材料和试剂

玻璃瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：C4010-LV1）
玻璃载玻片（Sigma-Aldrich，目录号：S8902）
铝箔（Sigma-Aldrich，目录号：326852）
注射器（Proquinorte）
镍网格栅：用于预嵌入电子显微镜的网格（电子显微镜科学，目录号：G-150 Ni），存储温度：RT
镍单槽formvar涂层网格（孔径网格：用于嵌入电子显微镜的网格）（电子显微科学，目录号：FFGA1000-Ni-50），存储温度：RT
抗体
Lowicryl HM20试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：15924），储存温度：RT
VECTASTAIN Elite ABC HRP试剂盒（过氧化物酶，标准品）（Vector Laboratories，目录号：PK-6100），贮存温度：
4°C
HQ Silver：用于EM的银增强试剂盒（Nanoprobes，目录号：2012），储存温度：-20°C
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906），储存温度：4°C
3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物（DAB）：C 12 H 14 N 4 •4HCl•xH 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：D5637），储存温度：-20℃
乙醇绝对值：CH 3 CH 2 OH（PanReac AppliChem，目录号：A1613），储存温度：RT
甘油：HOCH 2 CH（OH）CH 2 OH（Sigma-Aldrich，目录号：G9012），储存温度：室温
甘氨酸：NH 2 CH 2 COOH（Sigma-Aldrich，目录号：G8898），储存温度：RT
盐酸氯胺酮/盐酸甲苯噻嗪麻醉剂溶液（Sigma-Aldrich，目录号：K4138），储存温度：4°C
甲醇：CH 3 OH（Sigma-Aldrich，目录号：322415），储存温度：RT
丙烷：CH 3 CH 2 CH 3 （Sigma-Aldrich，目录号：536172），储存温度：RT
（R） - （+） - 环氧丙烷：C 3 H 6 O（Sigma-Aldrich，目录号：540048），储存温度：RT
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：84510），储存温度：RT
叠氮化钠（NaN 3 ）（PanReac AppliChem，目录号：122712.1609），储存温度：RT
硼氢化钠：NaBH 4 （Sigma-Aldrich，目录号：71320），储存温度：RT
四氧化锇水溶液（4％）（Electron Microscopy Sciences，目录号：19150），储存温度：RT
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（默克，目录号：1.06586.1000），储存温度：室温（RT）（用于配方1-） 3）
环氧包埋介质，固化剂DDSA：C 16 H 26 O 3 （Sigma-Aldrich，目录号：45346），储存温度：RT（在食谱6中使用）
环氧包埋介质，固化剂MNA：C 10 H 10 O 3 （Sigma-Aldrich，目录号：45347），储存温度：RT（在食谱6中使用）
环氧嵌入介质：Epon TM 812替代品（Sigma-Aldrich，目录号：45345），储存温度：RT（用于配方6）
用于合成的水溶液中的戊二醛（25％）：C 5 H 8 O 2 （Merck，目录号：8.20603.1000），储存温度：4°C（用于配方1）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758），储存温度：RT（用于配方2）
硝酸铅（II）:( PbNO 3 ） 2 （PanReac AppliChem，目录号：131473），储存温度：RT（用于配方8）
N-苄基二甲胺：C 9 H 13 N（Sigma-Aldrich，目录号：185582），储存温度：RT（用于配方6）
多聚甲醛：（CH 2 O）n（Merck，目录号：1.04005.1000），储存温度：RT（用于配方1）
苦味酸溶液（1.3％）溶于H 2 O（饱和）:( O 2 N） 3 C 6 H 2 OH（Sigma-Aldrich，目录号：P6744），储存温度：RT（用于配方1）
聚（乙二醇）（PEG）：C 2n H 4n H 2 O n + 1 （Sigma- Aldrich，目录号：202444），储存温度：RT
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541），储存温度：RT（用于配方2）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：229806），储存温度：RT（用于配方2）
氯化钠（NaCl）（PanReac AppliChem，目录号：131659.1211），储存温度：RT（用于配方2-4）
氢氧化钠颗粒（PanReac AppliChem，目录号：131687.1211），储存温度：RT（用于配方8）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 •H 2 O）（PanReac AppliChem，目录号：131965.1211），储存温度：RT（用于食谱1-3）
柠檬酸三钠2水合物：Na 3 C 6 H 5 O 7 •2H 2 O（默克，目录号：6448），储存温度：4°C（用于配方8）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100），储存温度：RT（用于配方5）
Trizma ®碱：NH 2 C（CH 2 OH） 3 （Sigma-Aldrich，目录号：T1503 ），储存温度：RT（用于配方4和5）
Trizma ®盐酸盐：NH 2 C（CH 2 OH） 3 •HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T3253），储存温度：RT（用于配方4）
乙酸双氧铀：UO 2 （CH 3 COO） 2 （电子显微镜科学，目录号：22400），储存温度：RT（用于食谱7）
固定解决方案（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS 1x）（见食谱）
0.1 M磷酸盐缓冲液（0.1 M PB）（见食谱）
三氯化氢缓冲盐水（TBS 1x）（见食谱）
含Triton X-100（TBST）的Tris缓冲盐水（见食谱）
Epon树脂（见食谱）
乙酸双氧铀（2％，水溶液）染色溶液（见食谱）
Reynold的柠檬酸铅染色解决方案（见食谱）

设备

Erlenmeyer烧瓶（Sigma-Aldrich，目录号：Z567868）
Shaker（Heidolph，Duomax 1030）
烤箱（Grupo Selecta，Dryterm）
Vibratome（Leica Biosystems，型号：Leica VT1000 S）
超级白金刀（吉列）
Ultramicrotome（RMC产品，型号：PowerTome XL）
Histo 6毫米金刚石刀45°（硅藻土）
超2.4毫米钻石刀45°（硅藻土）
透射电子显微镜（飞利浦，型号：EM208S）
数码Morada相机（奥林巴斯SIS Morada相机）
冷冻固定装置（Reichert-Jung，型号：KF 80）
冻结替代系统（Reichert AFS）

软件

Adobe Photoshop（CS3，Adobe Systems，San Jose，CA，USA）
ImageJ（NIH，USA; RRID：SCR_003070）
GraphPad Prism 5（GraphPad Software Inc.，San Diego，USA; RRID：SCR_002798）

程序

预嵌入（图1）
保存脑组织
1. 通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪（80 / 10mg / kg体重）麻醉动物（至少n = 3）。
2. 在室温下用PBS（0.1 M，pH 7.4,20-25°C）通过左心室灌注动物~20 s，然后用4％甲醛（从多聚甲醛中新解聚）制成的冰冷固定液，0.2％苦味酸和PB中的0.1％戊二醛（0.1M，pH7.4）。固定液/小鼠：250毫升。灌注时间15分钟。固定液/大鼠：500毫升。灌注时间：30分钟。
3. 从颅骨中取出大脑，并在4°C下固定在固定液中约1周。将样品储存在含有0.025％叠氮化钠的0.1 M PB稀释的固定剂（1:10）中，在4°C下使用。
图1.嵌入免疫电子显微镜技术前后的一般步骤的时间表 s

电子显微镜预嵌入免疫金法（图1,2A和3A）
1. 在振动切片机上切下50μm厚的切片，并在室温下置于0.1M PB（pH 7.4）的12孔细胞培养板中。来自每个脑的切片在分开的板中，在4℃下在含有0.025％叠氮化钠的0.1M PB（pH 7.4）中储存。选择包含感兴趣区域的每个脑的两个或三个切片并放置在新的平板中。每孔总体积：1毫升。
2. 在摇床（300rpm）上在室温下在TBS 1x（pH 7.4）中含有10％BSA，0.02％皂苷和0.1％叠氮化钠的封闭溶液（1ml /孔）中预孵育30分钟。
3. 在摇床上与在含有0.004％皂苷和0.1％叠氮化钠的10％BSA / TBS 1x中稀释的山羊多克隆抗CB 1 受体抗体（1：100稀释，1ml /孔）孵育。将培养皿放置在轨道振荡器上，在4°C下放置两天。＆nbsp;
4. 在1％BSA / TBS中洗涤5次（3×1分钟和2×10分钟）。
5. 在摇动器上与含有0.004％皂苷的1％BSA / TBS中的1.4nm金缀合的兔抗山羊IgG（Fab'片段，1：100，Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY，USA; 1ml /孔）孵育在室温下3小时。
6. 在1％BSA / TBS中洗涤三次（每次10分钟）。将组织在1％BSA / TBS中在振荡器上保持4℃过夜。
7. 用TBS（1ml /孔）在室温下制备1％戊二醛后固定10分钟。
8. 用双蒸水洗涤三次（每次10分钟）。＆nbsp;
9. 将切片转移到玻璃试管中。
10. 在黑暗中用HQ Silver试剂盒（Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY，USA; 1ml /管）强化金颗粒12分钟。＆nbsp;
11. 用双蒸水洗涤三次（每次1分钟）。＆nbsp;
12. 在0.1 M PB（pH 7.4）中洗涤三次（每次10分钟）。＆nbsp;
13. 将切片转移到玻璃瓶（15毫升，3×5厘米）。
14. 在黑暗中将Osmicate（1％四氧化锇在0.1M PB，pH7.4; 1ml /小瓶中）保持20分钟。
15. 在0.1M PB（pH 7.4）中洗涤三次（每次10分钟）。
16. 在分级乙醇中脱水（50％，70％，96％;每次5分钟），然后在100％乙醇（每次5分钟）（1ml /小瓶）中脱水三次。＆nbsp;
17. 用环氧丙烷（3×5分钟，1毫升/小瓶）代替。
18. 用振荡器在室温下用环氧丙烷和Epon树脂812（1ml /小瓶）的1：1混合物渗透切片过夜。＆nbsp;
19. 与纯Epon树脂812（1ml /小瓶）混合，用于>在室温下2小时。
20. 将部分放在两个载玻片之间，用铝箔包裹载玻片。
21. 在60°C下聚合树脂嵌入部分2天。
22. 在超薄切片机上切割1μm半薄切片。
23. 修剪块并用金刚石刀切割60纳米超薄切片并收集在镍网格上。＆nbsp;
24. 在室温下用2.5％柠檬酸铅（1滴/网格）染色切片20分钟。＆nbsp;
25. 用双蒸水（1滴/格）洗涤三次（每次10分钟）。
26. 在飞利浦EM208S透射电子显微镜下检查。＆nbsp;
27. 使用数字Morada相机（Olympus）拍摄部分。
双重预嵌入免疫金和免疫过氧化物酶法（图1,2B和3B-3D）
1. 在振动切片机上切下50μm厚的切片，并在室温下在0.1M PB（pH 7.4）中的12孔细胞培养板中收集。来自每个脑的切片在分开的板中，在4℃下在含有0.025％叠氮化钠的0.1M PB（pH 7.4）中储存。选择包含感兴趣区域的每个脑的两个或三个切片并放置在新的平板中。每孔总体积：1毫升。
2. 在摇床（300rpm）上在TBS 1x，pH 7.4中含有10％BSA，0.02％皂苷和0.1％叠氮化钠的封闭溶液（1ml /孔）中在室温下孵育30分钟。＆nbsp;
3. 用山羊多克隆抗CB 1 受体抗体或豚鼠多克隆抗CB 1 受体抗体（1：100,1 ml /孔稀释）与任一组合孵育切片小鼠单克隆抗GFAP抗体（1：1,000），兔多克隆抗GLAST抗体（0.3μg/ ml），或小鼠单克隆抗 - gephyrin抗体（1：250），用含有0.004％皂苷的10％BSA / TBS 1x制备和0.1％叠氮化钠。将培养皿置于4°C的轨道振荡器上2天。
  注意：豚鼠多克隆抗CB 1 抗体用于兔多克隆抗GLAST抗体的双重免疫标记。
4. 在1％BSA / TBS中洗涤5次（3×1分钟和2×10分钟）。
5. 与相应的生物素化的二抗（1：200）和1.4nm金偶联的第二兔抗山羊IgG（Fab'片段，1：100，Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY，USA）或1.4nm金偶联的二级山羊一起孵育将抗豚鼠IgG（Fab'片段，1：100，Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY，USA）在摇床上在含有0.004％皂苷的1％BSA / TBS中在室温下稀释4小时。
6. 在室温下用振荡器在1％BSA / TBS（每次10分钟）中洗涤三次。＆nbsp;
7. 将在洗涤溶液（1ml /孔）中制备的抗生物素蛋白 - 生物素 - 过氧化物酶复合物（ABC）（1:50）在室温下孵育1.5小时。＆nbsp;
8. 在1％BSA / TBS中洗涤三次（每次10分钟）。将组织置于1％BSA / TBS中，在振荡器上于4℃保持过夜。
9. 在TBS（1ml /孔）中用1％戊二醛在室温下固定10分钟。＆nbsp;
10. 用双蒸水洗涤三次（每次10分钟）。＆nbsp;
11. 切片转移到试管中。
12. 在黑暗中用HQ Silver试剂盒（Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY，USA; 1ml /管）强化金颗粒12分钟。＆nbsp;
13. 用双蒸水洗涤三次（每次1分钟）。＆nbsp;
14. 在0.1 M PB（pH 7.4）中洗涤三次（每次10分钟）。＆nbsp;
15. 将切片转移到玻璃小瓶（15ml，3×5cm）中。
16. 在室温下，在0.1M PB（1ml /小瓶）中制备的0.05％DAB和0.01％过氧化氢孵育3分钟。＆nbsp;
17. 在0.1 M PB（pH 7.4）中洗涤三次（每次10分钟）。＆nbsp;
18. 在黑暗中将Osmicate样品（1％四氧化锇在0.1M PB，pH7.4; 1ml /小瓶中）保持20分钟。
19. 在0.1M PB（pH 7.4）中洗涤三次（每次10分钟）。
20. 在分级乙醇中脱水（50％，70％，96％;每次5分钟），然后在100％乙醇（每次5分钟）（1ml /小瓶）中脱水三次。＆nbsp;
21. 用环氧丙烷（3×5分钟，1毫升/小瓶）代替。
22. 用振荡器在室温下用环氧丙烷和Epon树脂812（1ml /小瓶）的1：1混合物渗透切片过夜。＆nbsp;
23. 与纯Epon树脂812（1ml /小瓶）混合，用于>在室温下2小时。
24. 将部分放在两个载玻片之间，并将载玻片包裹在铝箔中。
25. 将树脂嵌入部分在60°C的烘箱中聚合2天。＆nbsp;
26. 在超薄切片机上切割1μm半薄切片。
27. 修剪块并用金刚石刀切割60纳米超薄切片并收集在镍网格上。＆nbsp;
28. 在室温下用2.5％柠檬酸铅（1滴/网格）染色切片20分钟。＆nbsp;
29. 用双蒸水（1滴/格）洗涤三次（每次10分钟）。
30. 在飞利浦EM208S透射电子显微镜下检查。＆nbsp;
31. 使用数字Morada相机（Olympus）拍摄部分。
后嵌入式（图1）
使用嵌入后免疫金法进行单/双标记（图1,2C和3E-3F）
1. 保存脑组织。为获得最佳超微结构，如上所述麻醉并灌注动物。＆nbsp;
2. 从颅骨中取出大脑，并在4°C下固定在固定液中约1周。然后，将大脑置于0.1 M PB稀释的固定剂（1:10）加0.025％叠氮化钠中，温度为4°C，然后用PB冲洗直至下一步。＆nbsp;
3. 样品修剪（从感兴趣的区域切割0.5 x 0.5 x 1 mm的小矩形片）。
4. 使用冷冻固定装置（KF80; Reichert，Vienna，Austria）在甘油中冷冻保护（PB中10％，20％和30％）并在液体丙烷中快速冷冻。＆nbsp;
5. 用甲醇和0.5％乙酸双氧铀冷冻替代。
6. 嵌入Lowicryl HM20（Lowi，Waldkraiburg，Germany）。
免疫金标记程序
1. 在超薄切片机上切割1μm半薄切片。
2. 在镍单槽formvar涂层网格上收集70纳米超薄切片。
3. 用含有0.1％NaBH 4 和50 mM甘氨酸（10μl滴/网格）的TBST洗涤样本10分钟。＆nbsp;
4. 在TBST中冲洗3次（10μl滴/网格）（每次1分钟）。
5. 在含有10％BSA的TBST的封闭溶液（10μl滴/网格）中预孵育10分钟。
6. 用抗CB 1 受体（1:50）或抗mGluR2 / 3（1:50）抗体或用2％BSA制备的它们的混合物孵育（10μl滴/网格）/ TBST，在4°C过夜。＆nbsp;
7. 在TBST中洗涤三次（10μl滴/网格）（每次10分钟）。
8. 在含有10％BSA和0.5％PEG的TBST中的封闭溶液（10μl滴/网格）中预孵育10分钟。＆nbsp;
9. 用不同金粒径的二抗孵育（10μl滴/网格）：驴18nm胶体金偶联亲和纯化的抗山羊IgG（用于CB 1 ）和山羊F（ab'）<将sub> 2 抗兔IgG与10nm胶体金颗粒（对于mGluR2 / 3）偶联，在室温下在2％BSA / TBST中1:20稀释2小时。
10. 在双蒸水中洗涤三次（10μl滴/格）（每次10分钟）。
11. 用2％乙酸双氧铀（20分钟）和2.5％柠檬酸铅（2分钟）（10μl滴/格）对抗。
12. 用双蒸水（10μl滴/格）洗涤三次（每次10分钟）。
13. 在飞利浦EM208S透射电子显微镜下检查。＆nbsp;
14. 使用数码Morada相机（奥林巴斯）拍摄标本。
图2.说明高分辨率电子显微镜的三种免疫标记方法的示意图

图3. CB 1 受体免疫定位在啮齿动物脑的不同亚细胞区室。单一预嵌入免疫金（A）和双预嵌入免疫金和免疫过氧化物酶方法（BD）。 A.在与树突（den，紫色）相邻的突触前GABA能末端（ter，黄色）处的CB 1 受体标记（箭头）。 CB 1 受体颗粒定位于与脊柱（sp，紫色）相关的突触前谷氨酸能末端（ter，粉红色）。线粒体（m，红色）在谷氨酸能（ter，粉红色）和GABA能（ter，黄色）突触前末梢（CA1 stratum radiatum，成年小鼠海马）中表现出CB 1 受体免疫标记。 B. CB 1 受体标记（箭头）在突触前GABA能末端（ter，黄色），谷氨酸能末端（ter，紫色）和一个星形胶质细胞分支（白色箭头; as，绿色）中的小鼠梨状皮质。用抗GLAST /免疫过氧化物酶/ DAB方法（as中的黑色沉淀物）标记星形胶质细胞。 C. CB 1 受体标记（箭头）在突触前GABAergic末端（ter，黄色）与树突（den，紫色）相邻并在一个星形胶质细胞过程中（白色箭头;为绿色）小鼠齿状回的分子层。用抗GFAP /免疫过氧化物酶/ DAB方法（as中的黑色沉淀物）标记星形胶质细胞。 D.突触前末端（ter，黄色）的CB 1 受体标记（箭头）与抗gephyrin /免疫过氧化物酶/ DAB方法（黑色沉淀在den，紫色）结合，以正向鉴定抑制性突触后膜GABA能神经突触白色箭头：CB 1 受体标记在填充细胞间隙（大鼠前肢皮质）的薄星形细胞过程中。 E-F。双嵌入后免疫金法揭示突触前CB 1 受体（ter; 18 nm直径金颗粒）和突触后mGluR2 / 3（den，sp; 10 nm直径金颗粒）的抑制作用（ter，yellow）和小鼠齿状分子层中的兴奋性（ter，pink）突触。比例尺= 500 nm。

数据分析

预嵌入法中CB 1 受体免疫标记的半定量分析
为了使标准条件最大化，将预嵌入免疫金方法同时应用于从研究中的动物获得的所有切片（至少n = 3）。对每只动物进行三次重复实验。
＆NBSP;首先在光学显微镜下观察免疫金标记的树脂包埋的振动切片部分，以选择可重复的部分感兴趣区域（即，CA1海马，齿状分子层，前肢皮质或梨状皮质）。 CB 1 受体免疫标记。然后，切割来自树脂包埋组织的半薄切片，并将前五个超薄切片收集到两个网格上。为了进一步标准化不同动物之间的条件，仅收集每个样本表面的前1.5μm并随机拍照。对于所有研究的动物，总是小心地并且以相同的方式进行取样。为避免偏见，研究人员在拍摄和分析电子显微照片时仍然失明。
＆NBSP;兴奋性和抑制性突触通过其超微结构特征鉴定;兴奋性突触与突触后密度和突触前轴突末端不对称，包含丰富，清晰和球形的突触小泡。抑制性突触与细长的突触后膜和含有多形性突触小泡的轴突末端对称。由于缺乏突触后膜密度，除非连续切片完成，否则突触的抑制性质可能会产生误导。避免这种情况的替代方案是使用抗gephyrin的抗体，gephyrin是抑制性突触的突触后锚定蛋白标记，其可用于明确鉴定抑制性突触。在含有GFAP或GLAST DAB免疫沉积物的星形胶质细胞过程中评估星形胶质细胞中的CB 1 受体。
＆NBSP;然后将如上所述鉴定的不同区室上的CB 1 受体标记的比例制成表格。当至少一个CB 1 受体免疫颗粒在所研究的特定区室的膜的~30nm内时，并且在线粒体标记的情况下来自其他膜的≥80nm时，考虑阳性标记。然后计数金属颗粒并通过ImageJ软件通过测量它们的膜长度来确定阳性隔室中的CB 1 受体密度（颗粒/μm膜）。我们还估计了CB 1 受体免疫颗粒在不同谱中的比例与总CB 1 受体表达的比值。这提供了关于特定脑区域的不同区室（兴奋性和抑制性突触，星形胶质细胞，线粒体，其他细胞区室）中CB 1 受体分布的信息。对于星形胶质细胞，还计算从星形细胞CB 1 受体免疫颗粒到最近的突触的距离，以确定受体如何在三联突触的背景下分布。为此，识别CB 1 受体阳性星形胶质细胞周围的附近突触，测量距离（ImageJ软件），选择的星形胶质细胞免疫颗粒的最近突触，以及来自所有最近突触的数据和分析。
＆NBSP;所有值均以平均值±S.E.M表示。使用统计软件包（GraphPad Prism 5，GraphPad Software Inc.，San Diego，USA）。在运行统计检验之前，始终应用常态检验（Kolmogorov-Smirnov正态性检验）。使用参数或非参数双尾学生 t - 测试或单向ANOVA以及随后的事后分析（Bonferroni post-test）分析数据。
在嵌入后方法中定量CB 1 受体免疫标记
鉴定的兴奋性和抑制性突触末端的电子显微照片是从特定脑区域（例如，齿状回的分子层）随机获得的。为了分析，从所研究的每只动物中选择包含完整质膜，突触小泡和突出突触裂缝标准的50个突触。为避免偏见，研究人员在拍摄和分析电子显微照片时仍然失明。使用统计软件包分析CB 1 受体阳性兴奋性和/或抑制性末端的百分比以及接受CB 1 阳性突触前末梢的mGluR2 / 3标记的突触后树突的百分比。（GraphPad Prism 5，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA）。如预嵌入技术（例如，膜接近）中所述，标记被认为是阳性的。数据显示为平均值±S.E.M。如前所述计算正极端子中的CB 1 受体密度（颗粒/μm膜）。另外，为了确定突触后元件中mGluR2 / 3（或任何其他受体）相对于突触前释放位点的精确亚突触分布，测量金颗粒频率的分布。此外，可以确定突触前boutons中的亚突触CB 1 受体分布。在这种情况下，金颗粒的突触或周/突外定位是根据其从突触后密度和突触前活动区边缘获得的60 nm宽片段中的分配来定义的（边缘定位= 0）。如预嵌入方法部分所述进行统计分析。

食谱

固定解决方案
在微波炉中加热600毫升蒸馏水至60°C
加入11.5克Na 2 HPO 4 （无水）（MW：141.96）
加入40g多聚甲醛（MW：30.03）并在60℃下摇动。可能需要30分钟才能解散
加入2.62 g NaH 2 PO 4 •H 2 O（MW：137.99）
将溶液过滤到锥形瓶中，加入2ml饱和苦味酸（MW：229.11）用蒸馏水补足1升
冷却并储存在4°C直至使用
在灌注前，加入4毫升戊二醛（25％）
磷酸盐缓冲盐水（PBS 1x）（0.1M，pH7.4）
对于1L PBS 1x，准备如下：
从800毫升蒸馏水开始：
加入8克NaCl（分子量：58.44）
加入0.2克KCl（分子量：74.55）
加入1.44克Na 2 HPO 4 （MW：141.96）
加入0.24克KH 2 PO 4 （MW：136.09）
用HCl（MW：36.46）将pH调节至7.4
加入蒸馏水至总体积为1升
0.1M磷酸盐缓冲液（0.1M PB）pH = 7.4
储备溶液：0.2M PB，pH = 7.4
对于1升0.2 M PB，准备如下：
加入5.24克NaH 2 PO 4 •H 2 O（MW：138）
加入23.0克Na 2 HPO 4 （MW：141.96）
蒸馏水，补充1升溶液为了制备0.1M PB，将原液0.2M PB在蒸馏水中1：1稀释
三氯化氢缓冲盐水：3M NaCl + 1M Tris-HCl，pH = 7.4; （TBS 1x）
储备溶液：0.3M NaCl + 0.1M Tris-HCl，pH = 7.4（10x TBS）
对于1升10x TBS，准备如下：
加入175克NaCl（分子量：58.44）
加入19.4克Trizma碱（分子量：121.14）
加入132.2克Trizma-HCl（MW：157.60）
用蒸馏水补充1升溶液
为制备1L TBS 1x，将TBS 10x储备溶液在蒸馏水中1：9稀释
含Triton X-100（TBST）的Tris缓冲盐水
取450毫升蒸馏水
加入3.03克Trizma碱（分子量：121.14）
加入4.5克NaCl（分子量：58.44）
将pH调节至7.4，用蒸馏水将溶液调至500 ml
加入0.5毫升Triton X-100（分子量：646.86）
Epon树脂
加入81.3克EPON 812（分子量：178.18）
加入53.0克EPONHÄRTERDDSA（MW：266.38）
加入35.7克MNA（分子量：178.18）
加入2.24ml N-苄基二甲胺Fluka 13370（MW：135.21）
混合至少2小时，然后在-20℃下储存在注射器中
醋酸铀酰（2％，水溶液）染色溶液
在2ml蒸馏水中制备0.04g乙酸双氧铀（UO 2 （CH 3 COO） 2 （MW：388.11）），离心机于11,600 xg 5分钟并使用上清液
Reynold的柠檬酸铅染色解决方案
加入2.66g硝酸铅（Pb（NO 3 ） 2 ，MW 331.2）和3.52g柠檬酸三钠二水合物（Na 3 C 6 H 5 O 7 •2H 2 O，MW：294.10）在84毫升双蒸水中（当加入柠檬酸钠时，溶液变得混浊是正常的）
在20ml双蒸水中制备0.8g 1N NaOH（MW：39.99）
向柠檬酸铅溶液中加入16毫升NaOH溶液（当加入NaOH时溶液变澄清）
过滤溶液以去除任何未溶解的物质

致谢

这项工作得到了巴斯克政府的支持（BCG IT764-13）; MINECO / FEDER，UE（SAF2015-65034-R）; Red de Trastornos Adictivos，Instituto de Salud Carlos III（ISC-III）和欧洲区域发展基金 - 欧盟（ERDF-EU）（RD16 / 0017/0012）。我们要感谢Niels Christian Danbolt教授为我们提供兔多克隆抗A522 EAAT1 [GLAST]抗体和Mahmood Amiry-Moghaddam教授和BjørgRiber教授的Lowicryl HM20嵌入（分子医学系解剖学部，挪威奥斯陆大学基础医学研究所。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

伦理

动物护理和使用议定书得到了巴斯克大学动物福利伦理委员会（CEEA / M20 / 2016/073; CEIAB / 2016/074）的批准，并符合欧洲共同体理事会的指令。 2010年9月22日（2010/63 / EU）和西班牙法规（Real Decreto 53/2013，BOE 08-02-2013）。

参考

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