材料和试剂

Corning Costar Stripette血清移液器（Corning，Sigma-Aldrich，目录号：CLS4488-50EA）
涂有环氧硅烷的载玻片（Schott，目录号：1066643）
微阵列杂交盒（Arrayit Corporation，blue：AHCTZ，green：AHCP，gold：AHCC）
ProPlate载玻片模块（Grace Bio-Labs，目录号：GBL246861-2EA）
标准96孔PCR板（Steinbrenner Laborsystem，目录号：SL-PP96-4L）
微孔板，384孔（Greiner Bio-One，目录号：781281）
PCR密封（4titude，目录号：4ti-0500）
quadriPerm chamber（SARSTEDT，目录号：94.6077.307）
大肠杆菌 BL21野生型细菌（GE Healthcare）
6x DNA上样染料（Thermo Scientific，目录号：R0611）
Alexa Fluor 647-缀合的山羊抗人IgA，IgG，IgM（Jackson Immuno Research，目录号：109-605-064）
Agarose NEEO超高品质（Carl Roth，目录号：2267.4）
甜菜碱一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：14300）
牛血清白蛋白（Carl Roth，目录号：8076.3）
氯化钙（Carl Roth，目录号：CN93.2）
脱氧核苷酸（dNTP）溶液组（New England Biolabs，目录号：N0446S）
磷酸二钠（Neolab Migge GmbH，目录号：4770.1000）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Thermo Scientific，目录号：R0861）
乙二胺四乙酸（Carl Roth，目录号：8043.2）
GeneRuler 1 kb DNA Ladder（Thermo Scientific，目录号：SM0311）
冰醋酸（Sigma-Aldrich，目录号：695084）
Glycine（Gerbu，目录号：56406）
硫酸镍（II）六水合物（Sigma-Aldrich，目录号：227676）
次氮基三乙酸（NTA）（Sigma-Aldrich，目录号：72559）
无核酸酶水（Life Technologies，目录号：AM9922）
小鼠产生的单克隆抗V5-Cy3抗体（Sigma-Aldrich，目录号：V4014-100UG）
磷酸一钾（Carl Roth，目录号：3904.1）
Penta-His Alexa Fluor 647 Conjugate（QIAGEN，目录号：35370）
peqGreen（VWR，peqLab品牌，产品目录号：732-3196）
氯化钾（Carl Roth，目录号：6781.1）
Q5高保真DNA聚合酶，100单位和缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0491S）
S30 T7高产蛋白表达试剂盒（Promega，目录号：L1110）
SuperBlock（PBS）阻断缓冲液（Thermo Scientific，目录号：37515）
Taq DNA聚合酶（1,000 U）和缓冲液（QIAGEN，目录号：201205）＆nbsp;
Tris base（西格玛奥德里奇，目录号：SLBP5070V）
碳酸钠（Na 2 CO 3 ）（Carl Roth，目录号：A135.1）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888-1KG-M）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Carl Roth，目录号：6885.1）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：1310-73-2）
胰蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：T7293-250G）
Tween-20（西格玛奥德里奇，目录号：P1379）
酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625）
完整的蛋白酶抑制剂（罗氏，目录号：04693132001）
KH 2 PO 4 （默克，目录号：1048711000）
MgCl 2 （Carl Roth，目录号：KK36.1）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
BSA阻断缓冲液（见食谱）
NTA解决方案（见食谱）
镍溶液（见食谱）
LB介质（见食谱）
Opti-Solution（参见食谱）
10x PBS（见食谱）
PBST（见食谱）
TAE（50x）（见食谱）

设备

移液器（Gilson，PIPETMAN Classic，目录号：F144566，F144057M，F144055M）
载玻片染色和储存系统（Sigma-Aldrich，目录号：BAF441800000）
Biofuge，Pico（Hereaus Instruments，DJB Labcare 75003235）
磁力搅拌器（IKA，IKAMAG REO）
离心机5810R（Eppendorf，型号：5810R，目录号：5811000010）
凝胶文件系统（Azure C200 Biosystems，目录号：170-8195）
均质机EmulsiFlex-C5（AVESTIN，目录号：0506394）
层流罩（Hereaus Instruments，型号：LaminAir HB2436）
微电脑电泳电源（型号：E835）
Mixmate微孔板混合器（Eppendorf，型号：5353 000.014）
NanoDrop分光光度计ND-1000（Thermo Scientific，型号：7934）
Nanoplotter 2.0（GeSIM，型号：060-308）
Orbital Shaker Unimay 1010（Heidolph，型号：543-12310-00）
Power Scanner（Tecan，型号：30038387）
LifeEco热循环仪（BioER，型号：685115）＆nbsp;
通风炉（neoLab，目录号：7-9155）
4°C冰箱（neoLab，目录号：10064）
-20°C冰柜（博世，型号GIV21AF30）

软件

Fuzznuc（EMBOSS， http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs /emboss/apps/fuzznuc.html ）
软件NPC16 V2.15（GeSiM，Radeberg，德国）
PowerScanner V1.2（Tecan Trading AG，瑞士）
GenePix Pro 6.0（Molecular Devices，Sunnyvale，USA）
R Studio（R版本3.3.2， https://www.rstudio.com/ ）
MELTTEMP（ http://www.biology.wustl.edu/gcg/melttemp.html）
Excel（Microsoft Cooperation，Redmond，USA）

程序

底漆和底漆设计
1. 对于初始PCR，设计基因特异性引物，使得每个引物对在每个ORF的起始和末端结合，并产生框内PCR产物。引物长度应在16至24个核苷酸（nt）之间。
  注意：对于引物设计，可以使用ORF表信息文本文件和参考基因组的fasta序列生成Perl脚本来设计引物。
2. 用MELTTEMP计算不同长度的可能引物的解链温度（ http：//www.biology。 wustl.edu/gcg/melttemp.html ）。
  注意：可以使用其他软件包或网站。然而，该软件被发现可用于计算整个蛋白质组项目所需的许多引物的解链温度。
3. 在45°C-55°C或55°C-65°C的熔化温度范围内选择最合适的底漆。
  注意：单个微量滴定板中使用的引物应具有相似的熔化温度。如果没有找到代表ORF末端的合适引物，可以考虑在目的基因的ATG起始密码子下游开始一个或两个三联体的引物序列。
4. 使用fuzznuc检查并计算引物的唯一性和产物长度（EMBOSS， http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/fuzznuc.html ）。
  注意：同样，可以使用其他软件包。和以前一样，这个包装在处理大量引物时非常方便。
5. 在所有5'-末端添加以下15nt的衔接子序列：正向引物：5'-atgcaccaaacccaa-3';反向引物：5'-cgcactggcatcatc-3'。＆nbsp;
6. 引物应在96孔板中合成，以便于处理;我们使用由商业提供者biomers.net（乌尔姆，德国）生产的寡核苷酸。
7. 第二次PCR的通用引物包含转录和翻译所需的所有序列[T7启动子，非翻译区（UTR），核糖体结合位点（RBS），起始密码子（ATG），T7终止子]，融合肽标签（N端6x） -His和C-末端V5标签）和与基因特异性引物共有的衔接子序列互补的序列：
  正向表达引物：
  5'-gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaagaaggagatatacatatgcatcatcatcatcatcatatgcaccaaacccaa-3'
  反向表达引物：
  5'-ctggaattcgcccttttattacgtagaatcgagaccgaggagagggttagggataggcttacccgcactggcatcatc-3'
聚合酶链反应
对每个基因进行两次连续PCR。第一次PCR扩增目的基因;第二次PCR添加了产生表达构建体所需的元件。为了测量DNA浓度，我们使用NanoDrop分光光度计，因为只需要很小的体积。但是，可以使用任何其他分光光度计。
注意：关于整体反应，基本上所有PCR扩增都成功达到约3kb的大小。对于较大的分子，虽然使用的聚合酶适合于合成长片段，但产量会有所不同。
1. 使用基因组细菌DNA作为模板进行第一次PCR。
  注意：基因组DNA可以从德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ）获得。如上文背景部分已经提到的，也可以使用由RNA制备物，现有ORF文库或任何其他可以PCR扩增的分子类型制成的cDNA作为模板。
2. 在96孔PCR板中进行所有PCR-每个基因一个孔 - 并基于相应引物对的基因长度和解链温度对基因进行分组。
3. 使用比每个96孔板内所有引物的平均解链温度低2°C的退火温度（T A ）。
4. 计算下表中列出的伸长时间（时间 E ）：＆nbsp;
5. 使用PCR热循环仪进行扩增。
6. 如下为第一次PCR制备PCR混合物：10.75μl无核酸酶H 2 O，5.0μlQ5高保真缓冲液，5.0μlQ5高保真增强剂，1.0μl10mM基因 - 特异性正向引物，1.0μl10mM基因特异性反向引物，1.0μl10mMdNTP-混合物，1.0μl基因组DNA模板（2ng /μl），0.25μlQ5高保真聚合酶。
7. 使用下面列出的PCR程序，然后在10°C下储存：＆nbsp;
8. 使用第一次PCR的1μlPCR产物作为第二次PCR的模板;在96孔PCR板中也进行第二次扩增。
9. 将第一个基因特异性扩增的剩余PCR产物储存在-20℃冷冻。
10. 用第一次PCR所用的延伸时间进行第二次PCR。
11. 如下为第二次PCR制备PCR混合物：33.5μl无核酸酶H 2 O，5.0μl10xPCR缓冲液（含10 mM MgCl 2 ），5.0μl Q-Solution（QIAGEN），2.0μl25mMMgCl 2，，1.0μl10mMdNTP-混合物，1.0μl10μM正向表达引物，1.0μl10μM反向表达引物，1.0μlDNA模板， 0.5μl Taq DNA聚合酶（QIAGEN）。
  注意：使用低质量的聚合酶可导致片上蛋白质表达不完整，并在斑点处产生更高的背景信号（例如见图1D）。
12. 使用以下PCR程序：初始变性：95°C，5分钟;变性：94°C，30秒;退火：52℃30秒;伸长率：72℃计算时间 E ;最终伸长率：72℃，10分钟。重复变性，退火和伸长35次。
13. 将PCR产物原样保存在-20°C的微量滴定板中进行长期保存，或者在4°C下进行短期保存。
14. 为了检查所有PCR在1.3％琼脂糖凝胶上的成功，通过加热溶解2.6g琼脂糖在200ml 1x TAE缓冲液中，加入10μlpeqGreen并倒入凝胶。
15. 将5μl每种PCR产物与1μl6xDNA上样染料混合，并将混合物加载到凝胶上。
16. 使用GeneRuler 1 kb梯作为尺寸标准装载至少一个通道。
17. 用电泳电源系统在约150 V和500 mA下运行凝胶30分钟。
18. 使用凝胶记录系统用紫外光分析凝胶。每个泳道的单个条带代表预期大小的DNA片段，表明PCR成功。
生成Ni-NTA载玻片
注意：所有步骤均在无菌罩的无尘环境中进行。
1. 将涂有环氧硅烷的载玻片放入无尘载玻片染色和储存系统中。
2. 通过将碳酸氢钠溶解在无菌过滤水中至浓度为2.38 M并加入NTA至0.63 M来制备NTA溶液。
3. 将NTA溶液在磁力搅拌器上于37℃搅拌4小时。
4. 将环氧硅烷涂覆的载玻片浸泡在NTA溶液中，并在设定为50rpm的轨道振荡器上在室温下孵育过夜。
5. 弃去NTA溶液，用无菌过滤水在设定为50rpm的轨道振荡器上洗涤载玻片两次，每次5分钟。
6. 用无菌过滤水冲洗载玻片并用压缩空气干燥。
7. 将载玻片在室温下在1％硫酸镍溶液中孵育6小时。
8. 用无菌过滤水冲洗载玻片。
9. 将载玻片在含有0.2M乙酸，0.2M CaCl 2，和0.1％Tween-20的Opti溶液中在室温下孵育30分钟。
10. 用无菌过滤水冲洗载玻片四次，并用压缩空气干燥。
11. 将载玻片存放在制造商的储存盒中，温度为4°C，最长可保存3个月。
发现蛋白质微阵列
在每次点样程序之前，Nanoplotter 2.0必须用ddH 2 O洗涤至少20分钟。
1. 将所有最终PCR产物各45μl转移到384孔板中。
2. 向每个孔中加入5μl5M甜菜碱，并使用微孔板混合器混合平板;将所有板在约400 x g 离心1分钟以收集底部的整个体积。
3. 将多达33个Ni-NTA涂覆的载玻片放置在Nanoplotter的载玻片上。
4. 在Nanoplotter软件中设计工作板，其中包含有关微阵列图案的信息：行数和列数，点之间的距离，到幻灯片边缘的点距离，块的数量和距离以及有关384-类型的信息井板。
5. 分别测量每个滑块的Z值（垂直轴）以保持适当的定位距离。
6. 在Excel中写入与工作板兼容的传输文件，并将其传输到Nanoplotter记事本。
7. 将每个PCR产物的每个点0.6nl转移到Ni-NTA载玻片上。
  注意：使用作为纳米绘图仪一部分的频闪仪系统进行自动检测，确认样品的正确传送。
8. 在使用前立即混合制备S30 T7高产蛋白表达试剂盒制造商提供的成分：20μlS30Premix Plus，18μlT7S30提取物和12μl无核酸酶水。
9. 将50μl表达混合物转移到384孔微孔板的新孔中。
  注意：处理表达混合物时应避免产生气泡。
10. 将Nanoplotter 2.4 nl表达混合物直接分配到表达构建体的每个点上。
  注意：通过幻灯片转移表达混合物。使用一次样品吸收，点样器的一个压电元件可产生最多800个斑点。如有必要，使用多个压电元件点样表达混合物或每个载玻片多个样品吸收。
11. 将载玻片立即放入每个储库中含有30μl无核酸酶水的微阵列杂交盒中。
12. 将杂交盒在含有湿纸巾的预热盒中于37℃孵育1小时。
13. 将盒子转移到通风烘箱中，在30°C下孵育过夜。
14. 在-20°C下储存载玻片而不失去反应性，最多3个月。
抗体染色法测定片上蛋白质表达
注意：为避免干燥，请立即执行所有后续步骤。所有洗涤和孵育步骤均在室温下进行，除非在设定为50 rpm的轨道振荡器上另有说明。
1. 从冰箱中取出幻灯片并将其放入ProPlate幻灯片模块中。
2. 用2ml BSA阻断缓冲液封闭每个载玻片1小时。
3. 在BSA阻断缓冲液中以1：1,000稀释针对蛋白质标签（Penta-His Alexa Fluor 647缀合物;单克隆抗V5-Cy3抗体）的荧光团缀合的抗体，并将混合物在4℃下孵育1小时。
4. 丢弃封闭缓冲液并用2ml PBST洗涤载玻片两次，每次5分钟。
5. 用1 ml抗体溶液孵育每个载玻片1小时。＆nbsp;
6. 从ProPlate载玻片模块中取出载玻片，将它们放入quadriPerm室中，每次用5 ml PBST洗涤3次，每次10分钟。
7. 用无菌过滤水冲洗载玻片，并使用载玻片染色和储存系统在30°C的通风烘箱中风干。
8. 在功率扫描仪中以532 nm和635 nm的激发波长扫描载玻片。
蛋白质组免疫分析
注意：为避免干燥，请立即执行所有后续步骤。所有洗涤和孵育步骤均在室温下进行，除非在设定为50 rpm的轨道振荡器上另有说明。
1. 从冰箱中取出幻灯片并将其放入ProPlate幻灯片模块中。
2. 用2ml SuperBlock封闭缓冲液封闭每个载玻片1小时。
3. 通过在含有1μg/μl E的SuperBlock封闭缓冲液中稀释血清1:33来制备患者血清样品。大肠杆菌野生型裂解物，并在4℃下孵育混合物1小时。
4. 弃去封闭缓冲液，用2ml PBST洗涤每个载玻片两次，每次5分钟。
5. 弃去PBST并用1.5 ml血清稀释液孵育1小时。＆nbsp;
6. 在SuperBlock封闭缓冲液中制备1：350稀释的二抗（Alexa Fluor 647-缀合的山羊抗人IgA，IgG，IgM），并在4℃下孵育稀释液1小时。
7. 用2ml PBST洗涤每个载玻片两次，每次5分钟。
8. 用1.5 ml 1：350稀释的二抗孵育载玻片1小时。＆nbsp;
9. 从ProPlate载玻片模块中取出载玻片，将其放入quadriPerm室中，每次用5 ml PBST洗涤3次，每次10分钟。
10. 用无菌过滤水冲洗载玻片，并使用载玻片染色和储存系统在30°C的通风烘箱中风干。
11. 使用功率扫描仪在635 nm激发波长下扫描载玻片（图1）。
注意： E.大肠杆菌裂解液可以使用以下方案生产。
1. 用 E接种200ml LB培养基。大肠杆菌 BL21野生型，将培养基在37℃下在设定为150转/分的定轨振荡器上培养过夜。
2. 将细菌悬浮液在3,000℃下在4℃下离心10分钟。
3. 弃去上清液，将沉淀重悬于10ml PBS中（该悬浮液可在-20℃下保存）。
4. 向10 ml细菌悬浮液中加入2 mM DTT和500μlFullProtease抑制剂。
5. 用均化器裂解细菌。
6. 在4℃下以22,000 x g 离心裂解物30分钟。
7. 取上清液，测定蛋白质浓度。
8. 将澄清的裂解物与无水甘油以1：1的比例混合。
9. 将裂解液储存在-20°C。

数据分析

采集和分析软件GenePix Pro 6.0用于从扫描仪生成包含每个处理过的载玻片的平均荧光强度（MFI）值的gpr文件。使用统计编程语言R分析gpr文件。
＆NBSP;为了确定分别靶向末端6xHis-或V5-标签的抗体的片上蛋白质表达程度，将获得的gpr文件导入R，并将每个蛋白质斑点的MFI与阴性对照斑点的MFI值进行比较。（由缺乏DNA模板的对照PCR制成）。如果蛋白质的最终MFI（6xHis或V5信号）超过对照斑点的平均MFI值加上五个标准偏差，则认为该蛋白质被表达。
＆NBSP;对于蛋白质组免疫测定的分析，将获得的所有相关微阵列实验的gpr文件导入R中，并将阈值定义为所有阴性对照的平均MFI加上五个标准偏差。在继续进行标记选择之前，对所有扫描的幻灯片进行视觉质量控制，以识别可能的伪影。此外，每张幻灯片的MFI值都是根据它们在幻灯片上的位置绘制的。这允许识别单个幻灯片上的技术效果，例如背景的渐变或MFI值。显示MFI值高于阈值的所有抗原被认为与相应患者血清样品的抗体反应。为了允许不同幻灯片之间的比较，MFI信号通过以下方式计算：

MFI信号=（抗原的MFI）/（阈值的MFI）

1表示与某种抗原的显着反应性。

食谱

BSA阻断缓冲液
PBST中2％BSA
NTA解决方案
90克次氮基三乙酸
150克NaHCO 3
将ddH 2 O加入750 ml
镍溶液
将10g NiSO 4 溶解在1,000ml ddH 2 O中
LB-medium
10克胰蛋白胨
5克NaCl
5克酵母提取物
加入800毫升ddH 2 O
用NaOH调节pH至7.4 将ddH 2 O加入1,000 ml并高压灭菌
Opti-Solution
22.4克CaCl 2
12毫升冰醋酸
1毫升吐温-20
将ddH 2 O加入1,000 ml
10x PBS
80克NaCl
2 g KH 2 PO 4
11.1g Na 2 HPO 4
2克KCl
将ddH 2 O加入1,000 ml
PBST
100毫升10倍PBS
5毫升10％吐温-20
将ddH 2 O加入1,000 ml
TAE（50x）
242克Tris base
57.1毫升冰醋酸
100毫升0.5毫升EDTA
将ddH 2 O添加到1,000 ml
使用前稀释至1倍

致谢

在早期阶段，作为Affinomics联盟和由德国联邦教育与研究部（BMBF）资助的PaCaNet项目的一部分，欧盟支持工作。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Angenendt，P.，Kreutzberger，J.，Glokler，J。和Hoheisel，J。D.（2006）。通过无细胞原位表达生成高密度蛋白质微阵列未纯化的PCR产物。 Mol Cell Proteomics 5（9）：1658-1666。
他，M。和Taussig，M。J.（2001）。通过无细胞表达和原位从DNA中一步生成蛋白质阵列固定化（PISA方法）。 Nucleic Acids Res 29（15）：E73-73。
He，M.，Stoevesandt，O.，Palmer，E.A.，Khan，F.，Ericsson，O。和Taussig，M。J.（2008）。从DNA阵列打印蛋白质阵列。 Nat Methods 5 （2）：175-177。
Hufnagel，K.，Lueong，S.，Willhauck-Fleckenstein，M.，Hotz-Wagenblatt，A.，Miao，B.，Bauer，A.，Michel，A.，Butt，J.，Pawlita，M.，Hoheisel ，JD和Waterboer，T。（2018）。使用片上产生的全蛋白质组芯片沙眼衣原体的免疫表现 in situ 表达。 Sci Rep 8（1）：7503。
Ramachandran，N.，Hainsworth，E.，Bhullar，B.，Eisenstein，S.，Rosen，B.，Lau，A.Y.，Walter，J。C. and LaBaer，J。（2004）。自组装蛋白质微阵列。 Science 305（5680））：86-90。
Syafrizayanti，Lueong，S.S.，Di，C.，Schaefer，J.V.，Pluckthun，A。和Hoheisel，J.D。（2017）。通过个别患者样本制作的蛋白质微阵列进行个性化蛋白质组分析。 Sci Rep 7：39756。
ORFeome协作。（2016）。 ORFeome Collaboration：基因组规模的人类ORF克隆资源。 Nat Methods 13（3）：191-192。