPBS+ 1％BSA洗涤细胞，重复一次。
最后一次洗涤后，吸出溶液，在管中留下100μl颗粒状细胞。
添加细胞外染色抗体（1μl抗体用于1×10 6 细胞在100μlPBS+ 1％BSA中），旋转以混合细胞并在黑暗中在冰上孵育20-30分钟。
在300 x g >下旋转2-5分钟并用200μlPBS+ 1％BSA洗涤，重复。
用~400μlPBS+ 1％BSA将细胞转移到FACS管中，保持在冰上。
在BD LSR II上运行单元。

数据分析

将文件导入FlowJo软件。
门细胞包括用于分析的活细胞。排除左下角的单元格。
EpCAM + （上皮细胞）与EpCAM - 的门细胞。＆nbsp;
对EpCAM + 细胞进行门控以获得CD105 + 。 EpCAM + / CD105 + 细胞是具有CD105表达的上皮细胞群。
注意：使用其他FACS抗体可用于分析其他目标靶蛋白的表达。>
这些细胞的百分比可用于统计分析。建议至少重复三次以计算标准偏差。例子可以在Kato et al。>，2018中找到。

笔记

使用胶原蛋白或基质胶时，尽可能保持在冰上以防止凝固。
最好使用活跃增殖但不融合的细胞。
保持所有试剂和材料无菌。
该3D方案已被用于获得消化的细胞用于RNA分析，使用物种特异性引物来区分所需基因的上皮细胞和基质细胞表达。
保持凝胶塞的限制已经持续了10天。活性细胞开始消化基质，并且凝胶塞形式被缓慢溶解掉，可能是细胞消化和降解基质组分。因此，3D结构减少了10天，我们觉得这与早期时间点的3D结构无法比较。我们通常使用24到72小时之间的时间点，有时最多使用5天。
预计细胞每48小时加倍或如特定细胞类型所示。
DME / F12基质用于我们的原代成纤维细胞，因为这是它们通常生长的，但是其他基质细胞类型可以用它们优选的基质培养基替代。
对于使用EpCAM + 细胞的实验性读数，如果认为上皮细胞经历上皮至间充质转变，则EpCAM + 染色可能无法完全捕获上皮细胞群和替代标记物。是必要的（例如使用稳定转导的荧光细胞）。

食谱

RPMI完全上皮培养基（用于CWR22Rv1）
RPMI媒体
10％FBS
0.1％庆大霉素抗生素＆nbsp;
DME / F12基质完全培养基（用于小鼠WT成纤维细胞）
DME / F12媒体
5％FBS
5％NuSerum
0.1％胰岛素
0.1％庆大霉素抗生素
每次补充时，将新鲜的睾酮添加到培养基中（10 -8 M）＆nbsp;
设置解决方案
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：200px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>10倍EBSS
100毫升
NaHCO 3
2.45克
1 M NaOH
7.5毫升
无菌蒸馏水
42.5毫升混合在一起直至溶解，用0.20μm注射器过滤器过滤灭菌，等分并储存在-20℃
1x PBS，pH 7.4（1 L）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：200px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>NaCl
9克
NaH 2 PO 4
0.23克
Na 2 HPO 4
1.15克
无菌蒸馏水，最高1升
500μl消解液（每个凝胶塞）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：200px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>胶原酶（20 mg / ml）
125μl
Dispase（10 mg / ml）
167μl
RPMI完成媒体
208μl

致谢

这项工作得到了国家癌症研究所（CA108646至NAB和CA098912至VRP）和退伍军人事务部（BX001040至NAB）的资助。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

伦理

根据机构动物护理和使用委员会批准，收获原代小鼠成纤维细胞并使用批准的程序生长。

参考

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