材料和试剂

Axygen ® MicroVolume长度过滤移液器吸头（Axygen，目录号：TXLF10）
Axygen ® Universal Fit100μl过滤移液器吸头（Axygen，目录号：TF100RS）
Axygen ® Universal Fit200μl过滤移液器吸头（Axygen，目录号：TF200RS）
Axygen ® Universal Fit1,000μl过滤吸管吸头（Axygen，目录号：TF1000LRS）
Axygen 1.5 ml Snaplock Microtubes（Axygen，目录号：MCT150CS）
10 cm细胞培养皿（Celltreat，目录号：229621）
24孔板（Celltreat，目录号：229123）
MicroAmp快速光学96孔反应板（Thermo Fisher，目录号：4346907）
MicroAmp光学胶膜（Thermo Fisher，目录号：4311971）
0.45μm孔径过滤器（Thermo Fisher，目录号：EMD Millipore TM SLHV033RS）
Ach2细胞（NIH AIDS Reagent Program，目录号：349）
HEK-293细胞（NIH AIDS试剂计划，目录号：103）
Opti-MEM TM （Thermo Fisher，目录号：31985062）
X-tremeGENE 9 DNA转染试剂（Sigma，目录号：6365779001）
水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）表达载体pVSV-G（Clontech Laboratories，目录号：631530）
HIV-1质粒pNL4-3 env（ - ）nef（ - ）gfp（+）（来自Vicente Planelles博士的礼物）
DNeasy Blood＆amp; Tissue Kit（QIAGEN，目录号：69506）
TaqMan TM Universal PCR Master Mix（Thermo Fisher，目录号：4324018）
TaqMan Fast Advanced Master Mix（赛默飞世尔，目录号：4444557）
Platinum Taq DNA聚合酶（Thermo Fisher，目录号：10966026）
定制PCR引物和TaqMan探针，HPLC纯化（Integrated DNA Technologies）
Turbo DNase（2 U/μl）（Thermo Fisher，目录号：AM2238）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号：D8537）
10％胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10438026）
青霉素 - 链霉素（Gibco，目录号：15070063）
Dulbecco改良Eagle's Medium（DMEM）（Sigma，目录号：D6171）
绝对乙醇（200标准）（Fisher Scientific，目录号：BP2818100）
水（西格玛，目录号：W4502）
MgCl 2 （Thermo Fisher，目录号：10966026）（随附Platinum Taq DNA聚合酶）

设备

0.5-10μlEppendorfResearch ® plus Adjustable Volume Pipettes（Eppendorf，目录号：3123000020）
10-100μlEppendorfResearch ® plus可调体积移液器（Eppendorf，目录号：3123000047）
20-200μlEppendorfResearch ® plus Adjustable Volume Pipettes（Eppendorf，目录号：3123000055）
100-1,000μlEppendorfResearch ® plus可调体积移液器（Eppendorf，目录号：3123000063）
Revco Laboratory CO 2 培养箱Ultima II（Thermo Fisher，目录号：RCO3000T9V）
Vortex-Genie 2涡旋混合器12（科学工业，目录号：12-812）
NanoDrop TM 2000分光光度计（Thermo Fisher，型号：NanoDrop TM 2000，目录号：ND-2000）
StepOnePlus TM 实时PCR系统（Thermo Fisher，目录号：4376600）
Veriti ® 96孔热循环仪（Thermo Fisher，目录号：4375786）
Eppendorf离心机5430R（Eppendorf，型号：5430R）＆nbsp;
Eppendorf离心机5424R（Eppendorf，型号：5424R）

软件

StepOne软件v2.2.2（赛默飞世尔）

程序

VSV-G假型病毒制备和宿主细胞感染
1. 在含有10％FBS和100单位/ ml青霉素和100μg/ ml链霉素的DMEM中，在10cm细胞培养皿中于37℃，5％CO <培养4×10 6个 HEK293细胞。 sub> 2 过夜。
2. 在1.5 ml Eppendorf试管中，加入500μlOpti-MEM TM 和25μlX-tremeGENE 9 DNA转染试剂（Roche），轻轻上下轻轻吹打，加入3μg将HIV-1质粒pNL4-3 env（ - ）nef（ - ）gfp（+）和2μgpVSV-G混合，通过上下吸移轻轻混合。在室温下放置30分钟。逐滴添加到培养的HEK293细胞中，轻轻摇动或旋转培养皿以确保在整个培养皿表面上分布。
3. 24小时后，用PBS洗涤转染的HEK293细胞，然后用10ml新鲜的DMEM完全培养基替换。＆nbsp;
4. 转染48小时后，收获含有假型病毒的上清液并通过0.45μm孔径的过滤器。然后将含有病毒的上清液等分并储存在-80℃。
5. 在感染前，用20 U / ml Turbo DNase在37°C处理制备的病毒1小时。＆nbsp;
6. 制备0.5-0.75×10 6个细胞/孔宿主细胞用于24孔板中的感染实验。分化的人巨噬细胞和THP1细胞，培养的贴壁细胞系如HCT116都适合用作宿主细胞。每孔加入100μl病毒至培养细胞。将细胞在37°C培养箱中感染2小时后，去除含有培养基的病毒，并用新鲜培养基更换。＆nbsp;
7. 在通过实验设计的感染后时间点，移除培养基，并用0.5ml PBS洗涤一次。丢弃所有剩余的PBS。
使用DNeasy Blood＆amp; amp;提取总细胞DNA。 Tissue Kit（QIAGEN）
1. 向每个孔中加入200μlPBS，20μl蛋白酶K，然后加入200μlBufferAL。彻底混合。将板在37℃孵育5分钟以裂解细胞。
2. 将细胞裂解物转移到1.5ml Eppendorf管中。在56°C孵育10分钟。
3. 向每个样品中加入200μl100％乙醇，并用涡旋混合器充分混合。
4. 将混合物吸移到DNeasy Mini旋转柱中，置于2ml收集管中。使用Eppendorf离心机5424R以6,000 x g 离心1分钟。丢弃流通管和收集管。＆nbsp;
5. 将DNeasy Mini离心柱放入新的2 ml收集管中，加入500μlBufferAW1，并使用Eppendorf离心机5424R在6,000 x g 离心1分钟。丢弃流通管和收集管。＆nbsp;
6. 将DNeasy Mini离心柱放入新的2 ml收集管中，加入500μlBufferAW2，并使用Eppendorf离心机5424R在20,000 x g 下离心3分钟。丢弃流通管和收集管。
7. 将DNeasy Mini离心柱放入干净的1.5 ml微量离心管中，将100μlBufferAE直接吸移到DNeasy膜上，不要将吸头接触到膜上。在室温下孵育5分钟，然后使用Eppendorf离心机5424R在6,000 x g 离心1分钟以洗脱DNA。
8. 使用NanoDrop或类似装置定量DNA样品。将DNA样品稀释至20 ng /μl。
定量HIV-1逆转录产物定量分析
1. 如下为每个样品制备反应混合物：1μl正向和反向引物（10μM），1μlTaqMan探针（5μM），5μlDNA样品，2μlH 2 O和10μlTaqMan® Universal PCR Master Mix（2x）。＆nbsp;
2. 通过将每种组分的体积乘以每种样品的重复数来计算PCR反应混合物的每种组分的体积。制作没有样品DNA的PCR主混合物，并准备110％的所需体积以解决移液错误。＆nbsp;
3. 向每个反应孔中吸取15μlPCR主混合物，并加入5μl样品DNA（20ng /μl）。用膜密封PCR板，并使用Eppendorf离心机5430R在2,200 x g 下离心30秒。＆nbsp;
4. 使用以下程序在StepOnePlus TM 实时PCR系统上进行PCR：95°C 2分钟预热，然后40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟。
5. 当运行定量HIV-1早期，中期，晚期逆转录产物以及2-LTR循环DNA的PCR时，有必要使用GAPDH基因作为参考。除此之外，Real-time PCR应与靶基因扩增同时进行。＆nbsp;
6. 使用实时PCR相对定量ΔΔCt方法计算样品目标基因拷贝数。＆nbsp;
HIV-1整合量化
1. 来自具有单拷贝HIV基因组整合的Ach2细胞的DNA用作拷贝数对照。 3.59μg基因组DNA含有约10个 6 基因组拷贝。通过将来自Ach2细胞的DNA与来自未感染的人细胞的DNA以相应的比例混合，制备从1×10 4 至1拷贝/μl（实际上是1拷贝）（20ng DNA）的系列稀释的DNA标准品。＆NBSP;
2. 在1 st 整合PCR中，用以下组分制备反应：2.5μl10x缓冲液，0.75μl50mMMgCl 2 ，0.5μl10mMdNTP，0.5μl每个正向和反向 Alu 引物（10μM），0.5μl反向引物HIV-1 gag-R（10μM），0.5U Platinum Taq DNA聚合酶（Thermo Fisher），5μl样品DNA（ 100ng），加入H 2 O至总共25μl。使用Veriti ® 96孔热循环仪（Thermo Fisher）进行PCR，程序如下：预热至94°C 2分钟，然后运行15个循环，94°C 30秒，55° C持续30秒，72℃持续3分钟。将样品在72°C下保持5分钟。＆nbsp;
3. 对于用于整合定量的2 nd 轮实时PCR，如下制备每个样品的反应混合物：各1μl正向和反向引物（10μM），1μlTaqMan探针（ 5μM），5μl10倍稀释的1 st 圆形PCR产物，2μlH 2 O和10μlTaqMan® Universal PCR Master Mix（2x）。＆nbsp;
4. 使用StepOnePlust TM 实时PCR系统使用以下程序进行PCR：预热至95°C持续2分钟，然后40个循环的95°C持续15秒，以及60°C持续1分钟。＆NBSP;
5. 使用Real-time PCR标准曲线方法确定样品目标基因拷贝数。
6. 代表性实验可以在Shi 等人的论文的图2中找到（2018）和Furuya等人的论文的图7 （2016）。

笔记

基于pNL4-3的HIV-1序列设计PCR引物和TaqMan探针。如果使用其他HIV-1病毒株，请检查序列比对。＆nbsp;
如果使用HIV-1分离株或实验室菌株，则不需要进行DNA酶处理。＆nbsp;
另一种实时PCR试剂TaqMan Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher）提供了类似于TaqMan ® Universal PCR Master Mix（Thermo Fisher）的结果。

致谢

这项研究得到奥尔巴尼药学与健康科学学院发现校内研究资助奖学金的支持;这里描述的协议改编自Butler 等人的先前出版物的协议，2001; Yamamoto et al。，2006; Mbisa et al。，2009。

利益争夺

所有作者均声明不存在利益冲突或竞争利益。

参考

Hu，W。S.和Hughes，S。H.（2012）。 HIV-1逆转录。 Cold Spring Harb Perspect Med > 2（10）。
Sloan，R。D.和Wainberg，M。A.（2011）。未整合DNA在HIV感染中的作用。逆转录病毒学 8（1）：52。
Zheng，Y。H.，Jeang，K。T.和Tokunaga，K。（2012）。逆转录病毒感染中的宿主限制因子：病毒 - 宿主互动中的承诺。逆转录病毒学 9：112。
Shi，B.，Sharifi，H.J.，DiGrigoli，S.，Kinnetz，M.，Mellon，K.，Hu，W。和de Noronha，C.M.C。（2018）。抑制p53及其下游基因p21的HIV早期复制。 Virol J 15（1）：53。
Furuya，A.K.，Sharifi，H.J.，Jellinger，R。M.，Cristofano，P.，Shi，B。和de Noronha，C.M。（2016）。 Sulforaphane通过Nrf2抑制HIV对巨噬细胞的感染。 PLoS Pathog > 12（4）：e1005581。
Butler，S.L.，Hansen，M。S. T.和Bushman，F。D.（2001）。 HIV DNA整合体内的定量检测。自然医学 7：631。
Yamamoto，N.，Tanaka，C.，Wu，Y.，Chang，MO，Inagaki，Y.，Saito，Y。，Naito，T.，Ogasawara，H.，Sekigawa，I。和Hayashida，Y。（2006 ）。使用基于Real的特定，灵敏和定量分析对人类免疫缺陷病毒1型整合进行分析时间聚合酶链反应。病毒基因 32（1）：105-113。
Mbisa，J.L.，Delviks-Frankenberry，K.A。，Thomas，J.A.，Gorelick，R.J。和Pathak，V.K。（2009）。进入事件后HIV-1复制的实时PCR分析。方法Mol Biol 485：55-72。