材料和试剂

由所选启动子驱动的Mito-miniSOG构建体，例如， Pnmr-1-mito-mini SOG （interneuron）（ http://www.wormbase.org 提供了 C。e。特定启动子的一般信息。 a href ="http://chinook.uoregon.edu/neuron.html"target ="_blank"> http://chinook.uoregon.edu/neuron.html 提供了神经元启动子列表）
*请求miniSOG构建应该提交给Roger Y. Tsien（加利福尼亚州圣地亚哥）。

（可选）非绿色荧光标记物标记目标细胞或组织，例如， Pnmr-1-mCherry

由特定启动子驱动的免费miniSOG的控制构建体，例如， Pnmr-1-miniSOG

100mM CuCl 2 v/v

过滤纸

NGM（线虫生长培养基）平板（种子和未种子）

NGM（线虫生长介质）（参见食谱）

设备

荧光立体显微镜（解剖显微镜，例如，Leica，型号：M165）
直立表面荧光显微镜（复合显微镜，例如Zeiss Axio Imager 2）
Prizmatix LED（UHP-Mic-LED-460）和数字函数发生器（PASCO Scientific，目录号：PI-9587C）
显微注射钻机生成转基因蠕虫

程序

注射您的mito-miniSOG结构与非绿色荧光标记，以产生转基因蠕虫（提示：基于启动子强度，根据经验优化注射浓度20-50ng /μl是良好的起始范围;对于弱启动子，浓度可能需要增加至100ng /μl 。对具有中等mito-miniSOG表达的转基因品系的筛选，即来自mito-miniSOG的绿色荧光应当在epi荧光显微镜的63x物镜下可目测检测，如果绿色荧光可以容易地在10x目标下检测到的，mito-miniSOG的表达可能太高。可以将Mito-miniSOG转基因动物保存在标准孵化器中的铝箔覆盖下，并且应当小心保持动物远离连续室内光照）。
使用行为可见的标记或非GFP共注射标记在荧光解剖显微镜下分离L4（或任何发育阶段）转基因动物;避免暴露于蓝光。
如果您打算使用复合显微镜进行蓝光照明，请先执行步骤4-10。如果使用LED灯，请转到步骤11-13。
将外径为50mm（以适应60mm的盘）和内径为15mm的环形滤纸切成约照射点的尺寸。将滤纸放在未涂布的60 mm NGM板上。
将足量的100mM CuCl 2溶液（约0.5ml）滴到滤纸上，直到纸充分润湿; Cu ^{2 +}是限制照明点内的蠕虫，因为蠕虫显示对Cu ^{2 +}的厌恶。
通过按下一块种子琼脂（从种子板）颠倒，然后翻转它添加OP50糊在环开口。添加OP50是为了在照明期间保持动物良好的喂养
在铜环内转移转基因蠕虫。
将无盖板放在复合显微镜载物台上转盘正下方一个空位置（或取下一个物镜），使蓝光直接通过板。
打开蓝色荧光（475±20 nm）。在复合显微镜上接收到的光强度蠕虫的实例为57mW/cm 2 。
（提示：动物可以暴露于连续的蓝光或脉冲蓝光（0.5秒开，1.5秒关闭）。脉冲光由电子快门提供， 30mm W/HS，LUDL Electronics和信号装置，例如，Uniblitz单元（VMM-D1））。
照亮动物30分钟至1小时;最佳长度应根据特定显微镜和光源以及转基因经验确定。光照后，在进行任何分析之前，将蠕虫转移到新接种的平板上
（为了使用LED照明）通过40mm NGM板的边缘（40mm约为我们的LED设置下的照明斑点的尺寸）滴下约0.5-1ml的100mM CuCl 2溶液）并使盘壁周围的液体旋转几次，然后除去过量的液体。
转移转基因蠕虫到40毫米NGM板的中心（我们喜欢使用种板，除非另有具体条件，否则要求）。将板放在LED光源下。蜗杆与LED灯板之间的距离约为12厘米。打开LED灯。 LED灯的频率设置为4 Hz。来自LED装置的蓝光（460nm）的强度为约800mW/cm 2 。
照亮蠕虫任何所需的时间长度。然后将蠕虫转移到新的接种板上（提示：根据细胞类型和mito-miniSOG的表达水平，根据经验确定最佳暴露时间。例如，每秒闪烁4次，持续2分钟可充分损害表达hypodermis的mito-miniSOG，但是需要更长时间的照明来杀死神经元。）

食谱

NGM（线虫生长介质）

致谢

该协议改编自Qi等人（2012）和Shu等人（2011）。

参考文献

Qi，Y. B.，Garren，E.J.，Shu，X.，Tsien，R.Y.and Jin，Y。（2012）。 Caenorhabditis elegans中的光诱导细胞消融使用遗传编码的单线态氧生成蛋白质miniSOG。 Proc Natl Acad Sci USA 109（19）：7499-7504。

Shu，X.，Lev-Ram，V.，Deerinck，T.J.，Qi，Y.，Ramko，E.B.，Davidson，M.W.，Jin，Y.，Ellisman，M.H.and Tsien，用于完整细胞，组织和生物的相关光和电子显微镜的遗传编码标签。 a> PLoS Biol 9（4）：e1001041。