材料和试剂

1.5 ml MaxyClear Microtubes（Axygen，目录号：MCT-150-C）
0.2 ml聚丙烯PCR管（Axygen，目录号：PCR-0208-C）
移液器吸头（Corning，Axygen ®）
0.22μmMillipore过滤器（Millipore，目录号：R7MA69670）
飞行种群（所有 Drosophila 菌株存放在清华飞行中心）
1. y sc v nanos-integgrase; attP40 （TB00016）
2. y sc v nanos-integrase ;; attP2 （TB00018）
3. y sc v （TB00077）
4. y sc v; Gla Bc / CyO （TB00023）
5. y sc v ;;博士，e / TM3，Sb （TB00139）
Trans5α化学感受态细胞（Transgen Biotech，目录号：CD201-01）
flySAM（氨苄青霉素抗性，质粒图谱如图1所示）
BbsI（New England Biolabs，目录号：R0539L）
NheI（New England Biolabs，目录号：R3131L）
SpeI（New England Biolabs，目录号：R3133L）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202L）
碱性磷酸酶，小牛肠道（CIP）（New England Biolabs，目录号：M0290S）
AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AXYGEN，目录号：AP-MN-P-250）
AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（AXYGEN，目录号：AP-GX-250）
PurePlasmid Mini Kit（CWBiotech，目录号：CW0500M）
正向引物1：5'-TCAACAAACGaacaataggacac-3'
反向引物1：5'-aAAAAAGCACCGACTCGGTG-3'
正向引物2：5'-ACATCAGGAAAGAGCAGTTGAG-3'
反向引物2：5'-TTGCTCACCTGTGATTGCTCC-3'
50x TAE（双螺旋，目录号：P0309A）
琼脂糖（Invitrogen，目录号：0000602315）
LB粉末（BD，目录号：2171199）
KCl（AMRESCO，目录号：7447-40-7）
Tris-HCl（AMRESCO，目录号：1185-53-1）
EDTA（AMRESCO，目录号：60-00-4）
NaCl（AMRESCO，目录号：7647-14-5）
氨苄青霉素（Solarbio，目录号：A8180）
溴化乙锭（Sigma，目录号：E8751）
GoTag Green Master Mix，2x（Promega，目录号：000179370）＆nbsp;
磷酸钠缓冲液（见食谱）
10x注射缓冲液（见食谱）
10x退火缓冲液（见食谱）
LB（Luria Bertani）中等（见食谱）
1x TAE（见食谱）
1.5％琼脂糖凝胶（见食谱）

图1. flySAM构建体的图谱。 dCas9受10×UAS和 Drosophila 合成核心启动子（DSCP）的控制，其次是VP64。 dCas9-VP64和MCP-P65-HSF1由T2A自切割肽介导和分离。 ftz内含子位于CRISPRa组分和SV40 polyA尾之间。两个BbsI位点之间的灰色区块是检测sgRNA是否在U6：2调节序列控制下的标记。两种可以促进基因表达的吉普赛元素被用于侧翼CRISPRa组分。 attB序列和朱红色 + 标记也包括在该质粒中。

设备

移液器（Eppendorf）
微波炉（三洋，型号：EM-2509EB1）
高压灭菌器（三洋，型号：MLS-3780）
PCR热循环仪（Eppendorf，Mastercycler nexus GSX1）
微量离心机（Eppendorf，型号：5417R）
DNA电泳仪（Bio-Rad）
NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）

程序

Oligo指定＆nbsp;
1. 在靶基因TSS的-100至-400范围内选择NGG上游的20nt长sgRNA
  应考虑以下参数以确保sgRNA的质量：
  1. TTTT序列不应该在20nt sgRNA序列中，因为它是转录终止信号。
  2. 为避免脱靶，sgRNA的≥18nt的靶向序列不应与其他基因组位点匹配。
  3. 最佳sgRNA通常携带高GC含量，通常超过50％。
2. 为了合成20nt DNA序列，应将来自BbsI的突出序列5'-TTCG-3'加入到正向引物中，并将5'-aaac-3'加入到反向互补引物中。
  例如，5'-NNNAGCAATCGA CATGCAAGCGGCTCGGAGCC GCACCTGCNNN-3'
  （带下划线的 AGG 是PAM序列）
  转发： 5' - ttcg CATGCAAGCGGCTCGGAGCC-3'
  反向： 5' - aaac GGCTCCGAGCCGCTTGCATG-3'
3. 用ddH 2 O重悬寡核苷酸至最终20μM并建立退火反应：
骨干准备
1. BbsI用于线性化flySAM载体。
2. 运行1.5％琼脂糖凝胶。应该可以看到两个条带（图2），一个是大约700bp（这个间隔区可以帮助评估切割效率，然后通过PCR选择正确的克隆，因为正确克隆的PCR产物的大小不同于不正确的克隆），另一个是大约14 kb。切割并收集14kb条带，并按照标准方案通过AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒提取骨架。用50μlddH 2 O洗脱DNA，用NanoDrop 2000测量DNA浓度，应该在50 ng /μl左右。
  
  图2.BbsI消化的flySAM2.0的示例凝胶。 M是DNA标记。 flySAM2.0是BbsI消化的产物。
结扎
1. 用线性化的flySAM载体连接退火的sgRNA产物
  
  按照标准方案将2-5μl连接产物转化到10μlTrans5α化学感受态细胞中，并涂布在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。将这些板在37℃下以倒置状态孵育过夜。
2. 使用以下引物进行菌落PCR：
  正向引物1：5'-TCAACAAACGaacaataggacac-3'
  反向引物1：5'-aAAAAAGCACCGACTCGGTG-3'
  热循环条件是：
  
  来自正确克隆的PCR产物的大小约为300bp，而没有条带或1,000bp条带是不正确的。
3. 在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB培养基中接种正确的克隆。
4. 使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit培养细菌和miniprep质粒。
Sanger测序进一步确认插入
使用以下引物通过Sanger测序确认flySAM-sgRNA质粒：
正向引物1：5'-TCAACAAACGaacaataggacac-3'
注意：
1. 如果只需要克隆一个sgRNA，下一步就是直接进入程序J.＆nbsp;
2. （可选）如果需要激活两个或更多基因，换句话说，需要克隆两个或更多个sgRNA，可以在程序D之后执行下一个程序：＆nbsp;
片段准备
1. 由NheI和SpeI双重消化flySAM（一个sgRNA被克隆到其中）
2. 运行琼脂糖凝胶。应该可以看到两个波段，一个约为1 kb，另一个约为14 kb。切割并收集1kb条带，并按照标准方案通过AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒提取片段。用50μlddH 2 O洗脱DNA，用NanoDrop 2000测量DNA浓度，应该在40 ng /μl左右。
骨干准备
1. 通过NheI或SpeI消化flySAM（另一种与程序E中不同的sgRNA已被克隆到其中）。
2. 加入0.2μlCIP并在37°C下孵育8分钟。
3. 通过AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒纯化消化的产物。
结扎和转型
将程序E中的片段连接到程序F的骨干。程序类似于程序C
殖民地鉴定
1. 以下引物用于菌落PCR：
  正向引物2：5'-ACATCAGGAAAGAGCAGTTGAG-3'
  反向引物2：5'-TTGCTCACCTGTGATTGCTCC-3'
  热循环条件是：
  
  正确的克隆大约是800bp。
2. 在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB培养基中接种正确的克隆。
3. 使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit培养细菌和miniprep质粒。
通过限制酶消化进一步确认正确克隆
1. 通过NheI和SpeI双重消化质粒
2. 运行琼脂糖凝胶，一个条带应该是大约2kb（如果两个sgRNA一起），如果质粒是正确的，另一条带大约是13kb。
纯化和显微注射
1. 对于显微注射，应纯化质粒（~10mg）。 PurePlasmid Mini Kit根据生产商的规格使用。最后将质粒DNA在70μl1x注射缓冲液中洗脱。每种样品的适当浓度为100 ng /μl-200 ng /μl，可通过NanoDrop 2000测定。
2. 准备注射的胚胎并将转基因载体注射到工具果蝇的胚胎中作为标准程序（染色体II y sc v nanos-integrase; attP40 。染色体III y sc v nanos-integrase ;; attP2 ）（Ni et al。，2011）。
3. 注射的胚胎应保持在25°C和60％湿度至成年期（G0）。
选择转基因苍蝇
♂G0和♀G0都应该与 y sc v; 的异性交叉。由于flySAM转基因带有 vermillion （v + ）的拷贝，其拯救了从注射液中遗传的突变朱红色（v）等位基因。因此，转化体将具有暗红色野生型（v + ）眼睛颜色，并且应选择v + G1（图3）。

图3.眼睛颜色筛查标记。转化体有一种深红色野生型（v + ）眼睛颜色（左），而未经过基因改造的果蝇有浅红色（v - ）眼睛颜色（右）。
1. 对于来自♂G0的G1♂转化体，遵循以下顺序步骤
  1. 将兄弟姐妹交给 y sc v的处女; ;; Dr，e / TM3，sb （对于3 rd 染色体插入）或 y sc v; Gla Bc / CyO （对于2 nd 染色体插入）。
  2. 收集具有v + （野生型）眼睛颜色和 CyO 或 TM3 的♂和处女♀兄弟姐妹，并将它们相互交叉。
  3. 保持纯合的苍蝇（保持股票作为平衡的杂合子，以防纯合蝇不健康）。
2. 对于来自♀G0的G1♂转化体，遵循以下顺序步骤
  1. 越过 y sc v ;; 的处女♀
  2. 越过v + ♂到 y sc v的原始; ;; Dr，e / TM3 ，sb（对于3 rd 染色体插入）或 y sc v; Gla Bc / CyO （对于2 nd 染色体插入）。
  3. 收集具有v + （野生型）眼睛颜色和 CyO 或 TM3 的♂和处女♀兄弟姐妹，并将它们相互交叉。
  4. 保持纯合的苍蝇（保持股票作为平衡的杂合子，以防纯合蝇不健康）。
3. 对于来自♂或♀G0的♀转化体，请遵循以下顺序步骤
  1. 越过 y sc v ;; 的♂
  2. 越过v + ♂到 y sc v的处女;;
  3. 越过v + ♂到 y sc v的原始; ;; Dr，e / TM3，sb （对于3 rd 染色体插入）或 y sc v; Gla Bc / CyO （对于2 nd 染色体插入）。
  4. 收集具有v + （野生型）眼睛颜色和 CyO 或 TM3 的♂和处女♀兄弟姐妹，并将它们相互交叉。
  5. 保持纯合的苍蝇（保持股票作为平衡的杂合子，以防纯合蝇不健康）。

数据分析

如果我们想激活两个或更多个基因，程序D中用于DNA测序的引物不能用于测序，因为两个U6：2启动子在一个载体中。菌落鉴定和酶消化更有效地鉴定正确的克隆。

食谱

0.2 M磷酸钠缓冲液（pH 6.8）（原液）
51毫升0.2M NaH 2 PO 4
49ml 0.2M Na 2 HPO 4
在室温下储存
1. 0.2 M Na 2 HPO 4
  在1L ddH 2 O中溶解71.6g Na 2 HPO 4 •12H 2 O，充分混合< br /> 在室温下储存
2. 0.2M NaH 2 PO 4
  在1L ddH 2 O中溶解31.2g Na 2 HPO 2 •2H 2 O，充分混合< br /> 在室温下储存
10x注射缓冲液
1 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.8）
50 mM KCl
准备无菌蒸馏水，并通过0.22μmMillipore过滤器过滤
它可以在-20°C下储存一年
10x退火缓冲区
100mM Tris-HCl（pH 7.5）
10 mM EDTA
1 M NaCl
它可以在室温下储存一年
LB（Luria Bertani）中等
将25g粉末溶于1L ddH 2 O中，充分混合
在121℃下高压灭菌15分钟
1x TAE
20毫升50倍TAE
980 ml ddH 2 O
在室温下储存
1.5％琼脂糖凝胶
1.5克琼脂糖
100毫升1x TAE
加热溶液以溶解微波炉中的琼脂糖
加入溴化乙锭至终浓度为0.2μg/ ml

致谢

这项工作得到NIH Grants R01GM084947和R24OD021997以及美国国立卫生研究院通用医学科学部NIH的Ruth L. Kirschstein国家研究服务奖F32GM113395的支持。这项工作得到了中华人民共和国科学技术部国家重点技术研究发展计划（2015BAI09B03,2016YFE0113700）和国家自然科学基金（31571320）的支持。

利益争夺

作者没有任何可能的利益冲突。

参考

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