材料和试剂

高压灭菌，未经处理的木制牙签（当地超市选择）
移液器吸头，100-1,000μl
移液器吸头，1-200μl
移液器吸头，0.1-10μl
1.5毫升Eppendorf管（Corning，Axygen ®，目录号：MCT-150-C）
0.2 ml PCR管（Merck，Corning ®，目录号：CLS6531-960EA）
Parafilm（Bemis，目录号：PM996）
培养皿直径90毫米（默克，目录号：P5731-500EA）
一次性比色皿（默克，目录号：Z330418-1PAK）
一次性环（Citotest Labware Manufacturing Co.，目录号：2121-0001）
一次性吊具（VWR，目录号：612-1560）
15ml离心管（Electron Microscopy Sciences，目录号：64760-01）
0.22μm膜滤器（默克，目录号：GSTF02500）
供体菌株 E.大肠杆菌 S17-1配有表1中列出的质粒（菌株可从Addgene获得， https://www.addgene.org/browse/article/28196767/ ）
受体菌株（例如， Pantoea eucalypti 299R）
编码荧光蛋白的质粒（表1）（表2）

表1.质粒

所有质粒的来源：Schlechter et al。，2018，质粒可以从Addgene质粒：118484到118579获得.X是0,1,2,3,4,5,6的占位符，7分别代表质粒的mTagBFP2，mTurquoise2，sGFP2，sYFP2，mOrange2，mScarlet-I，mCardinal或mClover3编码形式。 Kan R =卡那霉素抗性; Cam R =氯霉素抗性; Gent R =庆大霉素抗性; Tet R =四环素抗性; Amp R =氨苄青霉素抗性。

表2.荧光蛋白质特性*

* 更详细的频谱图可以在Schlechter et al。，2018中找到
Lysogeny肉汤（默克，目录号：110285）
琼脂1号（Oxoid，目录号：LP0011）
Tris free base（Sigma，目录号：T6791-500G）
冰醋酸（Sigma，目录号：695092-500ML）
甘油（Sigma，目录号：G6279-500ML）
琥珀酸盐（Sigma，目录号：S9637-500G）
DMSO（Sigma，目录号：D8418-100ML）
dNTPs（Thermo Fisher，目录号：N8080260）
多用途HyAgarose TM LE琼脂糖（HydraGene，目录号：R9012LE-500g）
Phusion聚合酶（Thermo Fisher，目录号：F530S）
寡核苷酸，合成量0.025μmol，通过脱盐纯化（参见表3，Macrogen）

表3.引物
核酸染色RedSafe（内含子，目录号：21141）
氨苄青霉素（Duchefa Biochemie，目录号：A0104）
庆大霉素（Duchefa Biochemie，目录号：G0124）
卡那霉素（Duchefa Biochemie，目录号：K0126）
氯霉素（Duchefa Biochemie，目录号：C0113）
四环素（Duchefa Biochemie，目录号：T0150）
乙醇（Carl Roth，目录号：T171.5）
K 2 HPO 4 （Sigma，目录号：795496-100G）
NaH 2 PO 4 ·2H 2 O（Sigma，目录号：71505-250G）
NH 4 Cl（Sigma，目录号：A9434-500G）
MgSO 4 ·7H 2 O（Sigma，目录号：63138-250G）
Na 2 EDTA·2H 2 O（Sigma，目录号：E6635-500G）
ZnSO 4 ·7H 2 O（Sigma，目录号：Z0251-100G）
CoCl 2 ·6H 2 O（Sigma，目录号：C8661-25G）
MnCl 2 （Sigma，目录号：244589-10G）
H 3 BO 3 （Sigma，目录号：202878-10G）
CaCl 2 （Sigma，目录号：C5670-500G）
Na 2 MoO 4 ·2H 2 O（Sigma，目录号：480967-25G）
FeSO 4 ·7H 2 O（Sigma，目录号：F8263-500G）
CuSO 4 ·5H 2 O（Sigma，目录号：469130-50G）
NaCl（Sigma，目录号：S7653-1KG）
KCl（Sigma，目录号：P9333-500G）
Na 2 HPO 4 （Sigma，目录号：S7907-500G）
KH 2 PO 4 （Sigma，目录号：P5655-500G）
NaOH（Sigma，目录号：S8045-500G）
脱矿水
Lysogeny肉汤（LB）（见食谱）
Lysogeny肉汤琼脂（LB琼脂）（见食谱）
最小介质（见食谱）
1. 10x铵溶液＆nbsp;
2. 10x磷酸盐缓冲溶液＆nbsp;
3. 10倍硫酸盐溶液＆nbsp;
4. 1,000x微量元素解决方案＆nbsp;
5. 20％琥珀酸盐溶液＆nbsp;
6. 3％琼脂＆nbsp;
1x磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）（见食谱）
抗生素储备溶液和工作浓度（见食谱）
1. 氨苄青霉素100mg / ml -1 储备溶液
2. 庆大霉素15mg ml -1 储备溶液
3. 卡那霉素50mg ml -1 储备溶液
4. 氯霉素15mg ml -1 储备溶液
5. 四环素5mg ml -1 储备溶液
TAE缓冲区（见食谱）
1. 0.5 M EDTA原液＆nbsp;
2. 50倍TAE库存解决方案
3. 1x TAE工作解决方案＆nbsp;

设备

钳子
移液器（Eppendorf，P1000，目录号：3120000062; P200，目录号：3120000054; P10，目录号：3120000020）
Erlenmeyer烧瓶125毫升（例如，默克，产品目录号：CLS4980125-12EA）
自动微量移液器（Eppendorf或Gilson）
金属镊子（VWR，目录号：232-0092）
本生灯（Eisco，目录号：CH0087A）
Vortex（科学工业，目录号：SI-0236）
高压灭菌器（Heidolph，目录号：023210745CA）
-20°C冰箱（Fisher and Paykel，目录号：E388LXFD1）
无菌工作台（Labconco，目录号：302389100）
用于1.5ml离心管的微量离心机，最大速度> 100℃。 6,000 x g （Eppendorf，目录号：5418000017）
离心15ml离心管，最大速度> 100℃。 6,000 x g （Eppendorf，目录号：5805000327）
摇动培养箱30°C和37°C（Infors，目录号：Multitron Pro）
孵化器30°C和37°C（粘合剂，目录号：BD 56）
分光光度计（Biochrom WPA CO8000细胞密度计，目录号：80-3000-45）
PCR热循环仪（Eppendorf，目录号：6311000010）
水平琼脂糖凝胶电泳装置，包括运行室和电源（VWR International，目录号：76196-448）
蓝光或紫外透射仪（可选：文件相机）（Fisher Scientific，目录号：UV95042001）
荧光显微镜，具有适当的滤光片组，用于荧光蛋白标签的激发和发射光谱，并配备5倍物镜，工作距离长（Zeiss Axio Imager.M1配有Objective A-Plan 5x / 0.12 M27 [Zeiss，目录号： 421030-9900-000]）

程序

工作流程概述如图1所示。

图1.协议流程表

准备或准备好用于结合的培养基和储备溶液

准备2个不含抗生素的溶原肉汤（LB）琼脂平板。
当使用携带转座子的质粒时，使用pMRE1XX质粒或含有氨苄青霉素和氯霉素的1个LB平板制备含有卡那霉素的1个LB平板（氨苄青霉素选择质粒，氯霉素选择转座子）。
准备3毫升和50毫升没有抗生素的LB肉汤。
当使用携带转座子的质粒时，使用pMRE1XX质粒或含有氨苄青霉素和氯霉素的3 ml和50 ml LB肉汤时，准备含有卡那霉素的3 ml和50 ml LB肉汤。＆nbsp;
准备~10个含有琥珀酸作为唯一碳源的基本培养基平板和选择质粒或转座子的抗生素，如表1所示。如果您选择转座子插入，不包括氨苄青霉素，因为它选择质粒，而不是转座子。如果在板中使用光敏四环素，则在4°C和黑暗中储存。
注意：选择一种碳源，用于接受菌株代谢/利用的基本培养基板。
准备100毫升无菌1x PBS。

第1天

条纹供体菌株 E.含有pMRE1XX，pMRE-Tn 5 -1XX或pMRE-Tn 7 -1XX的大肠杆菌S17-1在LB琼脂平板上含有来自甘油的适当抗生素使用一次性环并在使用pMRE-Tn 7 -1XX质粒时在37°C或30°C温育过夜。
注意：pMRE-Tn 7 -1XX质粒不会在32°C以上复制。因此，为了将其保持在细菌培养物中，它必须在较低温度下生长。
条纹受体菌株 P.使用一次性环从甘油原液在LB琼脂平板上的桉树酸299R，并在30℃下孵育过夜。

第2天

接种含有与以前相同的抗生素的3ml LB肉汤和单独的供体 E菌落。使用无菌牙签和乙醇燃烧的镊子，含有pMRE1XX，pMRE-Tn 5 -1XX或pMRE-Tn 7 -1XX的大肠杆菌S17-1。当使用pMRE-Tn 7 -1XX质粒时，以200转/分钟（rpm）和37℃或30℃孵育过夜。
接种3毫升不含抗生素的LB肉汤，单个菌落 P. eucalypti 299R使用无菌牙签和乙醇火焰镊子。在30°C和200 rpm下孵育过夜。

第3天

用含有与之前相同的抗生素的125ml锥形瓶中的500μl过夜培养物 E接种50ml LB肉汤。使用无菌移液管尖端和P1000移液管，含有pMRE1XX，pMRE-Tn 5 -1XX或pMRE-Tn 7 -1XX的大肠杆菌S17-1。当与pMRE-Tn 7 -1XX质粒一起使用时，在200rpm和37℃或30℃下孵育。生长至600nm的光密度（OD 600nm ）〜0.5，这将需要1.5小时至3小时，这取决于孵育温度。
注意：使用一次性比色皿和分光光度计定期测量OD 600nm 并记下最终的OD 600nm的
在不含抗生素的125ml Erlenmeyer烧瓶中接种50ml LB肉汤，用500μl过夜培养物 P. eucalypti 299R使用无菌移液管吸头和P1000移液器。在200 rpm和30°C孵育。一直长到 P. eucalypti 299R已经达到指数/早期稳定期，需要约3-4小时（OD 600nm 为0.7或更高）。使用一次性比色皿和分光光度计测量OD 600nm 。或者，受体菌株 P.可以使用无菌一次性环直接从板上刮下桉树藻299R，并通过温和涡旋将其重悬于含有1ml无菌1x PBS的1.5ml微量离心管中。
注意： P. eucalypti 299R是一种快速生长的菌株，其生长速率与 E相似。大肠杆菌 S17-1。对于其他物种，例如生长缓慢的菌株，接种量或接种时间可相应地变化。对于其他菌株，必须确定生长速率，指数生长期和早期/晚期稳定期。
通过在离心机中以2,000μL离心5分钟离心收获10ml两种培养物。弃去上清液，通过温和涡旋将每种培养物重悬于5ml无菌1x PBS中，并测量OD 600nm 。
注意：轻轻涡旋不到5秒，以避免剪切供体，这可能影响结合效率。还建议通过反演进行混合。
混合培养物以达到相似数量的供体和受体细胞。
示例：如果是10毫升 E。大肠杆菌 S17-1培养物的OD 600nm 为0.5，应将其浓缩至OD 600nm 1.如果10毫升 P. eucalypti 299R培养物的OD 600nm 为0.4，应浓缩至OD _{600nm 0.8。 P.因此，eucalypti 299R培养物仅含有 E的80％的细胞。大肠杆菌 S17-1培养物含有。因此，混合5毫升 P. eucalypti 299R培养物用4 ml（80％的5 ml） E。大肠杆菌 S17-1培养。
注意：对于其他菌株，每个OD的CFU数 600nm 必须事先确定。}
通过在离心机中以2,000μL离心5分钟收集组合的培养物，丢弃上清液并使用涡旋重悬于100μl无菌1x PBS中。
注意：轻轻涡旋不到5秒，以避免剪切供体菌毛，这可能会影响结合效率。还建议通过反演进行混合。
在无菌工作台中干燥不含抗生素的LB琼脂平板15分钟。在无菌工作台中，使用无菌移液管尖端和200μl移液管将重悬浮的培养物混合物滴在琼脂上。保持板打开并等待所有液体蒸发。然后，关闭平板并在30℃下孵育过夜。

第4天

使用线环收获培养液滴并转移至含有1ml无菌1x PBS的1.5ml微量离心管中。使用涡旋重悬细菌。将10μl，100μl和其余细菌悬浮液平板置于含有抗生素的基本培养基平板上，使用一次性或火焰灭菌的涂布器选择使用的质粒或转座子。最小的媒体将针对营养缺陷型 E进行选择。大肠杆菌供体。
在30°C孵育直至可见菌落出现在平板上。

第5-8天
注意：在结合后几周可能出现生长缓慢的菌株。

检查新出现的菌落中的形态和荧光发射。通常可以使用透射仪（例如，UV或蓝光）观察荧光，该透射仪也用于琼脂糖凝胶电泳（例如，对于大多数绿色，黄色，橙色和红色发光蛋白见图2）。另外，另外，用配备有非常低放大率和长工作距离物镜的荧光显微镜研究新出现的菌落是有用的。使用具有适当激发和发射滤光片的滤光片。通常菌落由供体和受体菌株两者组成，例如参见图3A。选择在荧光显微镜下看起来均匀荧光的菌落，并将它们在基本培养基（如上所述）上划线到单个菌落（图3B）。
注意：强迫联盟的一个有趣而美丽的例子。受体菌株为其他营养缺陷型 E提供营养。大肠杆菌和 E.大肠杆菌为受体菌株提供抗生素抗性。
在随后的几天中，在最小的培养基平板上使用一次性环将菌落重新划线至少三次。

图2.表达荧光蛋白的细菌菌落。 A和B.细菌在琼脂平板上作为粗条纹划线。表达的荧光蛋白在蓝光凝胶读数器上可视化。绿色，黄色，橙色，红色和远红色荧光菌落在凝胶读数器上很容易检测到，蓝色和青色荧光菌落难以与非荧光野生型菌落区分开。 C.使用附有凝胶记录系统的UV光盘显现表达的荧光蛋白。表达菌落的荧光蛋白看起来比野生型更亮。

图3.荧光和明场显微镜通道的叠加。 A.产生菌落的不成功缀合的实例。菌落是 Sphingomonas 物种和表达 E的红色荧光蛋白的混合物。大肠杆菌 S17-1。 B. P的克隆菌落。 eucalypti 299R :: MRE-Tn 7 -145。比例尺=500μm。

第9天，或随后的传播
在此阶段，您必须遵循不同的程序，具体取决于您选择的交付系统：
pMRE1XX质粒

作为最终检查，执行PCR以测试 E.大肠杆菌污染。为此，通过用高压灭菌的牙签挑取一部分菌落并从填充有100μl0.05MNaOH的0.2ml PCR管中移出细胞，从新生长的单个菌落中进行粗DNA提取。＆nbsp;
在PCR机中将样品在95℃下煮沸15分钟。根据制造商的建议，使用1μl粗DNA提取物作为模板进行PCR，使用Phusion聚合酶和引物FWD_ uidA 和REV_ uidA （参见图4））。
注意： E的存在。大肠杆菌将产生约500bp的PCR产物。要检查细菌菌株中是否存在 uidA ， E的序列。大肠杆菌基因（ https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/946149 ）可以针对目标菌株的基因组进行爆破。

图4. uidA 的菌落PCR检测大肠杆菌。 uidA 是 E。大肠杆菌和志贺氏菌属。特异性基因，因此该基因片段的扩增表明在重新分裂和菌落分离后混合菌落或假阳性菌落。使用的引物是FWD_ uidA 和REV_ uidA （表3）并产生500bp的产物。泳道M：分子标记（HyperLadder TM ，Bioline）;样本1： P. eucalypti 299R :: MRE-Tn 5 -145;样本2： E.大肠杆菌（pMRE-Tn 5 -145）;样本3： P. eucalypti 299R :: MRE-Tn 7 -145;样本4： E.大肠杆菌（pMRE-Tn 7 -145）; C-：水控制。在该示例中，样本＃1和＃3未显示 E的检测。大肠杆菌，而样品＃2和＃4显示 uidA 的存在。

的 pMRE-Tn的 <强> 5 <强> -1XX-Tn的 5 转座子传递质粒

执行 E.如上所述对pMRE1XX质粒进行大肠杆菌污染检查。
此外，使用引物FWD_Tn 5 _gt，REV_Tn 5 _gt，FWD_Tn 5 / 7 _gt和REV_Tn 多重PCR中> 5 / 7 _gt。引物组合测试了递送质粒的存在和样品中荧光蛋白编码序列的存在（例如参见图5）。含有质粒的样品将产生两条带（~700bp和~400bp），这表明 E.大肠杆菌污染。仅含有荧光蛋白编码序列的样品仅产生较大的条带（~700bp）。

图5.确定Tn 5 插入的菌落PCR。使用引物FWD_Tn 5 <的多重PCR结果/ em> _gt，REV_Tn 5 _gt，FWD_Tn 5 / 7 _gt，以及REV_Tn 5 / 7 _gt。 M：分子标记（HyperLadder，Bioline）;样本1： P. eucalypti 299R :: MRE-Tn 5 -145;样本2： E.大肠杆菌（pMRE-Tn 5 -145）;样品3：pMRE-Tn 5 -145; C-：水控制。

的 pMRE-Tn的 <强> 7 <强> -1XX-Tn的 7 转座子传递质粒

质粒的固化（取决于受体菌株）
pMRE-Tn 7 -1XX质粒系列是许多但不是全部肠杆菌科的条件性自杀质粒。 P上。 eucalypti 属于肠杆菌科，即，质粒能够在 P中复制。 eucalypti ，因为质粒复制起点pSC101在菌株中是有功能的。然而，pSC101是热不稳定的，并且在高于32℃的温度下不会复制（McKenzie和Craig，2006）。因此，为了从质粒中固化菌株，它必须在高温下生长。
1. 使用单个荧光菌落接种5ml LB肉汤培养物并在37℃下培养过夜。＆nbsp;
2. 使用接种环在LB琼脂平板上划线培养物并在37℃下孵育过夜。＆nbsp;
3. 选择10个单独的菌落，并将它们各自条纹放在含有Amp的新LB琼脂平板上和不含抗生素的LB琼脂平板上。仍然含有质粒的菌落将能够在氨苄青霉素上生长，而发生转座的菌落将仅在没有抗生素的LB琼脂平板上生长。
执行 E.如上所述对pMRE1XX质粒进行大肠杆菌污染检查。
另外，进行PCR以鉴定Tn 7 插入和/或源自Tn 7 的质粒的存在。使用FWD_Tn 5 / 7 _gt和REV_Tn 5 / 7 _g来检测荧光蛋白编码序列的存在样品（~700 bp）和引物Tn 7 _gt1，Tn 7 _gt2和Tn 7 _gt3表示是否存在传递质粒（ ~1,000 bp）。由于pMRE-Tn 7 -1XX质粒，因此需要Tn 7 _gt1，Tn 7 _gt2和Tn 7 _gt3通过平末端克隆构建，因此质粒之间的插入方向可能不同（Tn 7 _gt2和Tn 7 _gt3与质粒中插入片段的侧翼序列退火骨干）。有关示例，请参见图6.

图6.确定Tn 7 插入的菌落PCR。使用引物FWD_Tn 5的PCR结果 / 7 _gt和REV_Tn 5 / 7 _gt用于扩增Tn 7 -delivered insert（MRE） -Tn 7 插入），使用引物Tn 7 _gt1，Tn 7 _gt2和Tn 7 的PCR结果_gt3用于扩增质粒pMRE-Tn 7 骨架（MRE-Tn 7 骨架）的片段。 M：分子标记。样本1： P. eucalypti 299R :: MRE-Tn 7 -145;第2道： E.大肠杆菌（pMRE-Tn 7 -145）;泳道3：pMRE-Tn 7 -145; C-：水控制。

笔记

根据受体菌株的不同，在琼脂平板上加入100μl滴点1M CaCl 2 用于将细菌混合物滴到CaCl 2 上可能会提高结合效率（ Wang和Jin，2014; McCully et al。，2018）。
通过以不同比例混合供体和受体菌株可以优化缀合效率（例如，通过分别使用1：3,1：1和3：1比例的供体和受体菌株进行三次缀合）。

食谱

Lysogeny肉汤（LB）
将25g溶原肉汤培养基加入1升软化水中高压灭菌器
Lysogeny肉汤琼脂（LB琼脂）
加入25克溶原肉汤培养基和15克琼脂。 1至1升软化水
高压灭菌器
最小的媒介（Attwood和Harder，1972）
1. 准备以下库存解决方案：
2. 为了制备1L补充有0.5％琥珀酸盐作为唯一碳源的基本培养基琼脂，将100ml 10x铵溶液与100ml 10x磷酸盐缓冲溶液，100ml 10x硫酸盐溶液，1ml 1,000x微量元素溶液和25ml混合。将20％琥珀酸盐溶液加入500ml熔融的3％琼脂中。加入无菌软化水，最终体积为1升
1x磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）
溶解8g NaCl，0.24g KCl，1.42g Na 2 HPO 4 ，0.24g KH 2 PO 4 在1升软化水和高压灭菌器中或者，可以将缓冲液制备成10倍浓缩的原液，在使用前用无菌水稀释至1倍浓度
抗生素储备液和工作浓度
1. 氨苄青霉素原液
  将氨苄青霉素溶于水中至浓度为100 mg ml -1 并使用0.22μm过滤器过滤灭菌
2. 庆大霉素原液解决方案
  将庆大霉素溶于水中至浓度为15 mg ml -1 并使用0.22μm过滤器过滤灭菌
3. 卡那霉素原液
  将卡那霉素溶于水中至浓度为50 mg ml -1 并使用0.22μm过滤器过滤灭菌
4. 氯霉素原液溶液
  将氯霉素溶解在乙醇中至浓度为15mg / ml -1
5. 四环素库存解决方案
  将四环素溶解在乙醇中至浓度为5mg L-1
注意：将所有抗生素储备溶液以1.5 ml等分试样储存在-20°C。
TAE缓冲液（40mM Tris，20mM乙酸，1mM EDTA）
1. 0.5 M EDTA原液
  将93.05g Na 2 EDTA·2H 2 O溶于400ml软化水中，用NaOH调节pH至8.0。补充最终体积为500毫升的解决方案
  注意：当pH接近8时，EDTA将开始溶解，使用10 M NaOH调节pH值。
2. 50x TAE库存解决方案
  将242克Tris碱溶于750毫升软化水中
  加入57.1毫升100％冰醋酸和100毫升0.5M EDTA溶液
  用去离子水将体积调节到1L
  该溶液可以在室温下储存
3. 1x TAE工作解决方案
  在980ml软化水中稀释20ml 50x TAE储备溶液

致谢

这里介绍的协议改编自两项先前发表的研究（Remus-Emsermann et al。，2016a; Schlechter et al。，2018），并受McKenzie的一项研究的影响。和克雷格（2006年）。作者感谢MichałBernach，Hyunwoo Jun和Schlechter 等人的其他作者，2018在原始研究期间的帮助。
＆NBSP;这项工作的资金来自坎特伯雷大学生物分子相互作用中心和MR-E的MR-E和新西兰皇家学会马斯登快速启动资助（UOC1704）。 RS获得NZIDRS博士奖学金的支持。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

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