材料和试剂

对于细胞培养
1. 6孔板（SARSTEDT，目录号：83.3920）
2. 35毫米碟（SARSTEDT，目录号：83.3900）
3. 60毫米碟（SARSTEDT，目录号：83.3901.300）
4. 100毫米盘（SARSTEDT，目录号：83.3902.300）
5. 培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
6. 盖弗斯（Fisher，目录号：12-545-80）
7. 液氮（PRAXAIR，目录号：7727-37-9）
8. iPSC，来源于体细胞或从冷冻等分试样中解冻
9. TeSR TM -E8 TM Media（Stem Cell Technologies，目录号：05990）
10. BrainPhys TM 神经元培养基（干细胞技术，目录号：05790）
11. Matrigel ®（康宁，目录号：354277）＆nbsp;
12. KnockOut TM DMEM / F-12（Thermo Fisher，目录号：12660012）
13. DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：C6164）
14. StemPro NSC SFM（Thermo Fisher，目录号：A1050901）
15. SM1神经元补充剂（干细胞技术，目录号：05711）
16. N2 Supplement-A（干细胞技术，目录号：07152）
17. BSA（Gibco，目录号：16140071）
18. 非必需氨基酸（NEAA）（Gibco，目录号：11140050）
19. SB431542（干细胞技术，目录号：SB431542）
20. Noggin（Gibco，目录号：PHC1506）
21. 层粘连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：L2020）
22. Gentle Cell Dissociation Reagent（干细胞技术，目录号：07174）
23. 表皮生长因子（EGF）（西格玛，目录号：E9644）
24. 成纤维细胞生长因子（FGF）（西格玛，目录号：F0291）
25. 脑源性神经营养因子（GenScript，目录号：Z03208-25）
26. 胶质衍生的神经营养因子（GenScript，目录号：Z02927-50）
27. Accutase（Sigma-Aldrich，目录号：SCR005）
28. 不含CaCl 2 和MgCl 2 的DPBS（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
29. 神经诱导培养基1（见食谱）
30. 神经诱导培养基2（见食谱）
31. 神经祖细胞培养基（见食谱）
32. 神经元媒体（见食谱）
33. 用Matrigel ®培养皿涂层（见食谱）
用于免疫细胞化学（ICC）
1. 玻璃盖玻片（Fisher，目录号：12-545-81）
2. 显微镜载玻片（Fisher，目录号：12-552-3）
3. 移液器吸头，1毫升（SARSTEDT，70.1186）＆nbsp;
4. 移液器吸头，200μl（SARSTEDT，70.1186）
5. 移液器吸头，20μl（SARSTEDT，70.1186）
6. 15毫升锥形管（SARSTEDT，62.554.002）
7. 多聚甲醛（PFA）（西格玛奥德里奇，目录号：252549）
8. BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
9. Triton X-100
10. DAPI（Thermo Fisher，目录号：62248）
11. Vectashield ®（Vector Labs，目录号：H-1000）
12. 指甲油（Sally Hansen Insta-Dri快干透明指甲油）
13. 抗体
  用于iPSC的抗体：
  1. TRA-1-60（胚胎干细胞标记板，Abcam，目录号：ab109884）
  2. SSEA（胚胎干细胞标记板，Abcam，目录号：ab109884）
  3. Nanog（胚胎干细胞标记板，Abcam，目录号：ab109884）
  4. OCT4（Stemcell Technologies，目录号：60093）
  5. PAX6（Stemcell Technologies，目录号：60094）
  NPC抗体：
  1. SOX1（Stemcell Technologies，目录号：60095）
  2. Nanog（胚胎干细胞标记板，Abcam，目录号：ab109884）
  3. Nestin（Stemcell Technologies，目录号：60091）
  4. PAX6（Stemcell Technologies，目录号：60094）
  神经元抗体：
  1. Tuj1（艾博抗（Abcam），目录号：ab14545）
  2. S100B（Abcam，目录号：ab52642）
  3. VGLUT1（艾博抗（Abcam），目录号：ab77822）
  4. GABA（Abcam，目录号：ab86186）
  5. GFAP（Abcam，目录号：ab7260）
  二抗：
  1. ALEXA 488抗小鼠（Invitrogen，目录号：A-11008）
  2. ALEXA 555抗兔（Invitrogen，目录号：A-21422）
14. 用聚鸟氨酸和层粘连蛋白涂覆玻璃盖玻片（见食谱）
对于电生理学

电阻为3-6MΩ的硼硅酸盐移液器（World Precision Instruments，目录号：1B150-4）
细胞过滤器（40μm）（Sigma，目录号：CLS431750）
河豚毒素（TTX）（Alomone labs，目录号：T-550）
没有酚红的BrainPhys TM （干细胞技术，目录号：05791）
HEPES（西格玛奥德里奇，目录号：H3375）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：793590）
葡萄糖酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：G4500）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：324626）
Mg-ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A9187）
磷酸肌酸（Sigma-Aldrich，目录号：CRPHO-RO）
三磷酸鸟苷（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
NMDA（Alomone labs，目录号：N-170）
氯化镁六水合物（Sigma，目录号：M2393）
内部移液器解决方案（见食谱）

设备

移液器（Fisher，目录号：4680100）
移液器拉拔器（Sutter Instrument，型号：P-1000）
渗透压计（Advanced Instruments，型号：3320）
珠浴（Lab Armor，型号：M706）
荧光显微镜（奥林巴斯，型号：1X73）
带六通道阀门控制器的录音室（华纳仪器）
自动温度控制器（华纳仪器，型号：TC-324C）
微操纵器（Sutter Instrument，型号：MP-225）
微电极放大器Multiclamp 770B（Molecular Devices）
采集系统Axon digidata 1550A（Molecular Devices）
生物安全柜2级（Nuaire，型号：NU440400）
孵化器（Thermo Fisher，目录号：51030287）
离心机（Allegra，型号：X-12）

软件

Clampex 10.5（Molecular Devices， www.moleculardevices.com ）
GraphPad Prism 7（GraphPad， www.graphpad.com ）
Excel 2016（Microsoft， https://products.office.com/en-ca/excel）

程序

从iPSC到Forebrain NSCs的分化（神经诱导）
注意：*假设将高质量的iPSC（见图1）涂在涂有基质胶 ® （有关详细信息，请参阅食谱和表2）。

图1.高质量iPSC培养物的ICC染色样本。为了有效地进行分化，确保您开始使用高质量的iPSC培养物进行分化。当使用ICC评估时，IPSCs应均匀表达多能性标志物SSEA，OCT4，TRA-1-60和NANOG（A）。还可以使用qPCR测定法评估额外的多能性标志物DNMT3b，EST2和ZFP42（B）。 IPSCs应该没有核型异常（C），具有分化成所有三个种系的能力并表达每个谱系的特征标记（D），并且对支原体污染测试为阴性（E）。比例尺代表100微米。
1. 在II级生物安全柜中工作，使用适当尺寸的移液器在60mm培养皿中的E8培养基中培养iPSC。如果从冷冻的iPSC等分试样开始，我们建议至少接种300,000个细胞。这被认为是iPSC培养的第0天。
2. 在iPSC培养的第1天（15％-25％汇合），吸出用过的培养基以除去未附着的细胞，并检查菌落的大小。如果菌落直径约为100-200μm，则它们是适合开始分化的大小。加入3ml完全神经诱导培养基1，用5ml移液管在珠子浴中预热至每个平板。将平板放回保持在37℃，5％CO 2 和大气（~20％）氧气的培养箱中。如果平板不含足够大小的菌落，则每天加入3毫升E8培养基并检查，直到菌落达到合适的大小。
3. 在第2天（切换至神经诱导培养基后约48小时），通过从每个孔中吸出旧培养基来更换培养基。向每个板中加入3ml预热的完全神经诱导培养基1。
4. 在神经诱导的第4天，细胞将达到融合。如有必要，请标记任何具有非神经分化的菌落。用200μl移液管尖端去除这些不需要的菌落。从每个孔中吸出用过的培养基。在每个平板上加入3毫升预热的完全神经诱导培养基1。
  5.在神经诱导的第6天，细胞应该接近最大汇合。去除任何可以观察到的非神经分化细胞，并在每个平板中加入3ml完全神经诱导培养基。
5. 在神经诱导的第7天，应将培养基转换为神经诱导培养基2.向每个平板中加入3ml完全神经诱导培养基2。介质应每天更换5天。例如形态学，见图2.
注意：由于第4天以后培养物中的细胞密度很高，神经诱导培养基的体积加倍对于细胞营养非常关键。此外，在神经诱导后第4天至第7天应观察到最小的细胞死亡。如果在神经诱导的第4天至第7天期间细胞的颜色变为带有许多漂浮细胞的黄色，则表明iPSC的起始密度太高。在这种情况下，每天更换神经诱导培养基，去除一些菌落，每孔/板的体积加倍。理想情况下，使用这些变量以确保介质不会继续变黄。

图2.分化为前脑NPC的iPSC的形态学。 A.第0天：在加入神经诱导培养基之前立即显示适当大小的单个iPSC集落.B。第2天：iPSC集落，已经用神经诱导培养基1处理2天，开始改变细胞形态，并且一些细胞延伸过程。 C.第5天：随着外细胞的一些分化，集落的扩增增加。 D.第12天：菌落中玫瑰花结的外观变得清晰可见。 NSCs在这些结构的中间以高汇合存在。此时，将菌落分离并在D13的非粘附平板上重新铺板两天。 E.在粘附板上铺板后立即进行D13。该图像显示浮动莲座丛，其将继续增殖并在浮动块中分化。化学释放后，非玫瑰花结细胞在D12处保留在培养皿上，或者作为单细胞漂浮在（E）中所示的非粘附平板上。 F.在D15处，莲座丛的尺寸扩大并移动到粘附板上。这里的细胞聚集体是三维的，但是附着在板上。注意此时簇的纯度（F）。比例尺代表130微米。

收获和扩大NPC
注意：在神经诱导的第12天，NPC已准备好收获和扩大。
1. 从每个板上吸出用过的神经诱导培养基进行传代。
2. 轻轻地将不含CaCl 2 2 和MgCl 2 的DPBS加入每个板中两次以冲洗细胞。
3. 向每个板中加入1.5ml预热的温和细胞解离试剂，并在37℃下孵育5分钟，直到大多数细胞从培养皿表面脱离。轻轻敲打板以移除仍附着的细胞。
4. 使用移液管轻轻冲洗板表面，使用板中已有的Gentle Cell Dissociation Reagent，以分离剩余的细胞。
5. 使用移液管将细胞悬浮液转移至15ml锥形管中。
6. 向每个板中加入1ml DPBS以收集残留的细胞并将细胞悬浮液转移到锥形管中。
7. 用5毫升或10毫升移液管轻轻吸取细胞悬液3次，以打碎细胞团块。
8. 将细胞在300 x g 下离心5分钟。
9. 吸出上清液并将细胞重新悬浮在预热的神经祖细胞（NPC）培养基中（即，对于来自每个平板的所有细胞，10ml）。
10. 将悬浮在NPC培养基中的细胞铺板到10cm培养皿上。
11. 在CO 2 培养箱中培养细胞2天。在此期间，NPC将在NPC媒体中浮动时形成聚合。
12. 一旦聚集体达到约70-200μm的合适尺寸，制备涂有5ml Matrigel 的10cm组织培养皿至少1小时。如果形成的聚集体很少，则在60mm培养皿中培养细胞。
13. 使用5毫升或10毫升移液器，将NPC培养基吸收并通过细胞过滤器以收集NPC聚集体。＆nbsp;
14. 翻转过滤器并通过过滤器通过10ml新鲜预热的NPC培养基，其中细胞聚集体被结合，使得它们被转移到涂有Matrigel 涂层的10cm板上。
15. 在CO 2 培养箱中培养细胞以使NPC聚集体附着到包被的培养皿上并迁移和增殖。
16. 每2-3天更换一次培养基，直至细胞达到融合，并准备进行传代或冷冻保存。使用温热的accutase在37°C下解离5分钟。
17. 为了评估NPC培养物的纯度，使用ICC修复细胞并检查NPC标记物（参见图3）。
18. 为冷冻保存NPC，冷冻80/20混合的FBS / DMSO。储存在-80°C，可在几个月内使用，或在液氮中储存，以便长期储存。
  
  图3.高质量NPC培养物的ICC染色样本为了有效地进行分化，确保iPSC培养物均匀表达Nestin，SOX1和PAX6。 NPC培养物不应表达多能标记物OCT4（DAPI在PAX6和OCT4的合并中以蓝色显示;所有细胞均表达PAX6，即，100％纯度的培养物）。比例尺代表100微米。
前脑NPC分化为神经元
1. 将板状NPC置于涂有Matrigel ®的组织培养皿上。等到细胞在开始分化之前达到70％-95％汇合。
2. 一旦NPC达到所需的汇合度，吸出培养基并用等量的Neuronal Media替换。
3. 每隔2-3天，将一半的培养基吸入培养皿中，换上新鲜的Neuronal培养基。
  注意：由于某些介质会因蒸发而丢失，因此您可能需要添加比从印版中移除更多的介质，以便随着时间的推移保持介质体积稳定。
4. 继续改变培养基，直到神经元达到理想的发育阶段。例如，发展前脑神经元的形态，参见图4.例如前脑神经元的ICC表征，参见图5.
  注意：
  1. 在这个开发阶段，您的生产线的纯度将很容易被发现。含有高百分比NPC的细胞系将迅速极化并形成神经元投射（通常在第2-5天左右），而含有高百分比的非NPC细胞（星形胶质细胞，神经嵴细胞等）的细胞系则不会。 / EM>
  2. 特定平板中的神经元需要多长时间才能达到某一发育阶段，这取决于品系，克隆，传代数等。但是，我们发现优质培养物中的神经元始终通过以下方式获得以下标志：以下几天分化。
  第5天=细胞是有丝分裂后的第15天=细胞具有明显极化的轴突和树突，并具有明显可检测的电生理特性，如动作电位
  
  图4.前脑NPC分化为神经元的示例形态。前脑NPC培养物分化为神经元的形态学。在D0（A），D5（B），D15（C），D30（D）拍摄的图像。比例尺代表130微米。
5. 要评估您的神经元培养物的纯度，修复细胞并使用ICC检查前脑标记物。为了评估产生的神经元的质量，确保细胞显示出适当的电生理特性（参见数据分析）。
使用免疫细胞化学评估培养物纯度
注意：假设细胞涂在涂有聚鸟氨酸和层粘连蛋白的玻璃盖玻片上，将描述以下步骤（更多细节见食谱）。
1. 将样品固定在用PBS稀释的4％多聚甲醛（PFA）中。在室温下孵育15分钟。
2. 在室温下用PBS（3×15分钟）洗涤样品。
3. 通过在室温下在PBS + 0.1％Triton X-100中孵育10分钟来使样品透化。＆nbsp;
4. 吸出透化缓冲液并用PBS中稀释的5％BSA代替以阻断样品。在室温下孵育60分钟。＆nbsp;
5. 通过在阻断5％BSA-PBS中稀释来制备初级抗体的工作原种。有关不同细胞类型的推荐工作稀释液和抗体，请参见表1。在一抗溶液中涂上盖玻片，在2-8°C下孵育过夜。
  
  表1.免疫细胞化学中使用的抗体
6. 在室温下用PBS（3×15分钟）洗涤样品。
7. 吸出PBS并加入用5％BSA-PBS稀释的二抗。推荐的二抗和稀释度见表1。在室温下孵育盖玻片，远离光照一小时。
8. 在室温下用PBS（3×15分钟）洗涤样品。
9. 如果需要，加入用PBS稀释的DAPI，在室温下孵育5分钟。
10. 将一滴Vectashield ®添加到载玻片上。小心地使用针头和镊子将盖玻片（细胞侧朝下）转移到载玻片上。密封使用指甲油。
  
  图5.高质量前脑神经元的ICC染色样本。 NPC分化30天（D30）后前脑神经元培养的代表性ICC，证明了谷氨酸能，GABA能和星形胶质细胞标志物的相对丰度。人口。这些培养物约为65％谷氨酸能，30％GABA能，和5％-10％星形胶质细胞。比例尺代表50微米。
使用电生理学评估神经元质量
1. 从玻璃毛细管中拉出移液器。当用内部移液器溶液填充时，它们的电阻应在3到6MΩ的范围内。
2. 将含有分化的人类iPSC衍生神经元的个别盖玻片转移到加热的记录室中，用BrainPhys神经元培养基连续灌注（1 ml / min），不用苯酚鼓泡，用CO 2 （5％）和O的混合物 2 （95％）并使用自动温度控制器维持在35°C。
3. 选择要录制的单元格。
4. 用内部移液器溶液填充移液管并将其放入电极支架中。放下移液器，将其放入外部溶液中。在补偿偏移后，在远程微操纵器的帮助下将移液管接近所选择的细胞，以形成高阻细胞附着的密封。＆nbsp;
5. 一旦形成密封并建立整个电池配置，将串联电阻补偿在80％-90％。＆nbsp;
6. 在开始录制之前等待5到10分钟。这允许细胞内容物与内部移液管溶液平衡。
7. 对于采集，将滤波器设置为2 kHz，采样率设置为20 kHz。
8. 一旦建立了全细胞记录，就可以进行基本神经元特性的记录，包括rheobase，静息膜电位，动作电位参数和自发突触后电流。通过移液器添加NMDA。评估神经元应该在电压钳中保持神经元在-70 mV，除非检查静息膜电位和rheobase的变化，这应该在电流钳中进行。 Clampex和GraphPad Prism 7是推荐用于显示数据的软件。例如从皮质神经元获得的电生理记录，参见图6.
  
  图6.高质量前脑神经元的电生理特性。 A.全细胞构型中单个神经元记录的玻璃微电极的差分图像对比度。比例尺代表20微米。 B.超极化脉冲，显示去极化下垂，随后是多个反弹动作电位。 C.左：电压钳记录的代表性迹线显示向内Na + 电流;右图：在施用1μM的河豚毒素（TTX）后，钠电流痕迹消失。 D.具有静息膜电位-40 mV的自发活跃神经元的代表性电流钳记录。 E.代表性记录显示在当前斜坡方案期间由前脑神经元发射的动作电位。 F.来自具有自发突触输入的神经元的代表性电压钳记录。所有电生理数据均来自D14神经元。

数据分析

应处理电生理数据，电流应以2 kHz过滤，并以20 kHz数字化。应报告值，校正计算出的10 mV液体结电势的电压和电流钳记录中的标称膜电位。

食谱

媒体
注意：所有培养基均为50 ml的配方，因为可以在一个50 ml的管中准备这个体积，适合在珠子或水浴中加热。
1. 神经诱导培养基1
2. 神经诱导培养基2
  
  注意：完整的神经诱导培养基1和2可以在2-8°C的黑暗中储存长达2周。在使用前，将神经诱导培养基在37°C水浴中加热5-10分钟。不要将神经诱导培养基在37°C水浴中加热超过10分钟，因为这可能会导致培养基降解。
3. 神经祖先媒体
4. 神经元媒体
缓冲和解决方案
1. 内部移液器解决方案
  5 mM HEPES
  2 mM KCl
  136 mM葡萄糖酸钾
  5 mM EGTA
  5mM ATP-Mg 2 +
  8 mM肌酸磷酸盐
  0.35 mM鸟苷三磷酸
  用KOH将pH调节至7.2，并且如果需要，用蒸馏水或浓缩的葡萄糖酸钾调节重量摩尔渗透压浓度至295至298mOsm之间。
  注意：内部和外部溶液的渗透压差异应接近5％。
2. 用Matrigel ®培养皿涂层
  1. 从-80°C解冻冷冻的Matrigel ®（250μl）等分试样，将其置于4°C冰箱中1小时
  2. 要制作工作溶液，将解冻的Matrigel ®稀释在25 ml冷PBS或培养基中
    注意：在DMEM或其他具有强烈着色的介质中稀释基质胶 ® 可以更容易地确定整个培养皿是均匀的覆盖。
  3. 用适量的基质溶液快速覆盖每个培养皿的整个表面（表2）
  4. 将培养皿在37°C，5％CO 2 培养箱中孵育至少1 h
  5. 培养皿现在可以使用了。在使用前，从培养皿中吸出稀释的Matrigel ®溶液。细胞可直接接种到Matrigel ®涂层培养皿上，无需冲洗。
    注意：涂层培养皿也可以在2-8°C下储存长达一周。储存时，用Parafilm ® 实验室薄膜密封培养皿以防止干燥。使用前，将涂在2~8°C的培养皿在室温下预热30分钟。
    
    表2.用于涂覆不同培养皿的基质胶所需体积 ® 基质溶液
3. 用聚鸟氨酸和层粘连蛋白涂覆玻璃盖玻片
  1. 将玻璃盖玻片放入培养皿或悬浮板中
  2. 通过将板暴露于UV辐射20分钟来消毒盖玻片
  3. 用PBS中的100μl50μg/ ml聚鸟氨酸涂覆盖玻片。等两个小时
  4. 吸气解决方案。用PBS洗涤一次，然后用PBS稀释的10μg/ ml层粘连蛋白包被盖玻片
  5. 在37°C孵育2小时
  6. 吸出溶液，在10％FBS DMEM中涂覆盖玻片
  7. 这些板现在可以使用了。为获得最佳效果，请在准备24小时内使用。在铺板细胞之前，用PBS洗涤板一次，因为FBS可能影响分化

致谢

这项工作得到了加拿大研究教席计划和加拿大卫生研究院对CE的资助。斯科特•贝尔（Scott Bell）由魁北克省资助会（FRQS）资助，Nuwan Hettige由FRQS资助，Malvin Jefri由马来西亚政府资助，Lilit Antonyan由CONACYT（墨西哥）资助。该协议改编自先前的工作（Bell et al。，2017和2018）。

利益争夺

Carl Ernst是ManuStem.com的总裁。

伦理

所有工作均经道格拉斯医院研究伦理委员会批准。

参考

Auld，D。S.，Kornecook，T。J.，Bastianetto，S。和Quirion，R。（2002）。阿尔茨海默病和基底前脑胆碱能系统：与β-淀粉样肽的关系，认知和治疗策略。 Prog Neurobiol 68（3）：209-245。
Baxter，M。G.和Chiba，A.A。（1999）。基底前脑的认知功能。 Curr Opin Neurobiol 9（2）：178-183。
Bell，S.，Maussion，G.，Jefri，M.，Peng，H.，Theroux，JF，Silveira，H.，Soubannier，V.，Wu，H.，Hu，P.，Galat，E.，Torres -Platas，SG，Boudreau-Pinsonneault，C.，O'Leary，LA，Galat，V.，Turecki，G.，Durcan，TM，Fon，EA，Mechawar，N。和Ernst，C。（2018）。 GRIN2B的破坏会损害人类神经元的分化。干细胞报告 11（1）：183-196。
Bell，S.，Peng，H.，Crapper，L.，Kolobova，I.，Maussion，G.，Vasuta，C.，Yerko，V.，Wong，T.P。和Ernst，C。（2017）。通过同步CRISPR / Cas9基因编辑对罕见神经发育障碍进行建模的快速渠道。干细胞Transl Med 6（3）：886-896。
Chandrasekaran，A.，Avci，HX，Ochalek，A.，Rosingh，LN，Molnar，K.，Laszlo，L.，Bellak，T.，Teglasi，A.，Pesti，K.，Mike，A.，Phanthong， P.，Biro，O.，Hall，V.，Kitiyanant，N.，Krause，KH，Kobolak，J。和Dinnyes，A。（2017）。用于从人类诱导的多能干细胞产生神经祖细胞的2D和3D神经诱导方法的比较。干细胞研究 25：139-151。
Donovan，A。P.和Basson，M。A.（2017）。自闭症的神经解剖学 - 从发展的角度来看。 J Anat 230（1）：4-15。
Heath，R。G.（1976）。癫痫中的脑功能：中脑，延髓和小脑与前端前脑的相互作用。 J Neurol Neurosurg Psychiatry 39（11）：1037-1051。
Marchetto，M。C.，Brennand，K。J.，Boyer，L。F.和Gage，F。H.（2011）。诱导多能干细胞（iPSCs）和神经疾病模型：进步和承诺。 Hum Mol Genet 20（R2）：R109-115。
McColgan，P。和Tabrizi，S.J。（2018）。亨廷顿病：临床综述。 Eur J Neurol 25（1）：24-34。
Morgane，P。J.，Galler，J。R.和Mokler，D。J.（2005）。对边缘前脑/边缘中脑的系统和网络进行审查。 Prog Neurobiol 75（2）：143-160。
Pasca，SP，Portmann，T.，Voineagu，I.，Yazawa，M.，Shcheglovitov，A.，Pasca，AM，Cord，B.，Palmer，TD，Chikahisa，S.，Nishino，S.，Bernstein，JA ，Hallmayer，J.，Geschwind，DH和Dolmetsch，RE（2011）。使用iPSC衍生的神经元揭示与蒂莫西综合征相关的细胞表型。 Nat https://os.bio-protocol.org/mgn/zhuanjialist.aspxMed 17：1657-1662。
Schwartz，J。R.和Roth，T。（2008）。睡眠和觉醒的神经生理学：基础科学和临床意义。 Curr Neuropharmacol 6（4）：367-378。
Shi，Y.，Inoue，H.，Wu，J。C. and Yamanaka，S。（2017）。诱导多能干细胞技术：十年的进步。 Nat Rev Drug Discov 16（2）：115-130。
Shi，Y.，Kirwan，P。和Livesey，F。J.（2012）。人类多能干细胞定向分化为大脑皮质神经元和神经网络。 Nat Protoc 7（10）：1836-1846。
Srikanth，P。和Young-Pearse，T。L.（2014）。大脑上的干细胞：使用人类诱导的多能干细胞模拟神经发育和神经退行性疾病。 J Neurogenet 28（1-2）：5-29。
Venere，M.，Han，Y.G.，Bell，R.，Song，J。S.，Alvarez-Buylla，A。和Blelloch，R。（2012）。 Sox1标志着海马体内激活的神经干/祖细胞。发展 139（21）：3938-3949。
Yuan，F.，Fang，KH，Cao，SY，Qu，ZY，Li，Q.，Krencik，R.，Xu，M.，Bhattacharyya，A.，Su，YW，Zhu，DY和Liu，Y。（ 2015年）。在高度确定的条件下从人多能干细胞中高效生成区域特异性前脑神经元。 Sci Rep 5：18550。
Zhang，J。和Jiao，J。（2015）。胚胎和成人神经干细胞和神经发生的分子生物标志物。 Biomed Res Int 2015：727542。
Zhang，X.，Huang，CT，Chen，J.，Pankratz，MT，Xi，J.，Li，J.，Yang，Y.，LaVaute，TM，Li，X.-J.，Ayala，M。， Bondarenko，GI，Du，ZW，Jin，Y.，Golos，TG和Zhang，SC（2010）。 Pax6是人类神经外胚层细胞命运决定因素。细胞干细胞 7（1）：90-100。