材料和试剂

培养皿（150 mm x 25 mm）（Corning，目录号：CLS430597）
培养皿（100毫米）（康宁，目录号：CLS430591）
200μl塑料吸头
无菌14毫升聚苯乙烯培养管（Corning，目录号：352057）
玻璃载玻片（75 mm x 25 mm）（Thermo，目录号：421-004T）
胶带（玻璃纸胶带）
Millex-HV注射器过滤器，0.45μm，PVDF（Merck，Millipore，目录号：SLHVM33RS）
1毫升注射器（BD，目录号：309647）
聚乙烯管（OD 1.2 mm）（BD，Intramedic TM ，Clay Adams ®）
常规竹牙签（可从任何超市获得）
封口膜
1.5毫升管（Eppendorf，目录号：0030120086）
钝头针（McKESSON，目录号：8881202363）
棉花（可从任何超市获得）
Biohazard包（学院仓库）
拟南芥种子（Col-0）
枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌 NCIB 3610 mCherry报告菌株的甘油原液（从单个菌落获得，储存在-80°C）
聚二甲基硅氧烷（PDMS）和固化剂（Sylgard 184有机硅弹性体套件）（Dow Corning Corporation）
100％乙醇（西格玛，目录号：34852）
dH 2 O（Sigma，目录号：W4502）
KOH（Sigma，目录号：P5958）
用于种子灭菌的HCl（Sigma，目录号：H1758）和漂白剂（Sigma，目录号：425044）。
半强度植物生长培养基，基础盐Murashige和Skoog（MS）（Duchefa Biochemie，目录号：M0221）
植物琼脂（Duchefa Biochemie，CAS号：9002-18-0）
TB缓冲液（见食谱）

设备

钳子
解剖刀
250毫升玻璃烧瓶
移液器（Eppendorf20,200,1,000μl）
烤箱
热板
OD（600 nm）读数器
37°C振荡培养箱
微流体通道模具（参见附带的CAD文件）
SU-8 2150（MicroChem Corp.）
干燥器与真空线
Harris Unicore打孔器（1毫米）（Ted Pella，目录号：15074）
手持式电晕发生器（Laboratory Corona Treater，Electro-Technic Products，型号：BD-20AC）
高压灭菌器
干燥器
配备暗场物镜的倒置光学显微镜（例如，Olympus）
带自动舞台系统的共聚焦显微镜（例如，Nikon Ti-eclipse）

软件

专用共聚焦显微镜软件
在这项研究中，我们使用了尼康共聚焦和NIS元素程序。
斐济（ImageJ）

程序

跟踪根交互系统（TRIS）设备制造和组装（在实验前几天开始）
1. 通过使用软光刻技术在硅晶片上沉积光致抗蚀剂SU-8 2150来制备微通道模具（图1A）（Qin 等人，，2010）。
2. 该程序基于制造指南表应用，以达到160微米的深度。
  注意：请阅读制造商关于正确处理此类粘胶材料（SU-8 2150）的建议。
3. TRIS设备组装：
  1. 将模具放入150mm培养皿中，蚀刻的光致抗蚀剂的图案化模具面朝上（图1A）。用胶带将模具固定在板上。
  2. 根据制造商的建议准备25毫升PDMS混合物。在塑料称重船中，称取10份硅弹性体，然后加入1份固化剂。使用塑料棒将两种试剂充分混合。
  3. 将培养皿置于干燥器中并在真空下脱气1小时。重要的是在将PDMS混合物倒入培养皿上的固定模具之前从PDMS混合物中除去所有气泡。
  4. 吹氮气或空气以去除可能积聚在模具上的任何灰尘。小心地将脱气的混合物倒在硅主体上。
  5. 将PDMS在60°C下固化过夜。
    注意：阅读制造商关于固化PDMS的建议。
  6. 使用锋利的刀片（手术刀）在一个矩形件中仔细切出每个相邻的8/9特征（图1B和1C）。图案化的微通道将在PDMS中可见。
  7. 使用1 mm Harris Unicore打孔器在通道入口，出口和根孔（图1C和1D）上打孔。
  8. 完成制作孔后，盖住通道的两侧（例如，用胶带），以防止灰尘颗粒和碎屑。
  9. 在将PDMS板粘合到载玻片上之前，取下胶带，将载玻片和PDMS通道面朝上放在干净的平面上。为了激活PDMS和载玻片的表面，这将导致两种材料的共价键合，我们在表面上方约1-2cm处使用手持式电晕发生器。在每个表面上均匀地处理表面30秒。
  10. 小心地将PDMS装置放在处理过的载玻片上，微通道图案朝向载玻片。手工施加温和均匀的压力，以确保均匀的密封。
  11. 密封后直接用载玻片在100°C下烘烤已安装的通道20分钟。
  12. 将安装的微流体装置在120℃下高压灭菌20分钟。在室温条件下无菌保存高压灭菌的样品。
  图1. TRIS：用于实时跟踪根 - 细菌相互作用的微流体装置。 A.用于光刻过程的微流体装置掩模（图案）设计，用于生成九个单个微流体通道的阵列。左侧：一个单通道尺寸的放大倍数。 B.安装在显微镜载物台（暗边缘）上的TRIS装置的图示。（插图）含微流体通道的根和细菌细胞的纵切面示意图（红色;未按比例绘制）。 C.在附着于TRIS装置的塑料移液管尖端中生长的拟南芥幼苗的顶视图。入口，设备和出口分别连接到入口管，尖端有秧苗和出口管。从尖端延伸的细白色弦可见根。（比例尺：1厘米）。 D.在使用明场照射以10x放大率捕获的TRIS微流体装置内生长的9个拟南芥根的显微镜视图。箭头：a，入口; b，在根专用端口尖端，c，根向出口端延伸; d，出口。（比例尺：5毫米）。这个数字改编自Massalha et al。（2017）。
细菌培养准备（在实验前一天开始）
1. 放置 B。将含有3ml TB培养基的无菌聚苯乙烯培养管中的枯草芽孢杆菌培养物在37℃，165rpm振荡培养箱中培养过夜。
2. 在实验前4小时将1：100稀释到新鲜的3ml TB培养基中并在相同条件下再次孵育以达到0.6 600 。
3. 用MS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于MS培养基中以获得10 6 细胞/ ml（在使用之前过滤MS以使用0.45μmPVDF注射器过滤器消除可能的小碎片）。
4. 通过使用暗视野显微镜记录的几帧中的移动细胞数来计算游泳细胞与静态细胞的比例。
植物生长（实验前5-6天开始）
1. 中等和塑料尖端准备：
  1. 准备0.5倍强度的基础盐MS。使用KOH将pH调节至5.8。将准备好的媒体分成两部分。将1％植物琼脂加入一份。
  2. 对培养基的两部分进行消毒。
  3. 通过高压灭菌器消毒200μl塑料吸头和竹牙签。
  4. 冷却后，培养基熔化固化的培养基，并用5μl填充灭菌的200μl尖端。让介质再次凝固。重要的是在室温下固化之前使用液体介质（图2A显示了带有固化介质的塑料尖端）。
  5. 在培养基储存固化之前，用~30ml培养基填充90mm培养皿。让培养皿中的培养基固化。
  6. 在无菌环境中，在尖端的固化培养基水平上方用带有火焰的手术刀切割填充的尖端。使用火焰钳将尖端固定在无菌的150 mm培养皿中。
  7. 用带有镊子的镊子收集填充的塑料尖端，并将它们放入固化的琼脂中（在步骤C1e中制备的90mm培养皿中）。固定在培养皿中的固化琼脂中的填充尖端可以用封口膜密封并在4℃下储存以备后用。
2. 与（1）平行，在封闭的干燥器中将拟南芥（例如，Col-0）种子在氯气中灭菌2小时。将带有种子的1.5ml管子置于干燥器容器中（在通风橱中）。将含有100ml漂白剂的250ml玻璃烧瓶放入干燥器和6ml浓HCl中，立即关闭并用封口膜密封干燥器。 2小时后，打开通风橱中的干燥器，让氯气蒸发几分钟。
3. 使用无菌牙签，将一粒种子无菌转移到含有半强度基础盐MS的塑料移液管尖端，所述基础盐MS补充有0.8％植物琼脂（图1C）。根据实验需要准备尽可能多的种子提示。
4. 通过在冷室中保持带有尖端的板两天来对种子进行分层以避免光照。
5. 将含有种子的尖端转移到23小时的16小时光照/ 8小时黑暗时间中3-4天（或在生长的根部从塑料尖端穿透之前）（图2A）。
6. 将安装的微流体装置放入盒子中，放入生物危害袋中，并使用高压灭菌器对其进行灭菌（类似于TRIS装置组装部分中的步骤'A3l'）。
7. 用液体0.5x MS小心地填充高压灭菌的微流体装置，以消除在无菌条件下捕获在系统中的气泡。
8. 在无菌条件下将带有生长幼苗的塑料尖端放入高压灭菌的TRIS装置中（图1A和1B）。
9. 在成像前垂直孵育4-5天（直到生长的根到达TRIS通道的中间）。将液体介质添加到垂直板上以覆盖输出孔并保持湿度（图2B）。用封口膜密封板以防止任何液体泄漏。
  
  图2.使用微流体TRIS装置准备拟南芥幼苗以跟踪根 - 细菌相互作用。 A.填充有凝固琼脂的塑料尖端的提示（填充的琼脂沉淀到所有尖端中的相同水平，由透明塑料尖端中拟南芥种子的高度表示，其中拟南芥幼苗发芽放置在琼脂平板中。 B. 拟南芥幼苗在塑料尖端固定在TRIS装置上并垂直培养。
将TRIS系统安装到显微镜载物台（成像前2小时开始）
1. 在细菌培养期间，清洗将连接到微流体室的所有管道。每个通道准备两个管（长管和短管，请参见后续步骤以确定每个管的长度）。用70％乙醇清洁所有管道，以去除可能的制造污染物。用dH 2 O洗涤管两次以使用1ml注射器除去残留的乙醇。＆nbsp;
2. 将钝端针固定在植物培养基中含有洗过的细菌的1ml注射器中。清除注射器开口处的气泡。避免快速填充以防止气泡。
3. 将长管连接到钝端针，并通过推动注射器的活塞填充管。确保管的长度足以在显微镜载物台上组装系统时具有灵活性（见图3）。
  
  图3.安装在显微镜载物台上的TRIS装置的视图。该装置包含具有拟南芥幼苗的微流体通道，整个装置包括管道系统，1 ml注射器，培养基水库，以及由丙烯酸塑料制成的湿度室（比例尺：5厘米）。修改自Massalha 等（2017）。
4. 保持短管不要充满液体。＆nbsp;
5. 根据微通道的数量准备Eppendorf管。使用细镊子在Eppendorf管的盖子上打一个孔，并用1 ml MS填充。
6. 快速，从垂直板上取下TRIS设备，用Kimwipe干燥液滴（避免通过触摸入口/出口孔干燥TRIS设备的内容物），将TRIS设备固定到显微镜载物台支架（优选的没有开口的载玻片架）保持潮湿的条件）。
7. 将连接到注射器的长管插入入口孔，将短管插入每个微通道的输出孔。施加足够的压力迫使管道从PDMS表面到玻璃载片的大约一半处，但要小心，以避免PDMS入口和出口出现裂缝。
8. 用透明盖快速盖住设备以保持湿度（图3）。
9. 将透明盖子培养皿放入湿棉布内，以保持湿度。
10. 将输出管（短管）的第二端浸入装有1ml MS介质的Eppendorf管中。
11. 设置显微镜参数：
  1. 扫描（x，y） - 每个通道的坐标（缝合参数应在初步实验中测试）。
  2. 所有使用过的通道的暴露时间（应在初步实验中测试）。
  3. 循环次数。
  4. 周期间隔。
  5. 找到根的中间部分。设置±40μmz-stack。
12. 通过缓慢推动注射器的活塞将细菌引入微流体通道。继续推动活塞，直到出口管充满。
13. 在完成步骤D9之后，立即开始扫描该微通道。
14. 在步骤D10完成后，暂停显微镜，将细菌引入下一个微通道，然后继续扫描。
15. 继续执行步骤D12到D14，直到最后一个微通道。
图像分析
1. 斐济用于可视化结果并生成我们使用LOCI包打开生物显微镜格式的总结电影（Schindelin et al。，2012）。
2. 扩展的景深包（斐济， http://imagej.net/Extended_Depth_of_Field ）或来自文件交换的FStack功能repository（MathWorks）用于从不同的z-stack生成单个EDF图像。
3. Matlab用于根据每个图像中明视场通道的亮度对EDF图像进行分割，然后计算细菌信号的相对强度。

数据分析

TRIS装置的主要结果是细菌密度作为位置和时间的函数。细菌荧光的相对强度用于估计细菌的密度，并通过从感兴趣的区域减去每个时间点的背景来计算。其他参数可以使用TRIS装置计算，即，根伸长和细菌动态。此阶段的数据分析高度依赖于生物学问题。

笔记

每个植物捕获的TRIS装置体积仅为~6.4μl，因此使植物对环境排列敏感。强烈建议跟踪生长条件，特别是在将植物移至TRIS设备时。

食谱

结核病缓冲区
1％（w / v）胰蛋白胨
0.5％（w / v）NaCl
高压灭菌器

致谢

该协议改编自Massalha 等人（2017）。这项研究得到了由Planning＆amp; Co.资助的博士学位的支持。以色列高等教育委员会预算委员会个人补助金（致H.M.）。

参考

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