材料和试剂

附着力滑梯，Polysine，25 x 75 x 1.0 mm（VWR，目录号：631-0107）
铝箔
离心管15 ml（PluriSelect，目录号：05-00002-01）
离心管50 ml（无菌）（PluriSelect，目录号：05-00001-01）
罐中的压缩空气（例如，空气除尘器PRF 4-44）
一次性pH指示纸（通用指示纸）（Johnson，目录号：101.3C）
一次性塑料巴斯德吸管（品牌，目录号：747750）
双刃剃须刀片（Personna，目录号：171930）
嵌入胶囊（8毫米扁平，聚丙烯胶囊）（TAAB，目录号：C095）
滤纸（圆圈，150mmØ），（Whatman，目录号：1001150）
带塑料按扣帽的玻璃瓶（ ca。 41 x 24 mm）（Karl Hecht，目录号：2783/3），或带盖帽的透明玻璃瓶（封闭顶部，PE透明，18毫米，500毫升20 x 40毫米）（VWR，目录号：548-0555）
用于透射电子显微镜的网格，例如，网格尺寸100目x250μm间距，镍或铜（TAAB，maxtaform HF4，目录号：GM021N; Sigma-Aldrich，目录号：G1528; Agar Scientific，目录号：G2500C）
轻型3层组织刮水器（VWR，目录号：82003824-CS）
金属针或解剖针（VWR，目录号：10806-330）
微量离心管1.5 ml（Sigma-Aldrich，目录号：Z606340）
显微镜载玻片，25 x 75 x 1.0 mm（VWR，目录号：48300-025或Thermo Scientific，目录号：10144633CF）
纸标签
Parafilm（Sigma-Aldrich，目录号：P7543）
铅笔
移液器吸头
塑料培养皿（Fisherbrand，目录号：S33580A）
防护手套（霍尼韦尔，目录号：Dermatril 740）
圆形硅橡胶（TAAB，目录号：G082）
带有铝制脊柱的单刃剃须刀片（VWR，目录号：233-0156）
滑动标签（Agar Scientific）或单面粘性纸
方形培养皿（120 mm）（Corning，目录号：BP124-05）
透明胶带（例如，苏格兰威士忌）
废物容器
琼脂，植物琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：9002-18-0）
牛血清白蛋白（BSA），冻干粉≥96％（琼脂糖凝胶电泳）（Sigma-Aldrich，目录号：9048-46-8）
磷酸二钠（Na 2 HPO 4 ）（在室温下储存：室温，约21°C）（Sigma-Aldrich，目录号：7558-79-4））
蒸馏水
乙醇实验室试剂，绝对，≥99.5％（易燃，存放在指定地点）（Sigma-Aldrich，目录号：64-17-5）
甲醛（FA）（10 ml安瓿，16％无甲醇FA）（健康危害，在室温下关闭，或在冷室/冰箱中打开4°C）（Thermo Scientific，目录号：28908）或多聚甲醛（PFA））用于组织学（CH 2 O） n ，（在冷藏室/冰箱中储存4°C）（JT Baker，目录号：S898-07）
Formvar溶液（1％formvar in dichloroethane，用于显微镜检查）（Sigma-Aldrich，目录号：63148-64-1）
戊二醛（GA）（I级，1 ml安瓿，25％GA，H 2 O，经过特殊纯化后用作电子显微镜固定剂，线性公式：OHC（CH 2 ） 3 CHO（健康危害，在环境温度下关闭，或在冷室/冰箱中开启4°C）（Sigma-Aldrich，目录号：111-30-8）
氯化氢（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：7647-01-0）
LR白色树脂中等催化（健康危害，储存在冷藏室/冰箱4°C）（TAAB，目录号：L012）
磷酸一钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：7778-77-0）
磷酸单钠（NaH 2 PO 4 ）（在环境温度下储存）（Sigma-Aldrich，目录号：7558-80-7）
Murashige和Skoog基础培养基（MS）（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：7447-40-7）
一抗（PlantProbes： www.plantprobes.net 或佐治亚大学： www.ccrc.uga.edu ）
二抗，例如，EM山羊抗大鼠IgG（H + L）：10 nm金（BBI溶液，目录号：014990）或EM山羊抗小鼠IgG（H + L）10 nm Gold（BBI Solutions，目录号：EM.GMHL10）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：7647-14-5）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：1310-73-2）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：57-50-1）
用于显微镜的甲苯胺蓝（Sigma-Aldrich，目录号：6586-04-5）
TopVision低熔点琼脂糖（LMP琼脂糖）（在环境温度下保存）（Thermo Scientific，目录号：R0801）
吐温20（Signa-Aldrich，目录号：P1379）
醋酸铀酰（UA）（危害健康，在环境温度下储存）（VWR，目录号：541-09-3）
半强度MS基础培养基（见食谱）
多聚甲醛 - 戊二醛（4％PFA和0.05％GA）固定液（见食谱）
磷酸盐缓冲液（PB），0.1 M溶液（pH = 7.2）（见食谱）
低熔点（LMP）琼脂糖1％溶液（见食谱）
不同乙醇浓度10％-95％（见食谱）
不同LRW树脂浓度10％-75％（见食谱）
甲苯胺蓝溶液（见食谱）
阻断试剂（BR）1％（见食谱）
抗体解决方案（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），0.1 M溶液（pH = 7.2）（见食谱）
醋酸铀酰溶液（5％）（见食谱）

设备

分析平衡
高压灭菌器（YPO，型号：D66161）
离心机（Marshall Scientific，Eppendorf，型号：5417C）
锥形瓶
干燥器（Thermo Fisher，型号：5311-0250）
斜口钳例如，斯坦利斜口钳，5（Robosource，目录号：15-11）
金刚石刀，例如，超45°（硅藻土）
平烧杯或结晶器（宽直径）
钳子
冰箱（-20°C）
通风柜
玻璃面包师（50毫升）
玻璃刀条（Agar Scientific，目录号：AGG336）
用于组织刀的玻璃刀制造商（LKB，目录号：LKB 7801B，或Agar Scientific，目录号：AGL4158）
网格存储盒（LKB / Leica目录号：G133，或TAAB Gilder G062）
实验室烤箱/培养箱（60°C）
光学显微镜
带磁力搅拌棒的磁性热板搅拌器
金属1.5毫升Eppendorf机架
切片机（Reichart Ultracut）
微波炉
pH计
移液器
防护服和面具
冰箱（4°C）
旋转振动器或轨道振动器（IKA KS 130 Basic）
滑动晾衣架或载玻片染色罐（例如，DWK Life Sciences Wheaton）
小板钳夹具车间
薄画笔
透射电子显微镜（JEOL，型号：JEM-1230）
镊子：负动作式：薄弯曲尖端（Dumont，目录号：0203-N7-PO）或薄尖端（Dumont，目录号：0302-N0-PO-1）
镊子：直的日内瓦图案，细尖（Dumont，目录号：0103-0-PO）
涡旋混合器（Vortex-Genie 2）
保温板，或滑动干燥电炉（Agar Scientific，型号：AGL4384）或精神灯燃烧器

程序

植物材料固定
在本节中，我将描述植物材料制备和固定的程序。该协议是为拟南芥叶子开发的，但它也可以应用于其他生物和组织，如树种的根，芽和木质组织。
1. 播种前对种子进行消毒
  1. 将少量种子放入1.5ml Eppendorf管中（约为Eppendorf管体积的5％）。
  2. 用吐温20加入1ml 70％乙醇2分钟。
  3. 将70％乙醇和吐温20替换为1ml 95％乙醇1分钟。
  4. 取出乙醇，等待种子干燥。
  注意：在无菌通风橱下进行种子灭菌。
2. 在室内垂直琼脂平板（配方1）上生长拟南芥幼苗2周，长日照条件（16小时）（温度分别为20°C和18°C）。 br /> 注意：为了使生长同步，将平板放在4°C的冷室/冰箱中2-3天（在黑暗中），将种子春化。
3. 收获植物材料并将其直接放入装有3-5μl冷多聚甲醛 - 戊二醛（PFA-GA）固定溶液（配方2）的小瓶中。
  注意：记住从每株植物收获相同的叶子数（从底部到顶部计数：子叶，叶1，叶2，叶3，叶4，分生组织）。为了使固定剂能够很好地穿透，切割小方块（~2 mm 2 max）。在叶子的中间部分。收获来自不同植物的至少10片叶子。使用防护手套和衣服在通风橱下进行所有固定步骤（有关处理限制，请参阅零售商提供的安全数据表SDS）。通过使用永久性标记写下名称并在这些标签上粘贴透明胶带来标记样品瓶。
4. 在环境温度下在干燥器中对样品进行真空吸尘，直到植物碎片下沉（约4小时）。
  注意：可能会发生一些样品在吸尘后漂浮，这表明样品更可能含有氧气。尝试收集位于样品瓶底部的样品。
5. 将小瓶放在旋转或轨道振荡器上，让样品混合几个小时。
6. 将样品放在冷藏室/冰箱（4°C）中过夜。
7. 丢弃PFA-GA固定剂。
8. 用磷酸盐缓冲液（PB）（配方3）洗涤样品（两次，每次30分钟）。
  注意：在指定的废液瓶中使用一次性塑料巴斯德吸管丢弃PFA-GA固定液和第一次PB洗涤液。加入至少5毫升PB或蒸馏水（PB和蒸馏水越多，洗涤效果越好）进行清洗。在通风橱下，在旋转或轨道振动器上缓慢混合所有洗涤步骤。
在低熔点（LMP）琼脂糖中包埋植物材料
在LMP琼脂糖中包埋小植物片段是定位样品进行切片的最佳方法（例如，交叉或纵向）。它标记了芽/根尖的方向（图1A）或远轴和近轴叶侧的定位（图1B）。嵌入还有助于处理和保护样品。

图1.将植物块置于低熔点（LMP）琼脂糖中。 A-B。样品嵌入长方体形状的琼脂糖块中，呈现一个切割边缘以标记样品的方向（例如，图1A中的左上角）。 A.根部的顶部由切边标记。 B.当切边位于左上方时，叶片的正面位于前面。
1. 用蒸馏水洗涤样品（两次，每次30分钟）。
2. 将一层薄薄的（3-5毫米厚）琼脂糖（配方4）倒在方形塑料培养皿上，等待几分钟直至琼脂糖冷却（但不应固化）。
3. 使用镊子将植物材料放在琼脂糖上（许多块放在同一块板上，但样品之间的距离约为2-3厘米 2 ）。
  注意：小心处理植物标本，不要损坏组织。
4. 加入更多琼脂糖（±3毫米厚的层）覆盖植物标本（等到琼脂糖凝固）（图2A）。
5. 用嵌入的标本切下琼脂糖的小立方体（一个立方体中的一个标本）（图2B）。
  注意：琼脂糖立方体的大小不应大于嵌入胶囊（8mmØ）的直径。
6. 切下琼脂糖立方体中的一个角以定向样品（图1,2B和2C）。
7. 将块移至装有蒸馏水的小瓶中，然后丢弃水，然后再进行下一步。
  
  图2.将植物材料包埋在琼脂糖中。 A.方形培养皿中填充一层3毫米厚的琼脂糖。 B.小的长方体形状的琼脂糖块，切割的一个边缘（从正面看到所有的叶片）。 C.放大的琼脂立方体，前面的叶子的背面。在这种情况下，大型植物碎片用于可视化，但它们应该小5倍。
脱水标本包埋在琼脂糖块中
在这里，我描述了一种从样品中去除水分并使树脂更好渗透的常用方法。时间间隔可以调整;但是，更长的间隔可以提供更好的嵌入质量。理想情况下，脱水过程将在两天内进行，但所有脱水步骤也可在同一天内进行（取决于样品大小）。
1. 如下所述，将分级乙醇系列中的样品脱水（配方5）：
  10％乙醇（两次，每次30分钟）
  20％乙醇（两次，每次30分钟）
  30％乙醇（两次，每次30分钟）
  50％乙醇（两次，每次30分钟）
  注意：加入的乙醇量根据琼脂糖中嵌入的样品的大小和数量而变化。确保琼脂糖块完全被乙醇覆盖。
2. 将样品置于环境温度（在工作台上）的50％乙醇中过夜。
  注意：用塑料按扣盖关闭小瓶以防止乙醇蒸发。
3. 继续在分级乙醇系列中对样品进行脱水，如下所示：
  70％乙醇（两次，每次30分钟）
  80％乙醇（两次，每次30分钟）
  90％乙醇（两次，每次30分钟）
  95％乙醇（三次，每次30分钟）
  99.5％乙醇（三次，每次30分钟）
  注意：在旋转或轨道振荡器上进行所有脱水步骤。应使用塑料按扣盖关闭样品瓶。一些中间乙醇稀释液可以省略（例如，20％和80％乙醇），但它可能会影响嵌入质量。对于所有样品瓶，最后一步中的酒精量应相同。
树脂嵌入
在该步骤中，用粘性和低溶解性LR白（LRW）树脂代替醇。所有这些步骤必须在轨道振荡器上剧烈混合样品的同时逐步进行。在冷藏室/冰箱（4°C）中执行所有这些步骤，以防止树脂聚合。

图3.将植物材料嵌入树脂中。 A.嵌入胶囊和纸标签。 B.树脂聚合后的胶囊。 C.切割胶囊以除去树脂块。 D.单独树脂块。 E.修剪树脂块成梯形。
1. 用已知体积为99.5％乙醇的小瓶缓慢加入几滴树脂，直至树脂含量达到总体积的10％（v / v）。
  注意：所有步骤，包括更换树脂，必须使用防护手套和通风橱下的衣服进行。在冷室/冰箱（4°C）中，将塑料按扣盖在轨道振动器中混合，保持小瓶关闭。务必将树脂丢弃到指定的废物中。
2. 将小瓶放在轨道振荡器中以将样品混合过夜。
3. 用以下分级树脂系列中的新树脂交换树脂10％的酒精（配方6）：
  10％树脂（约5小时）
  25％树脂（约5小时）
  50％树脂过夜
  75％树脂（约5小时）
  100％树脂过夜
  100％（新鲜）树脂过夜
  注意：可以省略一些中间树脂稀释液（例如，25％和75％），但它可能会影响嵌入质量。 < br />
在嵌入胶囊和树脂聚合中关闭样品
这是嵌入程序的最后一步，您必须注意正确定位样品（图1）。琼脂糖块应平放在胶囊底部的中间（图4A和4B），其需要在朝向刀刃的平行方向上取向（参见步骤G，图6）。小心处理胶囊，以防止样品在角落附近滑动，这可能会导致修剪样品和切片时出现一些问题。

图4.切片前修剪植物标本。 A-B。一片胶囊，其中一片叶子嵌入树脂（A）中。样品应位于胶囊底部的中间（B）。 C-即从底部看到单独的样品树脂：修剪前的树脂（C），修剪方向（D），修整样品（E）。 F.从侧面看到的修剪树脂块。
1. 将胶囊（图3A）放在架子上，用树脂填充胶囊的一半。
2. 将样品放入胶囊中，使样品充分定向并用新鲜树脂填充胶囊。
3. 切割小纸标签，用铅笔标记，然后将它们放在胶囊顶部。
  注意：胶囊应填充树脂，以便通过关闭它，不会留下气泡的空间。使用铅笔标记样品而不是笔或标记，可以用树脂洗掉。
4. 将胶囊放入培养箱/烘箱（60°C）中24小时（或直至其变为固体）以使树脂聚合。
  注意：切记检查烤箱的温度（60°C）。温度过低会影响聚合反应（树脂不能均匀聚合），而温度过高或温度过长会导致树脂开裂或破裂。
5. 当树脂变硬时，样品就准备好了（图3B）。
  注意：要知道树脂是否固化，请将金属针压在树脂表面。
准备用于透射电子显微镜（TEM）的栅格
用于TEM的样品安装在小网格上，然后将其插入TEM内。网格必须涂有formvar，formvar是保持这些部分的粘合层。确保显微镜载玻片，镊子和实验室玻璃器皿清洁（使用纸巾刮水器和压缩空气清洁表面上的灰尘）。
1. 添加约。将50ml formvar溶液加入小烧杯中（图5A）。
2. 将显微镜载玻片垂直放置（保持暗淡的一侧）并大力蘸水。 formvar溶液中一半的载玻片（溶液中不超过约5秒）（图5B）。
  注意：formvar会在侧面形成一层薄膜。
3. 在干燥架上用垂直位置的薄膜擦干载玻片3-10分钟。
  注意：请勿触摸与formvar解决方案接触的幻灯片的任何部分。
4. 准备宽直径（≥10cm）的玻璃器皿并用蒸馏水填充。将网格放在圆形硅橡胶或滤纸上（图5C）。
5. 用锋利的剃刀刀片刮擦滑动边缘，并在滑动件上吹湿空气。
6. 将载玻片垂直（90°或≥45°）浸入蒸馏水浴中。
  注意：您将看到胶片从玻璃上脱落然后漂浮在水面上。
7. 使用精细的镊子，将网格放在漂浮的薄膜上，暗淡的一面与formvar接触（尽可能多地放置网格）（图5D和5E）。
  注意：每个网格都有两面：暗边和光泽边（图7A）。切片将安装在formvar涂层的暗淡侧面（此侧应与缓冲液，抗体，蒸馏水，对比污渍接触）（图7B），并且在干燥过程中，有光泽的一面将与滤纸接触。样品（由你决定用formvar涂在哪一面，然后记住要保持一致）。
8. 准备一张由单面粘性纸或幻灯片标签覆盖的新幻灯片（图5F）。
9. 抓住垂直位置的滑块并触摸浮动薄膜的一个边缘（图5G）。
10. 将载玻片浸入水中，这将使带有栅格的薄膜粘附到载玻片上（图5H和5I）。
11. 保留带有用formvar覆盖的网格的载玻片直到干燥。
  注意：将载玻片存放在密闭的盒子或塑料培养皿中，放在冷藏室/冰箱（4°C）中。
  
  图5.为TEM准备网格。 A. Baker填充formvar溶液并在载玻片染色罐上滑动。 B.在formvar溶液中浸渍显微镜载玻片。 C.装满蒸馏水的玻璃器皿，带圆形硅橡胶的培养皿和网格，镊子。 D.镊子夹住网格的外圈。 E.在浮动的formvar薄膜上的网格，薄膜的暗淡侧面。 F.将幻灯片标签贴在幻灯片上。 G.在接触浮动薄膜的边缘之前垂直滑动。 H.将载玻片浸入水中，使得带有栅格的薄膜粘附到载玻片上。 I.滑动formvar和网格。
用于电子显微镜的超薄切片
准备这些部分最重要的是正确定位样品。记得定期控制部分质量。确保细胞/组织/器官与刀平行定向（图6），如果不是，则校正样品和刀刃之间的角度。

图6.电子显微镜的超薄切片：首先将样品平行于刀刃定向。当树脂靠近刀时，在树脂表面上会看到刀的反射。这种反射应与样品平行（如果方向适当）。切片进展时，确保细胞/组织/器官与刀平行定向（记住校正样品和刀刃之间的角度）。
1. 使用小型钳夹车间固定胶囊。
2. 使用坚硬的单刃剃刀刀片和斜切钳（图3C和3D）去除胶囊。
3. 用坚硬的单刃剃须刀片修剪样品的底部，然后使用薄的双刃剃须刀片进行更精确的切割（图3E和4C-4F）。
  注意：样品底部与刀刃平行（参见程序E），应修剪成梯形，底部有较大（较长）底座，底部较小（较短）顶部（图3E，4D-4F和6）。梯形的尺寸不应超过金刚石刀的长度（≤2mm）。
4. 将树脂块安装在超薄切片机支架上，样品底部朝向刀具。
5. 将树脂块与样品对齐，使样品的修剪底部（图4A）与玻璃刀刃平行（图6）。
  注意：当样品靠近刀子时，您将能够看到刀子在树脂表面上的反射（这种反射应该是平行的）。
6. 用玻璃刀切几个部分。
  注意：切片厚度可超过1微米。这一点的目的是看看这些部分的外观和正确的方向。
7. 将一滴蒸馏水放在常规或聚赖氨酸涂层的载玻片上，并在该滴上放几个部分。
  注意：使用湿刷（更薄，更好）来收集部分。
8. 载玻片上的干燥部分（见设备30）。
9. 将一滴甲苯胺蓝染色（配方7）放在切片上一分钟，然后在自来水下洗涤。
10. 观察光学显微镜下的切片。
  注意：如果样品以正确的方式定向，您可以开始超薄切片。如果方向不正确（细胞被歪斜），请调整样品位置并重复切片（步骤G5-G10）。
11. 将金刚石刀安装到超薄切片机上，并用蒸馏水填充浴槽。
12. 以与上述类似的方式将树脂块与样品对准（参见步骤G5）。
13. 开始超薄切片（70纳米薄切片），直到看到漂浮在水面上的切片带。
14. 使用镊子将网格浸入水下（顶部带有formvar的钝侧）并收集一些部分。
15. 将网格留在滤纸上或圆形硅橡胶上直至干燥（图7A，编号7-9），存放在网格存储盒中。
  注意：请记住将光亮的一面放在底部，并将光滑的一面放在顶部。
免疫金标记
在这里，我描述了如何进行细胞壁表位的标记。在该过程中，一抗与特定细胞壁表位结合，然后通过与金颗粒偶联的二抗识别，以便在TEM中可视化。免疫定位程序依赖于将网格移动到包含不同溶液，抗体和染色的一系列小液滴上以进行对比，所有这些都被放置在封口膜上（图7和8）。请记住包括野生型，未经处理的植物以及单独的二抗等对照，不应给出任何标记。

图7.用于电子显微镜的网格。 A.具有两面的网格：暗淡的一面和有光泽的一面。具有光泽边的网格对应于数字1,3,5。具有暗淡边的网格对应于数字2,4,6,7-9。切片安装在formvar涂层的暗淡侧面（编号7-9）。 B.暗淡的一面与液滴接触。通常，光泽面必须与滤纸接触，同时干燥样品（未显示）。

图8.免疫定位程序。标记依赖于将网格移动到包含不同溶液（阻断试剂[BR]，一抗，PBS缓冲液，二抗，蒸馏水）的一系列小液滴中在封口膜上。
1. 将一块封口膜放在干净的桌子上。
  注意：使用70％乙醇清洁桌子。用纸覆盖的封口膜的一面是干净的，应该在顶部（将放置不同溶液的液滴）。避免用手触摸封口膜，以免污染。在封口膜下面加几滴水，用胶带粘在封口膜的角落，使其稳定并保持平整。
2. 在封口膜上连续放置几滴BR（取决于网格的数量）（对于BR，参见配方8）（图8A）。
3. 将网格放置在BR的液滴上，并在环境温度下放置15分钟（包含该部分的网格的暗淡侧面应与液滴接触）（图7B和8B）。
  注意：务必使用干净的镊子转移网格。建议使用一套镊子（负面动作式）。为避免抗体之间的交叉污染，请始终用70％乙醇清洁镊子，用蒸馏水冲洗并用干净的纸巾擦拭干净，然后再与网格接触。务必小心处理网格。镊子应仅与电网的外环接触。
4. 将第一抗体溶液（配方9）的液滴放入第二行（使用BR代替一抗用于对照，其仅用二抗处理）。
5. 将网格从BR液滴中取出，用干净的滤纸接触网格边缘（以吸收试剂）并将网格转移到带有一抗的液滴上。
  注意：从滤纸的圆圈中剪切小三角形，使用尖锐的笔尖触摸网格边缘。
6. 在室温下与一抗孵育45-60分钟。
  注意：在一抗和二抗孵育期间，确保溶液不会变干。为防止干燥，请使用覆盖样品，，一个大玻璃培养皿。
7. 将PBS液滴（配方10）放入下一行。
8. 将网格从一级抗体液滴中取出，用干净的滤纸（以吸收试剂）接触网格边缘，然后将网格转移到含有PBS的液滴上。
  注意：用PBS冲洗网格四次。在每个液滴上留下网格5分钟。在转移到下一个PBS液滴之前，始终用滤纸吸收之前的PBS。
9. 将二抗溶液（配方10）的液滴放入下一行。
10. 以类似的方式将网格传输到上面（步骤H5和H8）。
11. 在环境温度下与相应的二抗孵育60分钟。
12. 将蒸馏水滴放入下一排。
13. 以类似的方式将网格传输到上面（步骤H5和H8）。
  注意：用蒸馏水冲洗网格四次。在每个液滴上留下网格5分钟。在转移到下一个水滴之前，请务必使用滤纸吸收以前的水。
14. 从蒸馏水滴中取出网格，用干净的滤纸（以吸收试剂）接触网格的边缘，然后将网格转移到滤纸或硅橡胶上（暗淡的一侧应该打开部分）最佳）。
15. 将网格放置至少60分钟或直至干燥（用大的培养皿覆盖以防止污染）。
16. 将一滴乙酸双氧铀（UA）（食谱11）放在一块新的封口膜上。
  注意：以最大速度短暂旋转。
17. 将网格转移到乙酸铀酰（UA）液滴上，在环境温度下在黑暗中放置10分钟（UA对光敏感）。
18. 从UA液滴中取出网格，用干净的滤纸（以吸收试剂）接触网格边缘，并将网格转移到蒸馏水滴上。
19. 用负片式镊子夹住网格，用自来水冲洗每个网格30秒，然后将网格放在滤纸或硅橡胶上，等待干燥（带有截面的暗淡侧面应位于顶部）（图7A），点7-9）并存储在网格存储盒中。
  注意：所有涉及使用UA的步骤必须在通风橱下使用防护手套和衣服时特别注意。所有UA废物必须放在指定的废物箱中。避免在UA中孵育太长时间，因为它会产生过高的对比度。

食谱

半强度MS基础培养基
1. 加入2.2克MS
2. 加入10克蔗糖（1％v / v）
3. 加入蒸馏水至最终体积为1升
4. 在磁力搅拌器上用磁力搅拌棒混合溶液
5. 通过用氯化氢（HCl）降低pH或用氢氧化钠（NaOH）增加pH将pH调节至5.6
6. 加入7克植物琼脂（0.7％v / v）
7. 高压灭菌培养基
多聚甲醛 - 戊二醛（4％PFA和0.05％GA）固定溶液
1. 将4 g多聚甲醛（PFA）粉末加入带有100 ml 0.1 M磷酸盐缓冲液（4％PFA总浓度）的锥形瓶中
2. 添加磁力搅拌棒，盖上铝箔以防止蒸发，并将烧瓶放在磁性热板搅拌器上（90-100°C）
3. 加入几滴氢氧化钠溶液（NaOH）以加速溶解粉末（使用0.1 M或更低浓度的NaOH），然后将其混合直至粉末完全溶解（可能需要几个小时）
4. 通过用氯化氢（HCl）降低pH或用氢氧化钠（NaOH）增加pH将pH调节至7.2
5. 加入200μl25％戊二醛（GA）（总浓度为0.05％GA）
6. 将固定液储存在指定（通风）冰箱中（短期储存）或将固定液冷冻在-20°C（长期储存）
注意：PFA和GA具有高毒性。在通风橱下进行所有工作，带防护手套，衣服和面罩。将固定剂丢弃到指定的废物中。建议准备新鲜的固定剂或使用已经制备的PFA溶液。为了不产生额外的浪费，建议计算所需的固定剂的确切量（参见步骤A1）。为了不污染pH计，建议使用一次性pH指示纸。
磷酸盐缓冲液（PB），0.1 M溶液（pH = 7.2）
1. 制备0.1M磷酸二钠（Na 2 HPO 4 ）和另一种0.1M磷酸二氢钠溶液（NaH 2 PO 的储备溶液> 4 ）将这些盐溶解在蒸馏水中
2. 通过将68.4 ml磷酸二钠溶液（Na 2 HPO 4 ）与31.6 ml磷酸二氢钠溶液（NaH 2 PO 4 ）（Sambrook et al。，1982）
注意：建议准备新鲜浓度，因为盐可能会沉淀。用pH计测量确认pH。在环境温度下储存前，高压灭菌磷酸盐缓冲溶液。
低熔点（LMP）琼脂糖1％溶液
1. 将1g LMP琼脂糖溶于100ml蒸馏水中
2. 用微波炉加热至沸腾
3. 在接触植物材料之前，请等待冷却
不同乙醇浓度10％-95％
1. 用蒸馏水将乙醇绝对浓度≥99.5％混合，得到不同浓度
2. 准备每种浓度约100毫升，并将其保存在密闭瓶中
不同的LRW树脂浓度为10％-75％
将LWR树脂与乙醇绝对≥99.5％混合，得到不同浓度
甲苯胺蓝溶液
1. 将0.5g甲苯胺蓝粉末溶于50ml 70％乙醇中。
2. 通过将0.5g NaOH溶解在50ml蒸馏水中制备1％氢氧化钠（NaOH）溶液
3. 将甲苯胺蓝溶液与1％NaOH以1：5的比例混合
4. 通过用氯化氢（HCl）降低pH或用氢氧化钠（NaOH）增加pH将NaOH的pH调节至2.5
阻断试剂（BR）1％
将1克牛血清白蛋白（BSA）溶于100毫升PBS中（总浓度为1％BR）
抗体解决方案
一抗在BR（1:10）中稀释，二抗在BR中稀释（1:50）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），0.1 M溶液（pH = 7.2）
8克氯化钠（NaCl）
0.2克氯化钾（KCl）
1.15g磷酸二钠（Na 2 PO 4 ）
0.2克磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）
重新加注蒸馏水至1升
通过用氯化氢（HCl）将其降低或用氢氧化钠（NaOH）将其增加来将pH调节至7.2 注意：在环境温度下储存前，先将高压灭菌磷酸盐缓冲溶液。
醋酸铀酰溶液（5％）
1. 在15ml管中加入0.5g UA至5ml双蒸水中
2. 通过用氯化氢（HCl）降低pH值或用氢氧化钠（NaOH）将pH值调节至3.5来调节pH值
3. 用高达10毫升的双蒸水填充试管并大力摇动内容物
4. 通过滤纸过滤溶液或在离心机中以最大速度旋转溶液10分钟并将液体部分转移到新管中
5. 让UA解决方案在黑暗中
注意：在通风橱下准备UA溶液，并特别注意使用防护手套和衣服。所有UA废物必须放在指定的废物箱中。为了不污染pH计，建议使用一次性pH指示纸。

致谢

我想非常感谢StéphanieRobert和Richard S. Smith对手稿的撰写和对工作的支持。我承认Nicola Trozzi校对手稿。我要感谢Lenore Johansson，Kjell Olofsson和Janusz Kubrakiewicz分享他们的经验。这项工作在Umeå大学的UmeåCoreFacility电子显微镜进行。这项工作得到了瑞典研究委员会Vetenskapsrådet（授权号VR2012-2343和VR2016-00768）和Vinnova（VerketförInnovationssystem）和ERA-CAPS的支持。该方案改编自已发表的研究（Majda et al。，2017）。

利益争夺

我声明任何利益冲突或竞争利益。

参考

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Cosgrove，D.J。（2005）。植物细胞壁的生长。 Nat Rev Mol Cell Biol 6（11）：850-861。
Donev，E.，Gandla，M.L。，Jonsson，L。J.和Mellerowicz，E.J。（2018）。为生物精炼厂设计木材非纤维素多糖。 Front Plant Sci 9：1537。
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Majda，M。（2018年）。细胞壁在细胞形状获取中的作用。瑞典农业科学大学，瑞典于默奥。 Acta Universitatis agriculturae Sueciae。 10：1652-6880。 ISBN 978-9-17-760160-9。
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