材料和试剂

双刃剃须刀片（Ted Pella，目录号：121-6）
巴斯德吸管
Halotane（Sigma-Aldrich，目录号：B4388）
CX3CR1-GFP小鼠（The Jackson Laboratory，目录号：005582）
注意：本方案中显示的数据来自年轻的杂合子Cx3cr1 + / GFP 雄性小鼠（6周龄）。
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：71376）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
氯化钙脱水（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：C3881）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S9638）
HEPES（西格玛奥德里奇，目录号：H4034）
葡萄糖（西格玛奥德里奇，目录号：G5767）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S6014）
超级胶水（Loctite，目录号：234796）
库存ACSF解决方案10倍（见食谱）
ACSF 1x（见食谱）

设备

25毫升耐热玻璃烧杯
250毫升耐热玻璃烧杯
一套解剖工具（剪刀，镊子，刮刀，刀片）
95％O 2 ，5％CO 2 罐＆nbsp;
化学罩
Vibratome（Dosaka微型推土机，型号：DKT-1000）
定制的切片回收室
压缩空气罐
防振台
立式光学显微镜（Carl Zeiss，型号：Axioscope）
3.2x（或4x或10x）目标（Carl Zeiss，型号：Achroplan）
40x水浸物镜（Carl Zeiss，型号：Achroplan）
过滤器D480 / D510（Chroma Technology corp，型号：31001）
数字12位CCD相机系统（Sensi Cam，PCO AG）
计算机与延时成像系统
使用柔性塑料管定制灌注/抽吸系统（重力或泵操作）
4°C冰箱
单色器

软件

图像采集软件（例如，Tillvision，Metamorph，Metavue，等）
斐济（ https://imagej.net/Fiji/Downloads ）或ImageJ（版本1.49v或更高版本））（ https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）
Microsoft Excel或Origin 8.1软件

程序

小鼠急性海马脑片的制备
1. 在实验当天，早上准备好ACSF（1升）。将两个烧杯放在冰上，然后在每个烧杯中分别倒入~150ml和~20ml的ACSF。含氧化合物（95％O 2 ，5％CO 2 ）用于切片过程的所有持续时间的溶液。
2. 在室温下用~100ml ACSF填充回收切片室并充氧。
3. 在化学罩下，麻醉鼠标。通过捏爪来检查没有反射。用大剪刀快速剔除鼠标。暴露头骨，并使用小剪刀，沿着从小脑到嗅球的中线打开头骨。这个过程应该很快，在切割时应该小心，以免损伤大脑。
4. 用刮刀取出脑并将其放入小烧杯中，使其在0°C冰冷氧化（95％O 2 ，5％CO 2）中恢复10分钟）ACSF。＆nbsp;
5. 通过将冰和水放置在切片室周围来准备振动切片机。将剃刀刀片切成两半，将一半放在振动切片机的刀架上（图1）。
  
  图1.将刀片安装到刀架中。 A.使用螺钉，横向打开刀架。 B.小心地将半刀片放入打开的支架中并将其挡住。
6. 用刀片取出小脑并分开半球。
7. 快速地，将一滴超级胶水放在切片室的平板上，并将腹侧部分朝上放置半球。将冰冷的ACFS倒入切片室并充氧。
8. 振动切片机允许设置刀片振动频率，从0（对应于0 Hz）到10（对应于55 Hz），以及切割速度，从0（对应于0 mm / min的最慢速度）到10（最高速度相当于68毫米/分钟）。开始切片将切割速度设置为3，将振动频率设置为10，以获得250μm水平海马切片。使用巴斯德吸管将其转移到回收室中（先前切割过尖端;图2）。
  
  图2.改良的巴斯德吸管。 A.使用大剪刀，横向切割，去除塑料巴斯德吸管的尖端。 B.尖端移除后的塑料巴斯德吸管。
9. 在开始实验之前，让切片在室温下在含氧ACSF中恢复至少2小时（图3）。
  注意：切片可以在室温（~25°C）和温度较高的温度（30-37°C）下恢复。
  
  图3.获得急性脑切片的主要步骤。 A.斩首后，将颅骨暴露并从尾部切向大脑的头侧。 B.用刮刀去除大脑。 C.将大脑置于冰冷的ACSF中并充氧。 D.用冰和水准备切片室周围的振动切片机。 E.将腹侧部分朝上的半球固定在切片室的平板上，倒入冰冷的ACSF并开始切片。 F.允许切片在室温下在含氧ACSF中恢复。＆nbsp;
＆NBSP;
影像采集
1. 将切片放在显微镜下的记录室中。检查含氧ACSF溶液是否通过灌注/抽吸系统持续更换。将ACSF灌注设定为1.5-2 ml / min。
2. 使用3.2倍放大倍数（或放大4倍或10倍）通过明视野观察识别海马区域。
3. 将放大倍数改变为40倍并通过明视野观察识别辐射层（齿状回和CA1区域之间）。
4. 选择488 nm激发GFP的滤光片并观察小胶质细胞。激发光源可以是配备氙灯的单色器或通过激光发射盒发射的LED。
  注意：成像实验应在黑暗环境中进行。
5. 选择具有良好信号背景比的荧光场并避免表面场（估计表面深度为30-40μm）。
6. 通过每10秒获取荧光图像25分钟监视小胶质细胞处理运动，将光照时间曝光设置为50-100毫秒，相机合并为2（视频1）。
  
  视频1.小胶质细胞过程运动的延时成像。该视频是静息时小胶质细胞过程运动的25分钟延时。
7. 在采集结束时，将文件保存为图像序列（.avi或.tif格式）。

数据分析

从 https://imagej.nih.gov/ij/download.html下载并安装ImageJ >。 MTrackJ是ImageJ或Fiji插件。
在ImageJ中上传图像或图像堆栈（.tif或.avi）。如果图像是单个图像，则通过使用命令文件＆gt;导入图像文件夹来创建堆栈或电影。导入＆gt;图像序列。
根据灰度值和总体强度，您可能需要找到最佳设置，因此使用工具 Image＆gt;调整电影的亮度和对比度。调整＆gt;亮度和对比度＆gt;自动＆gt;应用的。
通过在 Image＆gt;中设置像素校准和帧时间间隔，根据您的目标校准堆栈。属性对话框。
运行MTrackJ插件并根据软件指南（Meijering et al。，2012）开始跟踪移动的小胶质细胞过程。 MTrackJ的在线手册非常详细，包含了创建和修改曲目的所有信息。简而言之，要创建轨道，请使用命令添加，然后在移动过程的位置按鼠标按钮开始关注您的过程。程序将自动移动到下一帧。完成处理移动小胶质细胞过程的轨迹后，双击鼠标或按 Esc 键将其终止。检查曲目是否实际跟随过程。
使用保存将处理过的曲目另存为.mdf文件。
完成跟踪堆栈中的所有小胶质细胞过程后，使用命令测量。该软件生成2个带定量输出的文件：一个文件包含每个轨道的所有单个点的数据，另一个文件包含每个轨道的平均值（视频2）。

视频2.跟踪小胶质细胞过程。在视频中，我们报告了使用MTrackJ插件跟踪小胶质细胞过程运动分析的示例。
将轨迹的定量数据（即，每帧的过程位置）保存为逗号分隔值（CSV）或电子表格软件的任何格式。
将每个轨道和条件的单个轨迹分开以进行分析。
通常，Y坐标值被反转，通过将每个Y分量乘以（-1）来转换Y坐标。
为了绘制从中心开始的每个轨迹的运动（x = 0，y = 0），在绘图之前从每个轨迹中减去初始位置（参见图4A和4B）。
汇集MtrackJ点输出的长度，瞬时轨迹速度曲线和瞬时位移。
对于每个给定条件，将参数转换并绘制成经验分布函数（图4C-4E）。

图4. Cx3cr1 + / GFP 小鼠小胶质细胞运动的分析。 A.示意图显示移动过程的长度和位移。 B.轨迹图的代表性图像，从中心开始绘制。 C-即表示B中所示各个轨道的速度（C），长度（D）和位移（E）分布的图（改编自Basilico et al。，2019）。

笔记

重要注意事项

为了使脑切片中的小胶质细胞可视化，必须使用其中小胶质细胞发荧光的转基因小鼠系。在我们的案例中，我们使用了小鼠，其中 Cx3cr1 基因（由神经系统中的小胶质细胞特异性表达）已被绿色荧光蛋白（GFP）构建体取代。
在图像采集期间可能发生图像漂移。如果视频在采集期间略微漂移，则可以通过使用ImageJ的StackRegplug-in对齐连续帧来校正和/或消除此移动。为此：
1. 安装以下插件：
  StackReg： http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ （由Philippe撰写） Thévenaz）
  TurboReg： http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ （由Philippe撰写） Thévenaz）
2. 在FIJI中打开视频并执行以下步骤：插件＆gt; StackReg＆gt;转换＆gt; <刚体>好的。

食谱

库存ACSF溶液10x（500 ml，储存在4°C）
NaCl 1,250 mM
KCl 25 mM
CaCl 2 20 mM
MgCl 2 10 mM
NaH 2 PO 4 12.5mM
ACSF 1x（1升;用于切片，回收和实验）
股票ACSF
葡萄糖11 mM
NaHCO 3
验证渗透压为295-305 mOsm

致谢

该方案改编自Basilico 等人（2019）。导致该协议的工作得到了AIRC（MFAG 2015，ID.16803项目，B.C。），CrestOptics-IIT JointLab for Advanced Microscopy（S.D.A.），MARBEL Life 2020赠款（S.D.A.）的支持。 SynaNet H2020计划（致S.D.A.和D.R.）。
＆NBSP;作者希望感谢Inituto Italiano di Tecnologia生命纳米科学成像设施中心的PhD V. de Turris博士对显微镜和图像分析的支持和技术建议。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

伦理

使用实验室动物的程序符合意大利和欧洲指南，并由意大利卫生部根据2010年9月20日欧洲共同体理事会指令（2010/63 / UE）中动物伦理用途指南批准）。所有努力都是为了尽量减少痛苦和使用的动物数量。

参考

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