材料和试剂

Seal-Rite 1.5 ml微量离心管（USA Scientific，目录号：1615-5599）
杂交管（Fisher Scientific，目录号：13-247-300）
Hybond N + 30 cm x 3 M Roll（GE，目录号：RPN303B）
50毫升离心管（Genesee，目录号：21-106）
15毫升离心管（Genesee，目录号：21-101）
1,250μl移液器吸头（USA Scientific，目录号：1112-1720）
0.1-10 /20μl移液器吸头（USA Scientific，目录号：1110-3700）
200μl移液器吸头（USA Scientific，目录号：1110-1700）
Whatman Grade 3 MM Chr吸墨纸，46 x 57 cm（GE，目录号：3030-917）
6孔细胞培养板（Genesee Scientific，目录号：25-105）
纸巾（Highmark，目录号4497A1）
玻璃托盘（耐热玻璃，目录号：1124847）
铝箔卷（Fisher，目录号：01-213-102）
板材保护装置（Office Depot，目录号：491694）
HCT116亲本细胞系（韩国典型培养物保藏中心，目录号：BP1230983）
HCT116 Drosha KO＃40细胞系（韩国典型培养物保藏中心，目录号：BP1230984）
let-7a irNorthern探针（5'-AACTATACAACCTACTACCTCA / iAzideN / A-3'）
注意：
1. 探针以100 nmole规模从Integrated DNA Technology订购，含有一个内部叠氮化物，并通过HPLC纯化。
2. DNA探针设计为与靶RNA互补。对于miRNA靶标，探针是成熟miRNA的全长（~22nt）反向互补序列。根据需要，在3'末端附近添加内部叠氮化物和末端核苷酸用于合成。
U6 irNorthern探测器（5'-GCAGGGGCCATGCTAATCTTCTCTGTATCG / iAzideN / T-3'）
注意：常用靶RNA的探针序列可在文献中找到。在设计新的DNA探针时，我们建议使用~30 nt序列靶向RNA的单链区域。
末端转移酶（NEB，目录号：M0315）
5-叠氮甲基-dUTP（Jena Biosciences，目录号：CLK-084S）
5-Azido-C 3 -UTP（Jena Biosciences，目录号：NU-157S）
Agencourt AMPure XP珠子（Beckman Coulter，目录号：A63881）
异丙醇（J.T.Baker，目录号：908401）
乙醇（Decon Laboratories，目录号：2716）
IRDye 680RD DBCO红外染料，0.5 mg（Li-Cor，目录号：929-50005） - 光敏感
IRDye 800CW DBCO红外染料，5毫克（Li-Cor，目录号：929-55000） - 光敏感
尿素（西格玛，目录号：U5378）
＆nbsp; Acryl / Bis 19：1（VWR，目录号：97064-990）
过硫酸铵（APS）（AmericanBio，目录号：AB00112）
TEMED（N，N，N'，N'-四甲基乙二胺）（AmericanBio，目录号：AB02020）
氯化钠（AmericanBio，目录号：AB01915）
无水磷酸氢二钠（Fisher Scientific，目录号：BP332-500）
氯化钾（Sigma，目录号：P9541）
醋酸钠（Sigma，目录号：S7545）
Trizma base（Sigma，目录号：T1503）
HEPES（Sigma，目录号：H4034）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma，目录号：EDS）
十二烷基硫酸钠（SDS）（AmericanBio，目录号：AB01920）
Formamide DI（AmericanBio，目录号：AB00600-00500）
溴酚蓝（Sigma，目录号：114391）
二甲苯Cyanol FF（Sigma，目录号：X4126）
柠檬酸钠二水合物（Sigma，目录号：W302600）
苯酚/氯仿/异戊醇（Fisher Scientific，目录号：BP1752I-400）
氯仿（AmericanBio，目录号：AB00350-01000）
ExpressHyb杂交解决方案（Clontech，目录号：636832）
TRIzol（Ambion，目录号：15596018）
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain（Invitrogen，目录号：S7563）
A，C，U，G核糖核苷酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0481）
亚精胺三盐酸盐（Sigma，目录号：85578）
RNase Inhibitor，Murine（NEB，目录号：M0314L）
二硫苏糖醇（DTT）（AmericanBio，目录号：AB00490-00025）
氯化镁六水合物（Sigma，目录号：M2670）
HYCLN McCoys 5A Media（Fisher Scientific，目录号：SH30200）
胎牛血清（PAA Laboratories，目录号：A15-201）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15070063）
RQ1 RNase-Free DNase（Promega，目录号：M6101）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
RNA洗脱缓冲液（见食谱）
8 M尿素15％聚丙烯酰胺凝胶（见食谱）
8 M尿素6％聚丙烯酰胺凝胶（见食谱）
2x甲酰胺装载染料（见食谱）

设备

16管SureBeads磁力架（Bio-Rad，目录号：1614916）
Vortex Genie 2（Fisher Scientific，目录号：12-812）
微量移液器（Eppendorf，Research Plus Models）
Roto-Bot旋转混合器（Benchmark Scientific，目录号：R4045）
Water-Jacketed CO 2 培养箱（Forma Scientific，目录号：3110）
ThermoMixer C （Eppendorf，目录号：5382000015）
NanoDrop OneC（赛默飞世尔科技，目录号：ND-ONEC-W）
Odyssey CLX成像系统（Li-Cor）
PowerPac HV高压电源（Bio-Rad，目录号：1645056）
PowerPac HC大电流电源（Bio-Rad，目录号：1645052）
猫头鹰HEP系列半干式电印迹系统（赛默飞世尔科技，目录号：HEP-1）
ImageQuant 300成像仪（GE Healthcare，目录号：63-0056-52）
UV Transilluminator（Fotodyne，目录号：3-3000）
UV交联剂，254 nm（Spectroline，目录号：XL1000）
Innova 2000平台振动筛（New Brunswick，目录号：M1190-0000）
杂交烤箱（VWR，型号：2720）
Mini-PROTEAN Tetra立式电泳系统（Bio-Rad，目录号：1658005）
注意：尽管该系统设计用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），但我们常规使用它来制备和运行尿素-PAGE进行RNA分离。
带冷藏的台式离心机（Eppendorf，目录号：5404000138）
-20°C冰箱（GE，型号：FUM21DHRWW）
-80°C冰箱（新不伦瑞克省，型号：C760）

软件

Image Studio（LiCor;免费版本可根据licor.com的要求提供）

程序

制备IR标记的探针
1. 用双蒸馏的H 2 O（ddH 2 O）溶解含叠氮基的DNA寡核苷酸。最终DNA浓度为100μM。
2. 将2.5 nmole寡核苷酸与50 nmole IRDye 680RD或800CW DBCO在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中混合，总体积为50μl。
  注意：从这一点开始，探头应远离光线。
3. 在室温下孵育反应6小时。
  注意：孵化是在没有搅动/摇动的情况下进行的。我们还孵育过夜，没有产量损失。但是，我们尚未确定足够标记的最短孵育时间。
4. 加入2倍体积的AMPure XP珠粒和5.4倍体积的异丙醇;通过上下移液10次混合均匀。
5. 在室温下孵育7½分钟。混合，再孵育7½分钟。
6. 将珠子放在磁铁架上。珠子沉淀后，去除上清液。＆nbsp;
7. 用新鲜配制的85％乙醇洗两次。
8. 在100μlddH 2 O中洗脱;将洗脱液移至新管中。
9. 使用NanoDrop测量1μl并确定DNA浓度。典型的回收效率为70-90％。
替代探针制备I-使用末端转移酶制备DNA探针
1. 在1.5 ml离心管中准备30μl末端转移酶（TdT）反应，其中含有1x末端转移酶反应缓冲液，0.25 mM CoCl 2 ，100 pmoles DNA oligo（无内部叠氮化物），300 pmoles of 5- Azidomethyl-dUTP，20 U TdT和ddH 2 。
  注意：可以按比例放大反应以准备大批量的探针。但是，我们建议使用不同探针的小规模TdT反应：5-叠氮甲基-dUTP比率，首先估算标记效率。
2. 在ThermoMixer C中37℃孵育反应1小时。
  注意：孵化是在没有搅动/摇动的情况下进行的。
3. 按照步骤A4-A7使用AMPure XP珠子纯化DNA。
4. 在20μlddH 2 O中洗脱;将洗脱液移至新管中。
5. 通过在NanoDrop上加载1μl来测量DNA浓度。
6. 在稀释于ddH 2 O的1x PBS中标记19μl具有10nmole IRDyes 680RD或800CW DBCO的探针。
  注意：确保IR染料和探针之间的摩尔比大于10：1。
7. 在室温下孵育6小时。
8. 按照步骤A4-A7使用AMPure XP珠子纯化探针。
9. 在15μlddH 2 O中洗脱。在8 M尿素15％聚丙烯酰胺凝胶上运行完整的IR标记的寡聚洗脱液，并运行10 pmoles未标记的寡核苷酸。
  注意：运行未标记的探针以估计TdT反应添加了多少核苷酸非常重要。
10. 检测Li-Cor Odyssey CLX扫描仪上的红外信号（图1A）。
11. 用1x SYBR Green I染色凝胶，并在ImageQuant 300 Imager中观察信号（图1A）。
12. 匹配红外图像和SYBR Green I染色图像，以确定最突出标记的探针。＆nbsp;
13. 切除含有最突出标记探针的凝胶切片。
14. 将凝胶块置于1.5ml离心管中，在室温下在600μl1：1 RNA洗脱缓冲液：苯酚/氯仿/异戊醇中洗脱过夜，在旋转混合器上轻轻旋转。
15. 将液体转移到新的1.5毫升管中。
16. 涡旋30秒并在4℃下以21,000 x g 旋转5分钟。
17. 将水相转移到新的1.5ml离心管中。
18. 加入300μl氯仿，涡旋30秒，并在4℃下以21,000 x g 旋转5分钟。
19. 将水相转移到新的1.5 ml离心管中。
  注意：我们建议添加15μg糖原与DNA共沉淀，并帮助观察颗粒。
20. 加入1ml冷的100％乙醇并在-80℃下孵育15分钟。
21. 在4℃下以21,000 x g 旋转30分钟。
22. 取出所有溶液，风干颗粒约3分钟或直至干燥。
23. 在22μlddH 2 O中重悬RNA。
24. 使用NanoDrop定量1μlRNA。
替代探针制备II-使用T7径流转录产生RNA探针
1. 设计并制备含有T7启动子的PCR模板，用于T7径流转录反应。
2. 在37℃下孵育过夜，含有40mM Tris-HCl pH 8.0,25mM NaCl，2mM亚精胺（HCl） 3 ，8mM MgCl 2 的10μl反应， 1 mM ATP，1 mM总UTP（UTP比例为3：1：5-azido-C 3 -UTP），1 mM GTP，1 mM CTP，20 U鼠RNase抑制剂，10 mM DTT和4 U T7 RNA聚合酶。
  注意：可以按比例放大反应以准备大批量的探针。然而，我们建议使用不同的UTP：5-azido-C 3 -UTP比率的几种小规模T7体外转录来估计转录和随后的IR染料标记效率优先。
3. 使用8M尿素6％聚丙烯酰胺凝胶分离体外转录的RNA，并通过UV遮蔽检测RNA，然后切除含有RNA的凝胶切片。
4. 将凝胶切片置于1.5ml离心管中，在室温下在600μl1：1 RNA洗脱缓冲液：苯酚/氯仿/异戊醇中洗脱过夜，在旋转混合器上轻轻旋转。
5. 按照步骤B15-B24提取并乙醇沉淀RNA。
6. 如步骤B6-B7所述，用IRDye 680RD或800CW DBCO标记RNA探针。
7. 如步骤A4-A7中所述，通过AMPure XP珠粒纯化。
8. 在15μlddH 2 O中洗脱。在8M尿素6％聚丙烯酰胺凝胶上运行完整的IR标记的RNA洗脱液。
9. 检测Li-Cor Odyssey CLX扫描仪上的红外信号（图1B）。
10. 用1x SYBR Green I染色凝胶，用ImageQuant 300 Imager观察信号（图1B）。
11. 切除标记的探针。
12. 将凝胶块置于1.5ml离心管中，在室温下在600μl1：1 RNA洗脱缓冲液：苯酚/氯仿/异戊醇中洗脱过夜，在旋转混合器上轻轻旋转。
13. 按照步骤B15-B24提取并用乙醇沉淀RNA探针。
TRIzol提取RNA
1. 在具有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的McCoy 5A培养基中的6孔板中培养HCT116和HCT116 Drosha敲除细胞。
2. 汇合时，取出培养基并用1x PBS冲洗细胞。将细胞收集在1.5ml微量离心管中，并在4℃下以1,000 xg /小时沉淀3分钟。
3. 去除大部分上清液，在残留的（~20-30μl）1x PBS中短暂重悬细胞。
  注意：如果将TRIzol添加到干细胞沉淀中，细胞将不会完全溶解。
4. 向从一个孔收集的每个细胞沉淀中加入1ml TRIzol并涡旋30秒。
5. 加入200μl氯仿，涡旋30秒，并在4℃下以12,000 x g 旋转15分钟。
6. 将水相（约550μl）转移到新的1.5ml微量离心管中。
7. 通过加入等体积（550μl）异丙醇沉淀RNA，并在室温下孵育10分钟。
8. 在4℃下以21,000 x g 旋转20分钟，应在管底部形成白色颗粒。
9. 除去上清液，用1ml冷的75％乙醇洗涤沉淀。
10. 在4℃下以21,000 x g 旋转5分钟。
11. 除去上清液，风干沉淀约3分钟，并将RNA重悬于20μlddH 2 O中。
12. 将1μlRQ1DNA酶与5μl10xDNase RQ1缓冲液和24μlddH 2 O混合并向RNA中加入混合物。
13. 在37°C孵育反应30分钟。
14. 用ddH 2 O使体积达到300μl，并加入300μl苯酚/氯仿/异戊醇。
15. 按照步骤B16-B24提取并用乙醇沉淀总RNA。糖原可以省略。
尿素-PAGE，转移和Northern印迹
1. 将15-20μg总RNA样品与等体积的2x甲酰胺加载染料混合，在95℃加热样品3分钟，立即置于冰上，并在8M尿素15％聚丙烯酰胺凝胶上分离RNA。
2. 使用Owl HEP系列半干电印迹系统将凝胶以300 mAmps转移至Hybond N +膜1小时。
  注意：或者，可以使用湿转移系统（RNA：实验室手册，第3章，方案11）转移通过尿素-PAGE分离的RNA。如果在琼脂糖凝胶上分离RNA，则应使用传统的毛细管转移方法（RNA：实验室手册，第3章，方案9）。
3. 在纸巾上短暂干燥膜并使用254nm UV交联剂在120mJ / cm 2下交联膜两次。
4. 在杂交炉中，将杂交管中的膜与10ml ExpressHyb杂交溶液在30℃下预杂交30分钟。
5. 去除预杂交溶液，并在30°C下与10 pmole杂交溶液稀释的10 pmoles IR探针杂交过夜。
  注意：
  1. 如果不同的探针用不同的IRDye标记，它们可以组合在一起同时检测不同的RNA。
  2. 应针对不同的探针调整杂交温度，比计算的T m 低约20°C。我们建议miRNA的杂交温度为30°C。当使用RNA探针时，我们通常在65°C下进行杂交过夜，不会因温度而失去信号。
6. 将稀释的探针收集在15 ml离心管中，并储存在-20°C。
  注意：探针可以重复使用几次而不会显着丢失信号。
7. 将膜置于干净的玻璃盘中，加入2x SSC（盐水 - 柠檬酸钠）-0.1％SDS洗涤缓冲液洗涤膜。
  注意：将膜浸入~1 cm溶液中。
8. 在室温下以110rpm摇动10分钟。
  注意：根据探头和目标之间的T m ，可以根据不同探头调整洗涤温度。
9. 用1x SSC-0.1％SDS洗涤缓冲液在室温下以110rpm振荡进行第二次洗涤10分钟。
  注意：如果需要更高的洗涤严格性，请继续使用含有较低SSC浓度和较高SDS浓度的洗涤缓冲液。
10. 用纸巾轻轻擦干膜。
11. Li-Cor Odyssey CLX扫描仪上的图像，用于检测700 nm和/或800 nm的发射（图1C）。
12. 从膜上剥离探针;将膜置于玻璃盘中，倒入微波煮沸的0.1x SSC-1％SDS-40nM Tris-HCl pH 8.0，在室温下以110rpm摇动10分钟。
13. 重复剥离程序（步骤E12），用纸巾擦干膜，并存放在保护膜中。
  注意：膜可以存放多年并在以后重新探测。

数据分析

使用Image Studio软件分析数据。用户无需更改原始图像即可调整亮度和对比度。该软件还允许定量信号，尽管我们没有在该协议中进行。对于想要多路复用的用户，软件同时扫描两个不同的波长并覆盖图像，生成两个独立但完美叠加的图像。

图1.使用IR探针替代生成IR探针和检测let-7a和U6。 A.从末端转移酶反应产生的DNA IR探针，并在8 M尿素15％聚丙烯酰胺凝胶上分离。在Li-Cor Odyssey CLX扫描仪上扫描凝胶，然后用SYBR Green I染色，然后使用UV透射仪观察。含有所需IR标记探针的条带用括号表示。 B.通过T7 体外转录产生的RNA IR-探针，并在8M尿素6％聚丙烯酰胺凝胶上分离。在Li-Cor Odyssey CLX扫描仪上扫描凝胶，用SYBR Green I染色，然后在UV透射仪上显现。切下IR标记的RNA。 C. irNorthern同时检测miRNA let-7a和小核RNA U6。使用TRIzol提取来自HCT116野生型和Drosha敲除（KO）细胞的总RNA，在8M尿素15％聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移至膜。将let-7a和U6的irNorthern探针杂交过夜，并使用Li-Cor Odyssey CLX扫描仪显现膜。 Canonical miRNAs（ ie。，let-7a）需要Drosha进行处理，并且不在Drosha KO细胞中表达（Kim et al。，2016）。 U6用作加载控制。图1A和1B中的图像最初是在Miller et al。，2018年的RNA中发表的，可以在 https://rnajournal.cshlp.org/content/24/12/1871 。

笔记

使用红外染料时，使用铝箔包裹的管或琥珀色管来保持库存远离光线非常重要。此外，我们发现IRDye 800CW标记的探针比680RD标记的探针更敏感。因此，我们建议使用800CW标记的探针进行多重化，以获得不太丰富的靶标。
在与靶RNA杂交后，在方法C中产生的RNA探针不能从膜上完全剥离。

食谱

1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）
137 mM NaCl
10mM Na 2 HPO 4
2.7 mM KCl＆nbsp;
RNA洗脱缓冲液
300 mM NaOAc
25mM Tris-HCl，pH 8.0
8 M尿素15％聚丙烯酰胺凝胶
5克尿素
2毫升5倍TBE（Tris-硼酸盐-EDTA）
625μlddH 2 O
*微波炉直至溶液温热（约5-8秒）
3.75毫升40％丙烯酰胺
*旋转直至尿素完全溶解
52μl10％APS
10μlTEMED
8 M尿素6％聚丙烯酰胺凝胶
5克尿素
2毫升5倍TBE
2.875 ml ddH 2 O
*微波炉直至溶液温热（约5-8秒）
1.5毫升40％丙烯酰胺
*旋转直至尿素完全溶解
52μl10％APS
10μlTEMED
2x Formamide装载染料
80％Formamide
0.1％溴酚蓝
0.1％二甲苯氰醇
20 mM EDTA
20mM Tris-HCl，pH 8.0

致谢

谢实验室由国立卫生研究院（R00-CA190886和R35-GM128753至M.X.），佛罗里达大学研究机会种子基金（至M.X.）和Thomas H. Maren基金会（初级研究基金F013372至M.X.）提供支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Alwine，J.C.，Kemp，D.J。和Stark，G.R。（1977）。通过转移至重氮苄氧基甲基纸并与DNA探针杂交检测琼脂糖凝胶中特定RNA的方法。 Proc Natl Acad Sci USA 74（12）：5350-5354。
Jones，C。G.（2005）。审查美国辐射防护法规，建议和标准的历史。 Health Phys 88（2）：105-124。
Kim，Y.K.，Kim，B。和Kim，V。N.（2016）。重新评估 DROSHA ， Exportin 5的角色和 DICER 在microRNA biogenesis中。 Proc Natl Acad Sci USA 113（13）：E1881-1889。
Miller，B.R.，Wei，T.，Fields，C.J。，Sheng，P。和Xie，M。（2018）。近红外荧光Northern印迹。 RNA 24（ 12）：1871-1877。
Rio，D.C.，Hannon，G.J。，Ares Jr.，M。和Nilsen，T.W。（2011年）。 RNA：实验室手册。纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社。 ISBN：978-0-879698-91-1。
Seibl，R.，Holtke，HJ，Ruger，R.，Meindl，A.，Zachau，HG，Rasshofer，R.，Roggendorf，M.，Wolf，H.，Arnold，N.，Wienberg，J。和等人（1990）。核酸的非放射性标记和检测。 III。地高辛体系的应用。 Biol Chem Hoppe Seyler 371（10）：939-951。
Zarnegar，B.J.，Flynn，R.A.，Shen，Y.，Do，B。T.，Chang，H.Y。和Khavari，P。A.（2016）。 irCLIP平台，用于有效表征蛋白质-RNA相互作用。 Nat Methods 13（6）：489-492。