材料和试剂

微量离心管
玻璃底盘（World Precision Instruments，目录号：FD3510）
NAP-5尺寸排除列（GE Healthcare，目录号：17-0853-02）
MCF-10A细胞
DMEM / F12（Invitrogen，目录号：11039-021）
马血清（Invitrogen，目录号：16050-122）
Pen / Strep（100x溶液）（Invitrogen，目录号：15070-063）
EGF（Peprotech，1 mg）（在无菌ddH 2 O中重悬于100μg/ ml。将等分试样保存在-20°C）
氢化可的松（Sigma-Aldrich，目录号：H0888）（在200-proof乙醇中重悬1 mg / ml，在-20°C下保存等分试样）
霍乱毒素（Sigma-Aldrich，目录号：C-8052）（在无菌ddH 2 O中以1 mg / ml重悬并允许重建约10分钟。将等分试样储存在4°C）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I-1882）（在含有1％冰醋酸的无菌ddH 2 O中重悬10mg / ml。摇动溶液并允许10-15分钟重建。将等分试样保存在-20°C）
FluoSpheres TM 羧酸盐修饰的微球，0.1μm，黄绿色荧光（505/515）（Thermo Fisher Scientific，目录号：F8803）＆nbsp;
TetraSpeck TM 微球，0.1μm，荧光蓝/绿/橙/深红（Thermo Fisher Scientific，目录号：T7279）＆nbsp;
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Lonza）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）＆nbsp;
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
一抗兔抗H3K4me3抗体（默克密理博中国，目录编号：07-473）
小鼠抗H3K9ac抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录编号：ab12179）
二抗
驴抗兔抗体（Jackson ImmunoResearch，目录号：711-005-152）
驴抗小鼠抗体（Jackson ImmunoResearch，目录号：715-005-151）
Alexa 405羧酸琥珀酰亚胺酯（赛默飞世尔科技，目录号：A30000）
Alexa 647羧酸琥珀酰亚胺酯（Thermo Fisher Scientific，目录号：A20006）
Cy2和Cy3B活性染料（GE Healthcare，目录号：PA22000，PA63101）
二甲基亚砜（DMSO;无水）＆nbsp;
Click-iT TM EdU Alexa Fluor TM 647成像套件（Thermo Fisher Scientific，目录号：C10340）
葡萄糖（西格玛奥德里奇，目录号：G7021）
来自Aspergillus niger-Type VII的葡萄糖氧化酶（Sigma-Aldrich，目录号：G2133）
来自牛肝冻干粉的过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C40）
1 M Tris，pH 8.0
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
2-巯基乙醇（β-ME）（Sigma-Aldrich，目录号：63698）
半胱胺（MEA）（Sigma-Aldrich，目录号：30070）＆nbsp;
NaHCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
MCF-10A培养基（参见食谱）
洗涤缓冲液（见食谱）
阻塞缓冲区（参见食谱）
STORM成像缓冲区（见食谱）

设备

奥林巴斯IX71倒置显微镜框架，带有油浸物镜（100x，NA = 1.4，UPLSAPO 100XO; Olympus，型号：IX71）
sCMOS相机（pco.edge 4.2，PCO-TECH）
在基于Olympus IX71倒置显微镜框架的定制系统上获得双色dSTORM图像，该系统具有油浸物镜和附在侧面相机端口上的sCMOS相机。使用0.5x适配器，使得相机上的每个像素对应于样品平面上的130nm（可接受约80-160nm的像素尺寸）。＆nbsp;
目标纳米定位器（Mad City Labs，型号：Nano-F100S）
N-STORM系统（尼康仪器）
NanoDrop 2000显微分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 2000）
摇摆平台

软件

ImageJ（美国国立卫生研究院， https://imagej.nih.gov/ij/download.html < / A>）＆NBSP;
Ovesný et al。（2014）中的ThunderSTORM插件（可从 https://github.com下载） / zitmen /雷暴）
Labview（国家仪器）

程序

可光切换的荧光团与二抗的缀合
1. 将Alexa 405（1.0mg管）和Alexa 647（管）溶解在100μlDMSO中，分成50份，每份含0.02mg。将Cy2（1包）和Cy3B（1包）溶解在20μlDMSO中并分成10等份。对于长期储存，冻干并在-20°C干燥条件下储存。＆nbsp;
2. 取一管上面的每种染料（冻干粉末），向Alexa 647管（0.5μg/μl）中加入40μlDMSO，向Alexa 405（2μg/μl），Cy2和Cy3B管（10μg/μl）中加入10μlDMSO ），适当溶解。＆nbsp;
3. 通过将0.021g NaHCO 3，溶解于5ml H 2 O中制备新鲜的0.5M NaHCO 3 sub溶液。＆nbsp;
4. 为了将二抗与单个荧光团Alexa 647或Cy3B结合用于dSTORM成像，将来自Step的40μl驴抗兔/小鼠抗体，10μl0.5M NaHCO 3 和2μlAlexa647稀释液彻底混合A2并在室温下孵育30分钟，避光。类似地，混合40μl驴抗兔/小鼠抗体，10μlNaHCO 3 和来自步骤A2的1μlCy3B稀释液，并在相同条件下孵育。＆nbsp;
5. 将二抗与染料对缀合：混合40μl驴抗兔/小鼠抗体，10μlNaHCO 3 ，来自步骤A2的5μlCy2稀释液和来自步骤A2的1μlAlexa647稀释液，和在室温下孵育30分钟，避光。类似地，混合40μl驴抗兔/小鼠抗体，10μlNaHCO 3 ，来自步骤A2的5μlAlexa405稀释液和来自步骤A2的1μlAlexa647稀释液，并在相同条件下孵育。
6. 在反应过程中，用1,000μlPBS洗涤NAP-5尺寸排阻柱（参见材料和试剂）三次。当反应完成时，加入150μlPBS使反应体积达到200μl。
7. 将整个反应溶液加入到柱子中，使液体完全被吸收到柱子中。加入550μlPBS进行洗涤，然后加入另外300μlPBS并在微量离心管中收集荧光团缀合的抗体。＆nbsp;
8. 使用NanoDrop 2000分光光度计测量荧光团缀合的二抗的吸光度以计算缀合效率。测量280nm处抗体的吸光度，401nm处的Alexa 405，489nm处的Cy2,3559nm处的Cy3B和650nm处的Alexa 647。将标记的抗体级分保存在4°C。如需长期保存，请在-20°C下分装并保存。＆nbsp;
DNA和组蛋白修饰的双色染色（参见图1.程序以DNA和H3K4me3为例）

图1. DNA染色和组蛋白修饰的示意图。 DNA与EdU合并，用Azide Alexa 647检测。然后用Cy3B免疫标记组蛋白修饰。＆nbsp;
1. 将MCF-10A细胞置于玻璃底皿上，汇合度为50％-70％，对于本方案中使用的WPI（FD3510）培养皿，将200μl细胞悬浮液（~50细胞/μl）置于孔中。孵育过夜。＆nbsp;
2. 将EdU加入终浓度为1μM，总体积为200μl的细胞中，孵育24小时。
  注意：EdU浓度需要针对不同的样品或实验条件进行优化。我们通过在整个细胞周期中孵育来完全标记DNA。对于STORM成像，我们建议使用较低浓度（0.5-2μM）与制造商推荐的10μM相比。在STORM成像条件下，过度标记可能会导致极高的闪烁密度和高背景，导致图像分辨率和伪影不佳。＆nbsp;
3. 用4％PFA固定细胞15分钟，用PBS洗涤3次。
  注意：也可以使用其他常用的酒精固定剂，如甲醇/乙醇（1：1）或甲醇/丙酮（1：1）。我们的测试显示，与4％PFA相比，高阶染色质结构相当（相似的簇大小和密度。请参阅Xu et al。，2018）。＆nbsp;
4. 用PBS中的0.2％Triton X-100渗透10分钟，用PBS洗涤3次。如果使用酒精固定剂，则不需要此步骤。＆nbsp;
5. 按如下方式准备Click-iT Plus反应混合物。总体积为500μl，鸡尾酒含有440μl1xClick-iT反应缓冲液，10μl铜保护剂，1.2μlAlexa647 picolyl叠氮化物和50μl反应缓冲液添加剂。所有组件均由制造商的成像套件提供。
  注意：与基于EdU的标记类似，Alexa 647 picolyl叠氮化物的浓度也可能需要调整，以达到dSTORM成像的优化标记密度。＆nbsp;
6. 将Click-iT Plus反应混合物加入细胞中，孵育30分钟，避光。用洗涤缓冲液洗涤3次。＆nbsp;
7. 用封闭缓冲液（1：600）稀释的150μl兔抗H3K4me3一抗孵育细胞，4°C过夜。＆nbsp;
8. 用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。＆nbsp;
9. 与在封闭缓冲液中稀释的Cy3B缀合的驴抗兔二抗在室温下孵育2小时，避光。
  注意：双色dSTORM成像需要同时标记两个不同波长的两个荧光团。 Alexa 647和Cy5通常是首选，因为它们在红/近红外通道中具有最佳的闪烁特性;对于第二个通道，根据我们的经验，与具有相似波长范围的其他染料相比，Cy3B和CF568具有更好的闪烁行为。
10. 用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。＆nbsp;
11. 使用4％PFA后固定10分钟，用PBS清洗。＆nbsp;
12. 将FluoSpheres TM 羧酸盐修饰的微球（材料和试剂＃12）沉积到培养皿中以进行漂移校正。在PBS中以1：500,000稀释荧光珠，向培养皿中加入200μl珠子溶液，沉积30分钟，然后切换至PBS。样品已准备好进行成像。
  注意：珠子的浓度和沉积时间是可调节的，以确保在视场中至少有5个荧光珠用于漂移校正（原理已在前面讨论过，Ma 等。，[2017]）。＆nbsp;
不同组蛋白修饰的双色染色（H3K9ac和H3K4me3）
1. 将MCF-10A细胞置于玻璃底皿上，汇合50％，孵育过夜。＆nbsp;
2. 用4％PFA固定细胞15分钟，用PBS洗涤3次。＆nbsp;
3. 用0.2％Triton X-100渗透10分钟，用封闭缓冲液洗涤3次。＆nbsp;
4. 将具有两种一抗（小鼠抗H3K9ac抗体，兔抗H3K4me3抗体）的细胞同时在封闭缓冲液中以4°С稀释过夜。
  注意：一抗的高效率和特异性对于高质量的超分辨率成像至关重要。我们建议在生物学实验之前，测试ChIP级或Knockout（KO）验证的抗体的高特异性（低背景）和足够的定位数（每组〜> 20个定位）。
5. 用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。＆nbsp;
6. 与第二抗体（染色对Alexa 405-647缀合的驴抗小鼠二抗，Cy2-Alexa 647缀合的驴抗兔二抗）一起孵育，在封闭缓冲液中在室温下稀释2小时;避光。＆nbsp;
7. 用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。＆nbsp;
8. 使用4％PFA后固定10分钟，用PBS清洗。＆nbsp;
9. 将荧光珠沉积到培养皿中以进行漂移校正。以1：500,000稀释荧光珠，沉积30分钟，然后切换至PBS。样品已准备好进行成像。
  注意：如果使用商用N-STORM系统（例如，N-STORM，尼康），它配备了用于漂移校正的对焦锁定系统，这一步可能没有必要。
风暴成像
1. 新鲜准备STORM成像缓冲区。
  注意：对于dSTORM成像，优选基于β-ME的缓冲液;对于使用染料对的双色STORM，优选基于MEA的缓冲液。请参阅下面的食谱部分。
2. 将STORM成像缓冲液添加到样品中，并将样品放在显微镜载物台上。＆nbsp;
3. 使用较低的激光功率（~1 mW）来识别成像物体，调整焦平面以找到最清晰的核周边。＆nbsp;
4. 将激光功率增加到最大值（~2-10 kW•cm -2 功率密度）以关闭荧光分子并触发光切换（见视频1）。
  注意：如果闪烁过于密集（显着重叠的发射器和高背景），请在数据采集前将样品漂白30秒-3分钟。如果在漂白几分钟后，眨眼仍然太密集，可能需要具有较低标记密度的样品重新制备。见图2.
  视频1.成像设置和STORM成像的实时数据采集
  
  图2.原始数据的代表性单帧。 A.漂白不足的原始数据的单帧图像示例（密集发射器和高背景）。 B.漂白2分钟后具有可接受的发射器密度和背景的原始数据的单帧的示例。校准条显示光子计数。
5. 数据采集
  1. 双色dSTORM成像
    在双色dSTORM成像中使用642nm和561nm激光的连续照射。使用642nm激发，在20ms的曝光时间依次对两个通道成像30,000帧，然后使用561nm激发对30,000帧进行成像。如前所述，将100nm黄绿色荧光珠用作盖玻片上的基准标记，以校正每200帧的3D系统漂移（Ma et al。，2017; Xu et al。，2017）。如果每帧中的“开”分子变得非常稀疏，则可以在数据采集期间添加405 nm的低功率（1到100μW）以促进闪烁。
    注意：＆nbsp;
    1. 对于漂移校正，在实验开始时，将物镜纳米定位器的位置移动到焦平面，其中至少有4-5个基准标记（例如，荧光珠是可见的;然后在Labview编写的物镜纳米定位器控制软件设置的焦平面周围的不同轴向位置记录一组基准标记的2D图像;基准标记的初始位置使用我们之前的出版物（Ma 等，2017）中描述的方法确定。在数据采集期间，对于每200帧（~4s），物镜的轴向位置移动到在实验开始时通过物镜纳米定位器确定的基准标记的初始位置（激发波长为488nm），并且拍摄基准标记的2D图像，并利用各个基准标记的点扩散函数的模式来跟踪样本的轴向位置;并按照我们之前的出版物（Ma et al。，2017）中的详细描述调整样本的焦平面。整个过程使用Labview编写的软件进行控制。
    2. 如果使用商用STORM系统（例如，N-STORM，尼康），则应根据反射配备用于漂移校正的聚焦锁定盖玻片和封固介质之间。如果盖玻片（n = 1.515）和安装介质（如果含水介质，n = ~1.34）之间存在很大的折射率不匹配，它将很好地工作。
    3. 对于使用Alexa 647和Cy3B的双色dSTORM成像，最好首先对Alexa 647通道进行成像，因为如果先对Cy3B进行成像，561 nm激光将强烈漂白Alexa 647染料。＆nbsp;
  2. 基于染料对的双色STORM成像
    对于双色STORM成像，405nm和488nm激光器用作激活激光器，647nm激光器用作成像激光器。使用一系列激活成像激光脉冲周期定期照射样品。在每个周期中，其中一个激活激光器开启一帧（激活帧），然后是三个连续帧的647-nm成像激光器（成像帧），每种颜色获得~10,000个周期（总共40,000帧）。紧接在激活脉冲（成像帧1）之后的成像帧被识别为受控激活事件，并用于图像重建。
    ＆NBSP;以染色对Alexa 405-647和Cy2-Alexa 647为例进行双色STORM成像。两个激活激光器（405 nm和488 nm）脉冲开启：405 nm激光脉冲开启（低功率）打开Alexa 405-647通道，打开成像激光（647 nm）（最大功率），在Color 1通道中进行图像采集;当488nm激光脉冲（低功率）打开Cy2-Alexa 647通道时，647-nm成像激光器开启，用于彩色2通道的图像采集。
    注意：调整激活器激光器（405 nm和488nm）的功率非常重要，以优化成像帧的“开关”开关和发射器密度。当激活激光器打开时，应该看到适当的闪烁密度;当激活剂激光器关闭时，很少有分子处于“开启”状态。见图3B。＆nbsp;

数据分析

dSTORM的图像重建
通过高斯拟合在每帧记录的单个荧光发射器（“在”分子上）从累积位置重建最终STORM图像。图像重建软件通常由商业STORM系统（例如，N-STORM）提供。许多开源图像重建软件都可用（Henriques et al。，2010; Wolter et al。，2012; Min et al。，2014;Ovesný et al。，2014）。我们推荐ThunderSTORM（Ovesný et al。，2014）。简要如下：
1. 将原始数据的整个图像序列导入ImageJ。＆nbsp;
2. 设置相机参数（例如，像素大小，每个A / D计数和基准电平的光电子）。＆nbsp;
3. 在ThunderSTORM插件中打开“运行分析”并设置相应的参数（例如，图像过滤，定位方法），有关如何设置参数的建议已在Xu 等中详细描述。 / em>（2017）。
4. 设置完所有参数后，单击“确定”开始图像重建（参见视频2，使用100帧作为示例。实际图像重建通常需要10,000-40,000帧）。
注意：校正色差对于超分辨率成像至关重要。对于双色dSTORM，为了校正不同颜色通道的色差，多色荧光珠（TetraSpeck微球，0.1毫米直径，蓝色/绿色/橙色/深红色荧光）在很大程度上均匀分布在整个区域视图可用于生成变换图（Sigal 等。，2015）。

视频2.通过ThunderSTORM ImageJ插件重建STORM图像。
基于染料对的STORM成像图像重建如果在STORM成像中使用染料对，则对于每个通道，仅使用紧接在每个激活脉冲之后的成像帧（图3B中的成像帧1）用于图像重建，遵循与上述dSTORM相同的方法。在每个激活脉冲之后的第二和第三帧（图3B中的成像帧1和2）被认为是非特定激活信号，其通过Bates 等人描述的串扰减法算法移动。 >，2007。
注意：对于使用染料对的双色STORM成像，不需要色彩校正，因为相同的成像荧光团用于两个颜色通道。由于对色差的校正很少是完美的，在两个目标的准确定位对于回答生物学问题至关重要的情况下，基于染料对的双色STORM无色差可能是有利的。

图3.基于dSTORM或染料对的代表性双色STORM成像（原始数据和STORM）。 A.用Alexa标记的DNA（EdU）和H3K4me3的代表性原始图像和双色dSTORM图像分别为647和Cy3B。 B.基于染料对的代表性原始图像（一个激活成像循环的成像帧1-3）和H3K9ac和H3K4me3的双色STORM图像。 H3K9ac用Alexa 405-647标记，H3K4me3用Cy2-Alexa 647标记。比例尺：2μm。

食谱

MCF-10A培养基
DMEM / F12
5％马血清
10毫克/毫升胰岛素
20 ng / ml EGF
0.5 mg / ml氢化可的松
100 ng / ml霍乱毒素
洗涤缓冲区
PBS中0.2％BSA + 0.05％Triton X-100
阻塞缓冲区
PBS中3％BSA + 0.05％Trion X-100
STORM成像缓冲区
10％（w / v）葡萄糖
0.56 mg / ml葡萄糖氧化酶
0.17 mg / ml过氧化氢酶
10 mM NaCl
50 mM Tris（pH 8.0）
对于dSTORM成像，使用0.14 M 2-巯基乙醇;对于染料对的双色成像，使用0.1 M巯基乙胺（MEA）

致谢

我们感谢国立卫生研究院拨款号R01CA185363和R33CA225494提供的资金支持。我们的协议基于先前发布的协议进行了调整（Bates et al。，2007和2013; van de Linde et al。，2011）。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

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Bates，M.，Jones，S。A.和Zhuang，X。（2013）。准备用于STORM成像的光可切换标记抗体。 Cold Spring Harb Protoc < / em> 2013（6）：540-541。
Henriques，R.，Lelek，M.，Fornasiero，E.F。，Valtorta，F.，Zimmer，C。和Mhlanga，M。M.（2010）。 QuickPALM：ImageJ中的3D实时光活化纳米图像处理。 Nat方法 7（5）：339-340。
Ma，H.，Xu，J.，Jin，J.，Huang，Y。和Liu，Y。（2017）。用于超分辨率显微镜的简单标记辅助3D纳米漂移校正方法。 Biophys J 112（10）：2196-2208。
Min，J.，Vonesch，C.，Kirshner，H.，Carlini，L.，Olivier，N.，Holden，S.，Manley，S.，Ye，J。C.和Unser，M。（2014）。 FALCON：快速，无偏见地重建高密度超分辨率显微镜数据。 Sci Rep 4：4577。
Ovesný，M.，Křížek，P.，Borkovec，J.，Švindrych，Z。和Hagen，G.M。（2014）。 ThunderSTORM：用于PALM和STORM数据分析和超分辨率成像的全面ImageJ插件。< / a> 生物信息学 30（16）：2389-2390。
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Wolter，S.，Loschberger，A.，Holm，T.，Aufmkolk，S.，Dabauvalle，M。C.，van de Linde，S。和Sauer，M。（2012）。 rapidSTORM：用于本地化显微镜的准确，快速的开源软件。 Nat方法 9（11）：1040-1041。
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