材料和试剂

BD Instyle Autoguard BC Shielded IV导管（BD，目录号：381423）
1.5毫升Eppendorf管（USA Scientific，目录号：1615-5510）
Serum Collection Micro Tube 1.1 ml Z-Gel（Sarstedt，目录号：41.1500.005）
ELISA Assay Plate（康宁，目录号：3690）
70μm网孔（Fisher Scientific，目录号：22363548）
96孔圆底培养板（Corning，目录号：3799）
聚苯乙烯泡沫塑料板（我们使用冰盒的顶部 - 没有目录号）
BD PrecisionGlide TM 针25 G x 5/8（BD，目录号：305122）
1毫升注射器（BD，目录号：309597）＆nbsp;
50毫升管（康宁，目录号：430828）
小鼠C57BL / 6男性和女性（8-16周龄，男性和女性）
PspA（家族1，进化枝2）（BEI资源，目录号：NR-33178）
抗小鼠IgG-HRP（Southern Biotech，目录号：1030-05）
抗小鼠IgG1-HRP（Southern Biotech，目录号：1070-05）
抗小鼠IgG2C-HRP（Southern Biotech，目录号：1079-05）
抗小鼠IgA-HRP（Southern Biotech，目录号：1040-05）
甲型H1N1流感病毒核蛋白（北京义翘神州，目录号：11675-v08B）
CDG（Invivogen，目录号：vac-cdg）
卵清蛋白EndoFit TM （Invivogen，目录号：vac-pova）
无内毒素的生理用水（Fisher Scientific，目录号：BP2470-1）
无内毒素的PBS（Enzo，目录号：ALX-505-007-L010）
异氟醚（Patterson Veterinary，目录号：NDC 14043-70405）
10x PBS（Fisher Scientific，目录号：BP399-1）
70％乙醇
吐温®
ELISA Assay Diluent（Invitrogen，目录号：00-4202-43）
ELISA Coating Buffer（Invitrogen，目录号：50-112-8923）
1x TMB Solution（Invitrogen，目录号：00-4201-56）
ELISA Stop Solution（Invitrogen，目录号：SS04）
RPMI（Invitrogen，目录号：11875-093）
DMEM（Invitrogen，目录号：11965118）
胎牛血清（亚特兰大生物，目录号：S11150H）
ACK裂解缓冲液（Invitrogen，目录号：A10492-01）
100 mM丙酮酸钠（Gibco，目录号：11360-070）
1 M HEPES（Gibco，目录号：15630-80）
2-巯基乙醇（Sigma，目录号：M6250-10ML）
100x Pen / Strep（Gibco，目录号：15140-122）
DNaseI（罗氏，目录号：10104159001）
Liberase TM（罗氏，目录号：05 401 127 001）
eBiosciences TM Ready-Set-GoIFNγ，IL-17A，IL-5和IL-13ELISA试剂盒（Fishersci，目录号：50-173-19,50-112-8965,50-172 -08,50-172-61）
肺消化缓冲液（见食谱）
10％文化媒体（见食谱）
ELISA洗涤缓冲液（见食谱）

设备

E-Z麻醉系统（Euthanex Corp）
流量计（附E-Z麻醉）
蒸发器（附E-Z麻醉）
Fisher Scientific数字涡旋混合器（Fisher Scientific，目录号：02-215-370）
镊子（不需要，任何解剖钳）
剪刀（没必要，任何解剖剪刀）
Thermo Scientific Revco Rel450A冰箱（Thermo Scientific，目录号：DISCONTINUED）＆nbsp;
-20°C冰柜（VWR，目录号：10819-408）
-80°C冰箱（Thermo Scientific，目录号：RLE30086A）
xMark TM 微孔板吸光度分光光度计（BIORAD，目录号：168-1150）
Heracell 150i CO 2 培养箱（Thermo Fisher，目录号：50116047）

程序

疫苗制剂
1. CDG的制备
  1. 在1.5 ml无菌Eppendorf试管中，用无内毒素的生理水制备无菌CDG原液（2 mg / ml）。＆nbsp;
  2. 通过上下移液混合溶液。
  3. 储存在-80°C。 CDG股票在我们的实验室中保留至少3年的活动。
2. 抗原的制备
  1. 用无内毒素的PBS制备无菌储备抗原（PspA，OVA或H1N1 NP）溶液（1mg / ml）。
  2. 通过上下移液混合溶液。
  3. 储存在-80°C。蛋白质抗原库在我们的实验室中至少稳定3年。
鼻内疫苗给药
1. 在第0天，在无内毒素的1x PBS中新鲜制备含有5μgCDG和2μg抗原的悬浮液用于实验样品。
2. 在第0天，在无内毒素的PBS中新鲜制备每只小鼠含有2μg抗原的悬浮液用于对照样品。
3. 通过放入异氟醚室麻醉小鼠。
  1. 要使用机器，请打开供气并使流量计在500-1,000 ml / min之间。
  2. 将蒸发器打开至5％。
  3. 将鼠标放入腔室并密封顶部。
  4. 等到鼠标麻醉。
4. 从室中取出鼠标，用背部皮肤将鼠标握在手中，使头部朝上。
5. 将30μl疫苗溶液注入动物的鼻孔。让动物呼吸疫苗溶液。＆nbsp;
6. 在进行第二次免疫接种（共2次免疫接种）之前等待14天。
收集血清以测量血液中的抗原特异性抗体
1. 可以在最后一次免疫后的2周，1个月，3个月和6个月检测CDG诱导的血清抗体。
2. 从每只小鼠的尾巴收集血液。
  1. 切成靠近鼠尾的底部。
  2. 收集约50-100μl血液并置于血清收集管中。
  3. 在室温下以600 x g 旋转样品10分钟。
  4. 收集上清液并将样品保存在-20°C。
收集支气管肺泡液（BALF）以测量肺中的抗原特异性抗体
1. 可以在最后一次免疫后的2周，1个月，3个月和6个月检测到CDG诱导的BALF抗体。
2. 牺牲小鼠CO 2 。＆nbsp;
3. 用70％乙醇清洁鼠标。
4. 将鼠标放在泡沫聚苯乙烯板上，用针固定手臂和腿。
5. 去除颈部周围的皮肤，露出胸廓和颈部。
6. 用镊子轻轻去除颈部周围的肌肉，露出气管。
7. 用剪刀在气管表面做一个小切口。＆nbsp;
8. 装入1 ml注射器，加入0.8 ml 1x PBS。
9. 将BD Instyle Autoguard BC Shielded IV导管连接到0.8 ml注射器并插入气管。
10. 缓慢注射并将1x PBS回收到1.5ml Eppendorf管中，并置于冰上。
11. 将样品在350 x g 下在4°C下旋转5分钟。＆nbsp;
12. 将上清液转移到新的1.5ml Eppendorf管中并置于冰上。
13. 将样品保存在-20°C。
检测抗原特异性IgG，IgG1，IgG2C（C57BL / 6小鼠）或IgG2A（BALB / c小鼠）和血清和BALF中的IgA产生
1. 在包被缓冲液中使用1μg/ ml抗原（PspA，H1N1 NP或OVA）包被ELISA测定板。
  1. 每孔加50μl。
  2. 将板保持在4℃过夜。
2. 用洗涤缓冲液洗涤板5次。＆nbsp;
3. 向每个孔中加入100μl封闭缓冲液并在室温下放置1小时。
4. 封闭完成后，用洗涤缓冲液洗涤板5次。
5. 在封闭缓冲液中以1：5,000稀释血清样品，稀释2倍，进行4次稀释。
6. 在封闭缓冲液中以1：100稀释BALF样品，稀释2倍，进行4次稀释。
7. 向各孔中加入50μl各系列稀释液。
8. 将板保持在4℃过夜。
9. 使用洗涤缓冲液洗涤板5次。
10. 向每个孔中加入与HRP缀合的二抗，并在室温下放置2小时。
11. 使用洗涤缓冲液洗涤板5次。
12. 向每个孔中加入50μlTMB溶液并孵育15分钟。
13. 加入50μl终止溶液。
14. 在读板器上读取450 nm的样品。
召回测定法测定肺中抗原特异性T细胞反应（粘膜反应，在无菌条件下进行）
1. 在最后一次免疫后2周，1个月，3个月和6个月收获肺。
  1. 为了分离肺细胞，用CO 2 处死免疫小鼠。
  2. 用70％乙醇清洁鼠标。
  3. 打开胸腔以暴露心脏和肺部。
  4. 切断肝脏上方的主动脉。
  5. 使用无菌1x PBS，将10 ml冷的1x PBS注入左心室以灌注肺部。灌注的肺应该是白色的。
  6. 将肺转移到含有500μl冰冷的1x PBS的1.5ml Eppendorf管中以清洗肺部。
  7. 将肺加入含有1 ml消化缓冲液的1.5 ml Eppendorf试管中，并在37°C下保持1.5小时。消化缓冲液已预热至37°C。
2. 消化后制成单细胞悬液
  1. 使用1 ml注射器柱塞将消化的肺组织通过70μm筛网与无菌RMPI压入无菌50 ml管中。
  2. 将样品在350 x g 下在4°C下旋转5分钟。
  3. 倒出上清液。＆nbsp;
  4. 向沉淀中加入1ml冰冷的无菌ACK裂解缓冲液。
    1. 解聚细胞沉淀，重新悬浮并将细胞转移至1.5ml Eppendorf管中并在室温下倒置2分钟。
    2. 在4℃下将管旋转350 x g 5分钟。＆nbsp;
    3. 倒出上清液。
  5. 解聚细胞沉淀并将细胞重悬于1ml无菌RPMI中并计数细胞。从一只8~16周龄的WT C57BL / 6小鼠收获的肺通常产生约7500万总细胞，细胞存活率> 1。 90％的群组。
  6. 将样品在350 x g 下旋转5分钟。
  7. 在10％培养基中重悬至浓度为50-60百万细胞/ ml。
3. 设置离体回忆测定。
  1. 在96孔圆底组织培养板中，接种200μl肺细胞。
  2. 每孔加入1μg抗原。最终抗原浓度为5μg/ ml。
  3. 将细胞在37℃和5％CO 2 下培养4天。
4. 收集所有上清液，使用来自eBioscience TM 的ELISA试剂盒测量IFNγ，IL-5 / IL-13，IL-17A细胞因子的产生。
  1. 将样品从每个孔转移至Eppendorf管并在350 x g 下旋转5分钟。
  2. 将上清液转移到新的Eppendorf管中。
  3. 储存在-20°C。
召回测定以测量脾脏中的抗原特异性T细胞应答（全身反应，在无菌条件下进行）
1. 制作单细胞悬液
  1. 在最后一次免疫后的2周，1个月，3个月和6个月收获脾脏。
  2. 使用1ml注射器柱塞将破碎的脾脏组织通过70μm筛网用无菌冰冷RPMI和2％FCS / 1mM EDTA压入无菌50ml管中。
  3. 将样品在350 x g 下在4°C下旋转5分钟。
  4. 小心吸出上清液。
  5. 将冰冷的无菌ACK裂解缓冲液（5ml）加入沉淀中。
    1. 解聚细胞沉淀，重悬细胞并在室温下放置5分钟。
    2. 加入20ml冰冷的RPMI / 2％FCS / 1mM EDTA，使管在350℃下旋转，在4℃下旋转5分钟。＆nbsp;
    3. 倒出上清液。
  6. 加入1ml无菌冰冷RPMI / 2％FCS / 1mM EDTA。
  7. 解聚细胞沉淀并重悬细胞。
  8. 将细胞转移到1.5ml Eppendorf管中并计数细胞。
  9. 将样品在350 x g 下旋转4分钟，持续5分钟。
  10. 在10％培养基中重悬至浓度为50-60百万细胞/ ml。
2. 设置 ex-vivo 激活系统
  1. 在96孔圆底组织培养板中，接种200μl脾细胞。
  2. 每孔加入1μg抗原。最终抗原浓度为5μg/ ml。
  3. 将细胞在37℃和5％CO 2 下培养4天。
3. 收集所有上清液，使用来自eBioscience TM 的ELISA试剂盒测量IFNγ，IL-5 / IL-13，IL-17A细胞因子的产生。
  1. 将样品从每个孔转移至Eppendorf管并在350 x g 下旋转5分钟。
  2. 将上清液转移到新的Eppendorf管中。
  3. 储存在-20°C。

食谱

肺消化缓冲液
1. 准备无菌的100 mg / ml DNase I溶液
  称取100毫克DNase I并将其溶于1毫升无菌水中涡旋并以50μl等分试样分配到1.5ml Eppendorf管中储存在-20°C＆nbsp;
2. 准备无菌2.5 mg / ml Liberase TM溶液
  称取5 mg Liberase TM并将其溶于2 ml无菌水中涡旋并以200μl等分试样分配到1.5ml Eppendorf管中储存在-20°C＆nbsp;
3. 在1ml RPMI中为每只含有200μgDNaseI和25μgLexraseTM的小鼠新鲜制备消化缓冲液。使用前预热至37°C
10％的文化媒体
FBS 50毫升
100x 100 mM丙酮酸钠5 ml
100x 1 M HEPES 5 ml
100x Pen / Strep 5 ml
2-巯基乙醇2μl
DMEM 435毫升＆nbsp;
ELISA洗涤缓冲液
添加0.1％吐温® 20至1x PBS
彻底混合

致谢

该协议改编自先前发表的工作（Blaauboer et al。，2014和2015; Mansouri et al。，2019）。这项工作得到了R01AI110606和R21AI125999对LJ的支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

将小鼠饲养并饲养在佛罗里达大学的动物研究设施中。用小鼠进行的所有实验均通过佛罗里达大学的Institutional Animal Care and Use Committee（方案号201609362,05 / 09 / 2016~05 / 08/2019）的规定和批准进行。

参考

Blaauboer，S。M.，Gabrielle，V。D. and Jin，L。（2014）。 MPYS / STING介导的TNF-α，而不是I型IFN，对粘膜佐剂活性至关重要（3'-5'） - 环 - 二 - 鸟苷 - 单磷酸盐体内。 J Immunol 192（1）：492-502。
Blaauboer，S.M.，Mansouri，S.，Tucker，H.R.，Wang，H.L.，Gabrielle，V。D. and Jin，L。（2015）。粘膜佐剂环二糖-GMP可增强抗原摄取，并选择性激活有细胞吞噬作用的细胞 in体内。 Elife 4：e06670。
Ebensen，T.，Schulze，K.，Riese，P.，Morr，M。和Guzman，C.A。（2007）。细菌第二信使cdiGMP作为粘膜佐剂具有良好的活性。 Clin疫苗免疫 14（8）：952-958。
Madhun，A.S.，Haaheim，L.R.，Nostbakken，J.K.，Ebensen，T.，Chichester，J.，Yusibov，V.，Guzman，C.A。and Cox，R.J。（2011）。鼻内c-di-GMP佐剂植物来源的H5流感疫苗诱导多功能Th1 CD4 + 细胞和小鼠中强烈的粘膜和全身抗体反应。疫苗 29（31）：4973-4982。
Mansouri，S.，Patel，S.，Katikaneni，D。S.，Blaauboer，S.M.，Wang，W.，Schattgen，S.，Fitzgerald，K。和Jin，L。（2019）。未成熟肺TNFR2 - 常规DC 2亚群激活moDC以促进环状di -GMP粘膜佐剂对体内的反应。粘膜免疫 12（1）：277-289。
McWhirter，SM，Barbalat，R.，Monroe，KM，Fontana，MF，Hyodo，M.，Joncker，NT，Ishii，KJ，Akira，S.，Colonna，M.，Chen，ZJ，Fitzgerald，KA，Hayakawa， Y.和Vance，RE（2009）。通过细胞溶质感应细菌第二信使cycl-di-GMP诱导宿主I型干扰素反应。 J Exp Med 206（9）：1899-1911。
Yan，H.，KuoLee，R.，Tram，K.，Qiu，H.，Zhang，J.，Patel，G.B。和Chen，W。（2009）。 3'，5'-Cyclic diguanylic acid引发针对细菌感染的粘膜免疫。 Biochem Biophys Res Commun 387（3）：581-584。