材料和试剂

铝箔
1.5毫升微量离心管
0.2毫升8条PCR管和盖条
5'-生物素化和非生物素化的50碱基单链DNA和互补的未修饰的50碱基单链DNA（Eurofins，Japan）
含有目的基因的cDNA区域的质粒
用于第1和第2次PCR的基因特异性引物（见表1）
超纯水（Milli-Q水）
KOD-Plus-Neo（包括10x PCR缓冲液，2 mM dNTPs，25 mM MgSO 4 和KOD-Plus-Neo DNA聚合酶）（TOYOBO，目录号：KOD-401）
琼脂糖（VWR，目录号：0710-500g）＆nbsp;
快速加载紫色1 kb Plus DNA梯（0.1-10.0 kb）（New England BioLabs，目录号N0550S）
溴化乙锭（Wako Pure Chemical，目录号：547-00101）
不含RNase的水
用不含RNase的水稀释4M乙酸铵
99.5％乙醇（Wako Pure Chemical，特殊等级，目录号057-00451）
体外转录/翻译试剂盒（NUProtein，目录号：PSS3050）
聚丙烯酰胺凝胶
AlphaScreen FLAG ®（M2）检测试剂盒（PerkinElmer，目录号：6760613C）
AlphaPlate-384,384孔板（PerkinElmer，目录号：6005350）
Tween ® 20（TCI，目录号：T0543）
牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇，目录号：A2058-5G）
聚脱氧腺苷酸 - 多聚乙烯基酸（dAdT）（Sigma-Aldrich，目录号：P9764-5UN）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Wako Pure Chemical，目录号：047-08973）
三（羟甲基）氨基甲烷（Wako Pure Chemical，目录号：207-06275）
冰醋酸（Wako Pure Chemical，目录号：518-33985）
乙二胺四乙酸（EDTA）（DOJINDO，目录号：345-01865）
甘油（Wako Pure Chemical，目录号：075-00616）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Wako Pure Chemical，目录号：191-07145）
Bromophenol blue（Wako Pure Chemical，目录号：021-02911）
二甲苯cyanolFF（Wako Pure Chemical，目录号：244-00461）
100x TAE缓冲液（见食谱）
10倍装载染料（见食谱）

用于SDS-PAGE和Western印迹

硝酸纤维素膜（GE Healthcare，目录号：10600007）
Whatman TM 3 MM Chr色谱纸（GE Healthcare，目录号：05-714-5）
杂交袋
MXJB III Film（IBI，目录号：6567291）
Precision Plus Protein TM 双色标准品（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610374）
SDS聚丙烯酰胺凝胶
甲醇（Wako纯化学品，特殊等级，目录号：131-01826）
抗DYKDDDDK标签抗体（在封闭缓冲液中1：2,000稀释）（Wako Pure Chemical，目录号：014-22383）
山羊抗小鼠IgG-HRP（在封闭缓冲液中1：1,000稀释）（Cosmo Bio，目录号：1030-05）
SuperSignal TM West Pico PLUS化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，目录号：34577）
三（羟甲基）氨基甲烷（Wako Pure Chemical，目录号：207-06275）
SDS（Wako Pure Chemical，目录号：191-07145）
Bromophenol blue（Wako Pure Chemical，目录号：021-02911）
二甲苯氰基lFF（Wako Pure Chemical，目录号：244-00461）
NaCl（Wako Pure Chemical，目录号：191-01665）
Na 2 HPO 4 （Wako Pure Chemical，目录号：197-02865）
KCl（Wako Pure Chemical，目录号：163-03545）
KH 2 PO 4 （Wako Pure Chemical，目录号：169-04245）
脱脂奶粉（Wako Pure Chemical，目录号：190-12865）
10x运行缓冲区（参见食谱）
4x SDS样品缓冲液（参见食谱）
转移缓冲区（见食谱）
10x PBS（见食谱）
阻塞缓冲区（见食谱）

设备

移液器
PCR热循环仪（Thermo Fisher Scientific，型号：Veriti 200）
冷冻离心机（日立，型号：himac CF 15R）
涡旋混合器
块孵化器（您可以使用水培养箱代替块孵化器。）
Wonder Shaker（NISSIN，型号：NA-4X）
Multi Shaker（东京Rikakikai有限公司，型号：MMS-120H）
热封机（Taiyo Electric Co.，Ltd.，型号：HS-400）
Trans-Blot ® SD半干电泳转移细胞（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-3940）
富士医疗胶片处理器（FUJIFILM Medical，型号：FPM100）
X光胶片盒
EnSpire TM Alpha Plate Reader（PerkinElmer，型号：2390-00000）

注意：显示设备＃5至＃11供您参考SDS-PAGE和Western印迹。

程序

使用AlphaScreen ® 转录因子的体外转录/翻译
1. 制备体外转录/翻译的DNA模板
  在这种情况下，将“FLAG ® -tag”连接到靶转录因子的N末端，进行两步PCR方法。用于制备转录模板的所有引物如表1所示。
  注意：有关详细信息，请参阅Genes Cells（Nomoto和Tada，2018a）和Methods Mol Biol（Nomoto和Tada，2018b）中发表的文章，其中包括体外转录/翻译的所有程序。
  
  表1.转录模板PCR的引物序列
  1. 在冰上准备以下第一次PCR混合物（总体积：50μl/样品）：
    用于KOD-Plus-Neo的5μl10xPCR缓冲液 5μl2mM dNTP
    3μl25mMMgSO 4
    1μlKOD-Plus-Neo
    1μl质粒（1 ng /μl）
    1μl10μM第一基因特异性NF引物
    1μl10μM第一基因特异性NR引物
    加入33μl超纯水，使反应体积达到50μl
    注意：您可以使用任何含有目的基因cDNA区域的质粒。在这种情况下，克隆到pENTR / D-TOPO中的cDNA区域用作第一PCR模板。
  2. 运行以下第一次PCR
    步骤1：94℃5分钟
    第2步：30个循环的
    a）98°C持续10秒
    b）55°C 30秒
    c）68℃3分钟（30-60秒/ kb）
    步骤3：72°C保持2分钟
    步骤4：4℃直至琼脂糖凝胶电泳注意：此步骤中的温度（杂交步骤）取决于引物序列。您可以根据常规PCR方法更改此步骤的温度。它应该在55°C和65°C之间。
  3. 在琼脂糖凝胶（1％TAE缓冲液中1.5％[w / v]）电泳上运行2μl第一份PCR样品，检查PCR扩增子的数量和大小（图1）。
    注意：如果在单个PCR中检测到多个PCR扩增子，建议使用凝胶提取目标条带。
  4. 在冰上准备以下第二种PCR混合物（总体积：50μl/样品）：
    用于KOD-Plus-Neo的5μl10xPCR缓冲液 5μl2mM dNTP
    3μl25mMMgSO 4
    1μlKOD-Plus-Neo
    1μl第一次PCR样品
    1μl10μM第二-T7-NF2引物
    1μl100nM第二蛋白标签（FLAG）-NF1引物
    1μl10μM第二-3'SU-NCR2引物
    1μl100nM 2nd-3'SU-NR1引物
    加入31μl超纯水，使反应体积达到50μl
  5. 运行以下第二次PCR
    步骤1：98°C 1分钟
    第2步：10个循环的
    a）98°C持续10秒
    b）60°C 1分钟
    c）68℃3分钟（30-60秒/ kb）
    第3步：30个循环的
    a）98°C持续10秒
    b）60°C，持续15秒
    c）68℃3分钟（30-60秒/ kb）
    步骤4：72℃2分钟
    步骤5：4℃直至琼脂糖凝胶电泳
  6. 在琼脂糖凝胶（1.5％[w / v]在1x TAE缓冲液中）电泳上运行2μl第二PCR样品，检查PCR扩增子的数量和大小（图1）。
    注意：如果在单次PCR中检测到多个PCR扩增子，建议使用凝胶提取目标条带。一个转录反应需要25μl纯化的第二PCR扩增子，含有300至600 ng DNA。
    
    图1.来自第1次PCR，第2次PCR和转录产物的产物的琼脂糖凝胶电泳。泳道1：DNA标记（2-log ladder），泳道2：第1次PCR产物，泳道3：第2次PCR产物，泳道4：转录反应产物。克隆到pENTR / D-TOPO载体中的 MYB30 编码区用作第一次PCR的模板。 MYB30 编码区是969个碱基对。
2. 体外转录
  按照制造商的方案，使用NUProtein试剂盒进行体外转录/翻译反应。
  1. 在冰上准备以下转录主混合物（一个样品）：
    2.5μl10x转录缓冲液（试剂盒中提供）
    1.25μl的0.1 M DTT（试剂盒中提供）
    2.5μl25mMNTP（试剂盒中提供）
    1μlT7RNA聚合酶（试剂盒中提供）
    加入15.25μl不含RNase的水
    注意：如果发生RNA降解，应在转录组合中加入RNase抑制剂。
  2. 将22.5μl上述转录混合物分配到每个新管（建议使用无RNase管）并仔细添加2.5μl第二PCR产物（不一定需要纯化第二PCR产物）。
    注意：NUProtein试剂盒含有阳性对照DNA（第2次PCR扩增子），可用作体外转录反应的阳性对照。
  3. 将样品在37℃下在块状培养箱中孵育3小时。
    注意：孵育时间取决于mRNA的类型和长度，可能在30分钟到3小时之间变化。也可以使用水培养箱代替块培养箱。
  4. 运行1μl转录反应样品可加载到琼脂糖凝胶（1.5％[w / v]在1x TAE缓冲液中）电泳，以检查mRNA的数量和质量（图1）。＆nbsp;
  5. 每个样品加入10μl4M乙酸铵和100μl99.5％乙醇（总体积：124μl/样品。
  6. 通过温和涡旋或轻拍混合样品，并在离心几秒后在-20℃下孵育20分钟。
  7. 将样品在17,700 x g 下于4°C离心20分钟，并小心弃去上清液。
  8. 重复离心几秒钟，用移液管完全除去残留的溶液。
  9. 通过保持管盖打开约10分钟来干燥颗粒。
  10. 每个样品加入70μl不含RNase的水，并在室温下孵育约15分钟。
  11. 通过轻轻敲打并离心几秒钟将颗粒充分溶解。
3. 体外蛋白质合成
  1. 准备以下翻译反应主混合物（对于一个样品）在冰上的1.5ml管中：
    20μl小麦胚芽提取物（WGE）（试剂盒中提供）
    20μl氨基酸混合物（AAM）（试剂盒中提供）
  2. 轻轻混合翻译反应主混合物，在室温下孵育15分钟。
    注意：WGE和AAM的预孵育可以提高翻译效率。
  3. 将40μl翻译反应混合物小心地加入70μl制备的mRNA中（总体积：110μl/样品）。
    注意：添加时不要泡泡。通过向70μl不含RNase的水中添加40μl翻译反应混合物，使AlphaScreen ® 阴性对照。
  4. 将样品在16°C孵育10小时，无需搅拌。
  5. 将样品在17,700 x g 下在4℃下离心10分钟，并将上清液（约118μl）转移到新管中。
  6. 在新管中混合1μl体外 - 合成蛋白，4μl4xSDS样品缓冲液，1μl2M DTT和6μl水。
    注意：剩余的蛋白质样品可以在-80°C下储存。我们建议使用液体N 2 对样品进行快速冷冻。重复的冻融循环降低了合成蛋白质的活性。当使用冷冻蛋白进行任何测定时，请用手快速解冻样品。
  7. 将蛋白质样品在70℃加热20分钟，并在10％（w / v）聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE，并通过用抗DYKDDDD标签抗体进行蛋白质印迹确认合成的靶蛋白。
AlphaScreen ®检测
1. 通过退火制备双链DNA探针对于AlphaScreen ®，检测蛋白质与DNA之间的相互作用，制备生物素化（目标样品）和非生物素化（检测对照）50 bp DNA探针。为了获得稳定的AlphaScreen ®结果，我们建议在中心区域设计含有目标转录因子的推定DNA结合序列的DNA探针（从探针的5'末端起11 bp到40 bp [图图2A]）。
  1. 将20μl20μM生物素化的50 bp单链DNA（或20μl20μM非生物素化的50 bp单链DNA）和20μl20μM互补未修饰的50 bp单链DNA混合在1.5 ml管中（总体积）：40μl）。
  2. 将DNA混合物在95°C孵育10分钟，让其冷却至RT。
    注意：双链DNA探针可以在-20°C下保存。
  3. 通过聚丙烯酰胺凝胶（12％w / v）电泳检查退火的双链DNA探针（图2B）。
    注意：同时为阴性对照制备DNA探针，其不含任何推定的靶转录因子的DNA结合序列。如果需要，还要准备含有靶序列突变的DNA探针。
  图2. AlphaScreen ®的DNA探针示意图。 A.退火双链DNA探针的示意图。黑色线条和框表示支架区域（长度为10个碱基）。红线和框表示含有靶转录因子的推定DNA结合序列的区域。 B.DNA探针的聚丙烯酰胺凝胶（10％）电泳。泳道1：DNA标记（2-log梯），泳道2：5'-生物素化的50碱基单链DNA，泳道3：互补的50碱基单链DNA，泳道4：退火的双链DNA。电泳后，聚丙烯酰胺凝胶用溴化乙锭染色。
2. 使用FLAG（M2）检测试剂盒进行AlphaScreen ®检测
  1. 准备以下蛋白质-DNA结合混合物（总体积：13μl/样品）：
    2.5μl10x对照缓冲液[在FLAG（M2）检测试剂盒中提供]
    2.5μl0.1％（w / v）吐温® 20
    2.5μl的1％（w / v）BSA
    1μl1ng /μldAdT
    加入4.5μl超纯水。
    注意：根据目标转录因子，应使用dGdC代替dAdT。
  2. 将13.0μl蛋白质-DNA结合混合物分配到384孔板中，加入2μl625nM的双链DNA探针和4倍稀释的FLAG标记的靶转录因子蛋白。
    注意：另外加入2μl4倍稀释的阴性对照蛋白。
  3. 在室温下孵育蛋白质-DNA结合混合物1小时。
    注意：合成蛋白的稀释范围取决于靶转录因子的特征。稀释2至10倍可用于该测定。此步骤不需要在黑暗条件下孵育。
  4. 加入4μl40倍稀释（用超纯水）受体珠子，在室温下孵育1小时。
    注意：此步骤不需要在黑暗条件下孵育。
  5. 加入4μl40倍稀释（用超纯水）供体珠粒，在室温下在黑暗中孵育1小时至12小时（总体积：25μl）。
    注意：为确保印版在黑暗中，请用铝箔包裹并将其取下，然后再将其放入Alpha读板器中。
  6. 通过EnSpire TM Alpha Plate Reader检测信号。在680nm激发后，520和620nm之间的发射波长被测量为AlphaScreen ®单位。

数据分析

将来自生物素化DNA探针混合物的信号强度除以来自非生物素化DNA探针混合物的信号强度。该信号可以用作绘制图形的“相对信号强度”。
注意：来自阴性对照（不含靶蛋白）的信号强度通常显示非常低的信号。＆nbsp;
将来自3个技术重复的数据组合用于统计分析，并且使用不同批次的蛋白质的相同实验重复至少3次，具有类似的结果。
注意：AlphaScreen ®结果的一个例子可以在2018年Mabuchi 等人的图4B和4C中找到。，2018。作为表示数据的另一种方式，你也可能是能够显示所有信号，包括来自阴性对照的信号。

笔记

在该方案中，我们使用由我们的体外转录/翻译系统合成的蛋白质。然而，可以使用通过其他实验室方案合成的蛋白质（例如，使用细菌，酵母和任何其他系统）。
在该方案中，我们使用FLAG ®标记的蛋白质。但是，只要检测试剂盒“AlphaScreen ® Fusion标签，就可以使用其他蛋白质标签（例如，GST，6-Histidine，c-myc和HA） “可从PerkinElmer获得（另请参见网站： www.perkinelmer.com/alphascreen ）。

食谱

100x TAE缓冲区
400 mM Tris-HCl
400 mM冰醋酸助剂
10mM EDTA，pH 8.0
10倍装染料
50％（w / v）甘油
0.9％（w / v）SDS
10 mM EDTA，pH 8.0
0.05％（w / v）溴酚蓝
0.05％（w / v）二甲苯蓝
4x SDS样品缓冲液
200mM Tris-HCl，pH 6.8
40％（w / v）甘油
8％（w / v）SDS
0.08％（w / v）溴酚蓝
10x运行缓冲区
250 mM Tris
1.92 M甘氨酸
1％（w / v）SDS
转移缓冲区
192 mM甘氨酸
20％（w / v）甲醇
25mM Tris
10x PBS
1.37 M NaCl
81 mM Na 2 HPO 4
26.8 mM KCl
14.7mM KH 2 PO 4
阻塞缓冲区
1x PBS
1％（w / v）无脂脱脂奶粉
0.1％（w / v）Tween ® 20

致谢

这项工作得到了教育，文化，体育，科学和技术资助科学研究创新领域的支持26113508到HT，JSPS KAKENHI（第13J10800号）和领先研究生院计划“综合研究生教育和绿色自然科学研究“，MEXT，日本到MN，教育，文化，体育，科学和技术部（日本）的创新领域科学研究资助（编号23120520和25120718），JSPS KAKENHI （第15H05956号）至YT 体外蛋白质合成改编自Nomoto和Tada，2018a和2018b以及Mabuchi et al。，2018。用于蛋白质-DNA相互作用的AlphaScreen改编自Mabuchi et al。，2018。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Chalfie。 M.，Tu，Y.，Euskirchen，G.，Ward，W。W.和Prasher，D.C。（1994）。绿色荧光蛋白作为基因表达的标记。 Science 263（5148）：802-805。
Mabuchi，K.，Maki，H.，Itaya，T.，Suzuki，T.，Nomoto，M.，Sakaoka，S.，Morikami，A.，Higashiyama，T.，Tada，Y.，Busch，W。 Tsukagoshi，H。（2018）。 MYB30将ROS信号，根细胞伸长和植物免疫反应联系起来。 Proc Natl Acad Sci USA 115（20）：E4710-E4719。
Nomoto，M。和Tada，Y。（2018a）。使用多功能引物设计通过两步PCR进行无克隆蛋白质合成的无克隆模板DNA制备3'-UTR短。 Genes Cells 23（1）：46-53。
Nomoto，M。和Tada，Y。（2018b）。植物转录因子的无细胞蛋白质合成。方法MolBiol 1830：337-349。