材料和试剂

12 mm x 75 mm玻璃试管（VWR，目录号：212-0013）（塑料管也可以使用）
乳胶手套或丁腈手套
5毫升移液器吸头（Kinesis，目录号：U696256）
铝箔
单刃钢制剃须刀片（Carl Roth，目录号：CK07.1）
9.5厘米圆形植物盆，体积为0.32升（Gartnereinkauf，目录号：410103）（类似大小或类似的盆也有效）
6.5厘米圆形植物盆，体积0.1升（Gartnereinkauf，目录号：410066）
具有透明盖子（60 cm x 40 cm x 6 cm）的植物幼苗繁殖盘（meyer-shop，目录号：749114）（其他类似的托盘也可以）
5毫升移液器（Kinesis，目录号：2400631）
番茄种子
盆栽土壤（Pikiererde和Topferde从德国Einheitserde订购;混合1：1）（其他盆栽土壤，中等至高营养，质地细腻也有效）
Systemin肽（肽序列：AVQS KPPC KRDP PKMQ TD）（GenScript，目录号：88910480001）
无菌水
70％乙醇
液氮

设备

带锯齿钳口的5.5英寸止血钳（默克，产品目录号：Z168858-1EA）
长镊子（Carl Roth，目录号：PT95.1）
剪刀
试管塑料架
-80°C冰箱
-20°C冰柜

程序

番茄幼苗的肽喂养试验
1. 将番茄种子播种在一个直径9.5厘米的盆中，盆中装满盆栽土。用~5毫米土壤覆盖种子。将锅放入装有~1厘米水的托盘中。用透明塑料盖盖住托盘。将托盘放入温室中，条件如下：14小时光照/ 10小时黑暗;每天25°C / 19°C;相对湿度30％-40％; 12.38 klx。种子萌发后1天取下盖子。
  注意：用一层薄薄的土壤覆盖种子将有助于在发芽期间从子叶上去除种皮。每次处理需要12个番茄幼苗。为了保证足够的幼苗，建议播种50％以上的种子。
2. 播种后大约10天，当第一片真叶出现时，将相似大小的单个番茄幼苗分成6.5厘米直径的盆（图1）。在移植过程中尽可能多地在土壤上留下下胚轴。将锅放入托盘中，在托盘上加水，从底部彻底浇水。用清盖盖住托盘。
  注意：长的下胚轴将减少番茄幼苗在饲喂试验过程中与肽溶液/水失去接触的可能性。
  
  图1.新鲜移植的番茄幼苗
  
  <跨度>
3. 两天后取下盖子。通过在托盘上添加水，每天从盆底浇水。种植番茄幼苗直至第三片真叶出现（播种后约18天）。
  注：不同番茄品种的幼苗生长速度不同。参考幼苗的大小而不是生长时间。
4. 在喂食测定前的早晨，从底部彻底浇水番茄幼苗。在这个时间点之后不要浇水。
5. 将肽粉末中的系统溶解在无菌水中以制备10mM原液。在喂食测定之前立即用无菌水将肽储备溶液稀释至100nM。为每个幼苗准备4毫升肽溶液，另外50毫升作为备用。将剩余的肽原液储存在-20°C。
6. 将4ml肽溶液（或无菌水作为对照）加入玻璃试管中。
7. 用剃刀刀片在其基部（土壤上方约3mm）切出相似大小的番茄幼苗，并立即将幼苗放入含有肽溶液的玻璃试管中（每管1苗）（图2）。在处理过程中戴上手套，切换溶液时务必更换手套。
  注意：处理大量样品时，估计每组样品处理和收获所需的时间。在两组之间留出10分钟的缓冲时间。避免交叉污染和幼苗伤害。
  
  图2.用肽溶液喂养的番茄幼苗。红色圆圈表示要收获的叶子。
8. 在温室中通过蒸腾流将肽（或水作为对照）饲喂幼苗1小时。同时，准备充满无菌水的新玻璃管。
9. 将幼苗转移到新的玻璃管中。通过在不同处理组之间切换手套，避免肽溶液的交叉污染。
10. 将切下的幼苗在温室中孵育8小时。每2小时检查一次液位。一旦它们半空，用无菌水重新加注管。
  注意：由于溶液吸收的差异，一些植物最初可能略微枯萎。它们将在进一步孵化后恢复。
11. 用剪刀从第一对真叶收获1片叶子。对于每次处理，池中的叶子来自3株植物作为1个生物样品，并准备4个生物样品。
  注意：通过蒸腾流吸收的肽量可能在不同植物之间差异很大。因此，重要的是使用合并的样品作为生物复制品以使变异最小化。
12. 用铝箔快速包裹叶子样品。用镊子立即在液氮中冷冻样品。将样品保存在-80°C下进行进一步分析。
番茄幼苗的伤口试验
1. 以与步骤A1-A3中所述相同的方式制备~18天龄的番茄幼苗。
2. 在伤口试验前的晚上，从盆底彻底浇水。
  注意：在进行伤口试验之前，在土壤中有足够的水是很重要的。在测定过程中不应给植物浇水。
3. 第二天早上，从第一对真叶中夹住一片叶子的小叶，在中肋的两侧夹一个止血钳，一次在1/4的小叶上，另一次在~3 / 4部分。提供足够的压力来缠绕叶子表面，但不要太难以穿透叶子。在不同处理组之间用70％乙醇清洁止血钳的下颚。
  注意：伤口期间不要破坏中肋;否则小叶会在试验结束时变干。
4. 第一次受伤后3小时，再次以~1 / 2的比例捏同样的传单（图3）。
  
  图3.番茄幼苗，叶子受到止血钳的伤害。红色箭头表示受伤叶片的小叶，黑色箭头表示系统叶片（来自同一植物的未受伤叶片）的小叶。
5. 第一次受伤后12小时，用一把剪刀收获叶子。池3叶（每株植物1片叶）来自与生物样品相同的番茄品系。从处理过的植物收集未受伤的叶子作为全身叶子。收集未处理植物的叶子作为对照叶片。
  注意：不同番茄幼苗的PIN1转录水平在诱导后可能会有很大差异。为了减少变异，将几种植物作为生物样品汇集是很重要的。每次处理准备4个生物样本。
6. 用铝箔快速包裹叶子样品，立即用镊子将样品冷冻在液氮中。将样品储存在-80°C冰箱中进行进一步分析。

致谢

该协议部分改编自Pearce 等人（1993）。这项工作由DFG-CRC1101-D05拨款资助。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

Pearce，G.，Johnson，S。和Ryan，C.A。（1993）。缺失和取代的系统蛋白的结构活性，植物防御基因的18个氨基酸多肽诱导物。 J Biol Chem 268（1）：212-216。
Pearce，G.，Strydom，D.，Johnson，S。和Ryan，C.A。（1991）。番茄叶中的多肽诱导伤口诱导蛋白酶抑制蛋白。 Science 253（5022）：895-897。
Ryan，C。A.和Pearce，G。（2003）。系统蛋白：一种功能定义的肽信号家族，可调节茄科植物中的防御基因。 Proc Natl Acad Sci USA 100 Suppl 2：14577-14580。
Tavormina，P.，De Coninck，B.，Nikonorova，N.，De Smet，I。和Cammue，B.P。（2015）。植物肽组：结构特征和生物功能的扩展曲目。 Plant Cell 27（8）：2095-2118。
Wang，L.，Einig，E.，Almeida-Trapp，M.，Albert，M.，Fliegmann，J.，Mithofer，A.，Kalbacher，H。和Felix，G。（2018）。系统素受体SYR1增强番茄对食草昆虫的抵抗力。 Nat植物 4（3）：152-156。