材料和试剂

移液器吸头（StarLab，目录号：S1111-3700 [10μl]，S1113-1700 [200μl]，S1111-6700 [1,000μl]）
铝箔（CA.DIS。，目录号：50002.24）
培养皿60毫米（Euroclone，目录号：ET2060）
50毫升锥形管（Eppendorf，目录号：E162071N）
15毫升锥形管（Eppendorf，目录号：E160926K）
一次性手套（WRP，目录号：D1502-18）
S35羽毛一次性切片机刀片（PFM Medica AG，目录号：02OK07500000）
粘附显微镜载玻片（Laboindustria S.p.A.，目录号：33820）
光学显微镜用盖玻片24 x 50 x 0.16 mm（DiaPath，目录号：061051）
用于免疫染色的Pap笔（默克集团，目录号：Z377821-1EA）
纸巾（Paperdi，目录号：RL1M180）
小刷子
真空过滤系统500ml0.45μm（Euroclone，目录号：EPVPE45500）
DPBS（Euroclone，目录号：ECB400L）
乙醇（ITW试剂，目录号：141086）
二甲苯异构体混合物（Carlo Erba Reagents，目录号：392603）
Paraplast Bulk（组织包埋培养基）（Leica Biosystem，目录号：39602012）
Eukitt（Fluka Analytical，目录号：03989）
去离子水
蒸馏水
甲醇（Carlo Erba Reagents，目录号：414814）
过氧化氢30％水溶液（默克，目录号：216763-M）
盐酸，37％（Merck，目录号：30721-M）
牛血清白蛋白（默克，目录号：A3912）
抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒（Vector Laboratories，目录号：SP-2001）
TLR4单克隆抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录编号：76B357.1）
小鼠IgG（Vector Laboratories，目录号：I-2000）
生物素化的抗小鼠IgG（H + L）亲和纯化（VectorLaboratories，目录号：BA-2000）
链霉抗生物素蛋白/ HRP（Dako，目录号：P0397）
DAB（3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐）增强液体基质系统（默克，目录号：D3939）
Carazzi的苏木精（Bio-Optica，目录号：W01030708）
多聚甲醛粉末EM级（Polysciences，目录号：0380）
氯化钾（KCl）（Carlo Erba Reagents，目录号：471177）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Carlo Erba Reagents，目录号：471687）
无水磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Carlo Erba Reagents，目录号：480141）
氯化钠（NaCl）（Carlo Erba Reagents，目录号：368257）
柠檬酸（CARLO ERBA Reagents，目录号：403727）
柠檬酸三钠二水合物（Carlo Erba Reagents，目录号：479487）
叠氮化钠（NaN 3 ）（默克，目录号：S-2002）
2％多聚甲醛（pH 7.4）（见食谱）
PBS（用于稀释二抗，链霉抗生物素蛋白/ HRP以及洗涤和溶解BSA）（参见食谱）
揭开缓冲液（10 mM柠檬酸钠缓冲液，pH 6）（参见食谱）
用于稀释一抗的缓冲液（参见食谱）
过氧化物酶抑制溶液（见食谱）
封闭溶液（5％BSA）（见食谱）

设备

镊子（Thermo Fisher Scientific，目录号：10303611）
镊子（Exacta Optech，目录号：9204222）
盖玻片钳（Leica Biosystems，目录号：38DI26286）
无菌一次性手术刀
烧杯
带盖玻璃染色餐具（Vetrotecnica，目录号：01406000）
带盖的PMP垂直染色罐（Vetrotecnica，目录号：06035500）
移液器（0.5-10,10-100和100-1,000μl，Eppendorf，目录号：3111000.122,3111000.149,3111000.165）
徕卡Reichert-Jung 2040 autocut切片机
组织学浴（Falc Instruments，目录号：610.1030.00）
金属底座模具24 x 24 mm（Leica，目录号：38013082）
组织嵌入环（Biosigma，目录号：040272）
干燥箱/台式（Melag）
湿度室（默克，目录号：H6644）
光学显微镜（Leica，型号：Leica DMLB，目录号：020-519.502）
高分辨率数码相机（Leica，型号：Leica DC 300F，目录号：12447115）
加热磁力搅拌器（Velp Scientifica，目录号：F20500413）
通风柜（Bicasa，目录号：Logica 1.2）微波炉Saturno（MG821ABH）（DPE Elettrodomestici，目录号：0277）

软件

图像分析软件（Leica QWin）（Leica，Cambridge，UK）
GraphPad Prism ®（版本5.02）（GraphPad Software San Diego，CA，U.S.A。）

程序

样品采集
1. 准备（1）
  1. 将干净的镊子和镊子包在铝箔中并高压灭菌。
  2. 每个肌肉样品准备两个60毫米的培养皿，向每个培养皿中移取3毫升冷（~5℃）无菌DPBS。
2. 收集来自腹直肌的人体肌肉活检
  注意：
  1. 慢性肾病（CKD）肌肉活检在腹膜透析导管插入过程中获得。
  2. 对于腹壁疝的选择性手术，对其他健康受试者进行对照活组织检查。
  3. 从所有受试者获得了知情同意。
  将肌肉活组织检查物在含有20ml DPBS的50ml管中输送到实验室。必须收集样品并保持最多浸泡在冰中半小时。样本量可变。
3. 准备（2）
  1. 给肌肉组织一个代码，为每个患者识别每个样本。
  2. 将肌肉活组织检查转移到含有3ml冷（~5℃）DPBS的60mm培养皿中。
  3. 通过镊子和来自任何可见结缔组织和脂肪组织的无菌一次性手术刀清洁组织肌肉。
  4. 如有必要，使用无菌一次性手术刀减少样本量。一般0.4 x 0.4厘米就足够了。
  5. 在另一个含有3毫升冷（~5℃）DPBS的60毫米培养皿中清洗肌肉。
石蜡载玻片准备
1. 肌肉加工
  1. 将组织转移到含有10ml 2％多聚甲醛的15ml锥形管中，并在4℃下固定过夜。
  2. 弃去2％多聚甲醛。
  3. 通过使组织通过一系列增加乙醇浓度的溶液来使组织脱水：
    在室温下10ml 50％乙醇60分钟
    室温下10ml 70％乙醇60分钟
    室温下10ml 100％乙醇60分钟
    在4℃下将10ml的100％乙醇过夜
  4. 在室温下用二甲苯清洗4小时。
  5. 丢弃二甲苯。
  注意：对于每个步骤，将溶液倒入通风柜中的有机溶剂处理容器中。
  1. 在56°C下将融化的石蜡中的肌肉组织浸润60分钟。
2. 嵌入
  1. 使用镊子将肌肉组织转移到嵌入基础模具的孔中。
  2. 将组织盒的基部卡入嵌入式基座模具中。
  3. 用熔化的石蜡填充模具。
  注意：＆nbsp;
  1. 以前，嵌入式底座模具在一块冰块上冷却，每一步都尽快完成！
  2. 让石蜡在-20°C固化。
3. 分段
  1. 在组织浴中将去离子水加热至56°C。
  2. 将石蜡块安装在切片机上。
  3. 用铅笔在幻灯片上写下代码标本。
  4. 切薄切片（5微米）。
  5. 用小刷子取出切片并将它们转移到组织浴中。
  6. 将显微镜载玻片浸入组织学浴中，使组织切片粘附在其表面上。
  7. 将载玻片在56℃的烘箱中干燥1小时至过夜。
  注意：对于每张幻灯片，请选择2个部分。在组织学浴中，水的温度必须为56°C，以使切片变平。
免疫组化染色
注意：
1. 染色前，必须除去石蜡。
2. 所有步骤必须在通风橱中进行。
1. 去石蜡/补液
  1. 准备4个玻璃染色盘子，每个盘子都有一个盖子，包含：
    乙醇50％
    乙醇70％
    乙醇100％
    二甲苯
  2. 将幻灯片转移到：
    class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>二甲苯
    10分钟
    乙醇100％
    10分钟
    乙醇70％
    10分钟
    乙醇50％
    10分钟
    去离子水
    1分钟
2. Antigen Unmasking
  1. 将载玻片转移到带盖的PMP垂直染色罐中。
  2. 将微波中的热载玻片浸没在60ml 10mM柠檬酸钠缓冲液中，并用盖子部分盖住，直至开始沸腾。
  3. 煮沸15分钟。
  4. 在工作台上冷却20分钟。
  注意：在PMP垂直染色罐的每个凹槽中，必须容纳一个滑块。对于每次抗原暴露的会话，载玻片的数量必须相同，以使暴露的效率始终相同。这确保了与每个载玻片相似的热分布并减少了抗原修复的差异。在我们的罐子里，有8个凹槽，在每个阶段，我们总是容纳8个幻灯片。如果带有肌肉样本的载玻片小于8，则必须加热空载玻片。例如，3个载有肌肉组织的载玻片加上5个空载玻片。每次煮沸后，不得重复使用10 mM柠檬酸钠缓冲液。
3. 染色
  1. 用去离子水洗涤载玻片30秒。
  2. 用3％过氧化氢（过氧化物酶抑制溶液）阻断内源性过氧化物酶15分钟（重复两次）。
    注意：在使用时和每个更换时间准备新鲜的3％过氧化氢。
  3. 用去离子水洗涤载玻片30秒。
  4. 用PBS洗涤切片5分钟。
    注意：从现在开始，将载玻片转移到湿度箱中。在玻璃染色皿中清洗载玻片。
  5. 在室温下用100-200μl5％BSA封闭每个切片20分钟。
  6. 在PBS中洗涤切片5分钟，共3次。
  7. 用pap笔在组织切片周围画一个圆圈。
  8. 在室温下用一滴抗生物素蛋白封闭每个切片15分钟。
  9. 重复步骤C3f.OK
  10. 在室温下用一滴生物素封闭每个切片15分钟。
  11. 重复步骤C3f。
  12. 用1％BSA-PBS稀释一抗。
    注意：湿度箱的底部覆盖有水。对于一抗稀释，我们查阅了产品数据表。根据TLR4,1：100，在相同条件下用小鼠IgG孵育切片获得阴性对照。
  13. 在室温下将每个切片用100μl孵育过夜。
  14. 请参阅重复步骤C3f。
  15. 以1：300的比例稀释PBS中的生物素化抗小鼠IgG。
  16. 在室温下孵育每个切片100μl，30分钟。
  17. 重复步骤C3f。
  18. 以1：500的比例稀释PBS中的链霉抗生物素蛋白/ HRP。
  19. 重复步骤C3p。
    注意：在步骤C3m，C3p和C3s期间，确保幻灯片干涸。
  20. 重复C3f。
  21. 根据数据表制备DAB（3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐）增强液体基质系统。
  22. 在室温下用100μlDAB溶液孵育每个切片15分钟。
    注意：在显微镜下监测染色发展。
  23. 重复步骤C3f。
    注意：在玻璃染色皿中清洗载玻片。
  24. 将载玻片浸入去离子水中。
  25. 用Carazzi的苏木精对照切片1分钟。
  26. 在自来水下冲洗5分钟。
  27. 将载玻片转移到去离子水中。
4. 补液和安装部分
  将幻灯片转移到：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：200px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>乙醇50％
  2分钟
  乙醇70％
  2分钟
  乙醇100％
  2分钟
  二甲苯
  2分钟
  注意：第二组乙醇溶液和二甲苯必须与上面用于去石蜡化的溶液不同。
5. 准备永久安装的部分
  1. 在该部分放置2-3滴Eukitt。
  2. 避免捕获气泡，通过盖玻片钳小心地从液滴的一侧降低盖玻片。
    注意：应该有足够的安装介质来完全覆盖盖玻片的底部。可以用纸巾去除多余的Eukitt（图1）。
  3. 将载玻片放在通风橱中24小时。
    
    图1.健康和CKD肌肉中的TLR4染色。通过将载玻片与相同的第一抗体同种型（放大400-1,000x;比例尺=10μm）一起孵育来获得阴性对照。

数据分析

图片分析
为了量化染色差异，在肌肉标本中，我们使用图像分析。它是一个功能强大的工具，使用分析软件提供有意义的定量数据，该软件根据颜色（即，RGB）等特征对数字图像中的像素进行分割。图像分析由Leica QWin图像分析系统（Leica，Cambridge，UK）进行。视频图像由CCD摄像机生成，CCD摄像机通过帧抓取器连接到PC。单个图像被数字化以用于256灰度级的图像分析。 QWin（Leica，Cambridge，UK）定量分析导入的数据，并通过GraphPad Prism 进行统计分析。

选择最佳放大倍数来分析免疫染色肌肉，并为每个样本和分析保持相同。我们使用400倍放大率。调整曝光时间和增益设置（图2）。

图2.曝光时间和增益设置。屏幕截图显示曝光时间和增益设置允许创建图像采集的最佳条件。
设置白色平衡，使用鼠标在幻灯片上选择一个小框架（图3）。

图3.白色平衡设置。此功能执行色彩校正，以便平衡彩色图像。这是此次收购最重要的设置之一。对于白平衡，请在白色区域的一角使用鼠标左键单击以形成一个小框架。一旦松开按钮，就会出现一个上下文菜单，其中包含照片中所示的白平衡命令，并用白色箭头加下划线。
调整精细焦距，位置和光线水平（图4）。

图4.调整精细焦点，位置和亮度。右侧的直方图表示图像曝光不足或曝光过度的程度，并有助于调整照明条件。绿色直方图表示最佳曝光。
注意：最佳图像曝光对于几乎所有计算机视觉应用都至关重要。获取图像时，重要的是要在曝光时间和图像亮度之间找到折衷方案。如果图像曝光不足或曝光过度，功能或纹理会丢失，颜色会消失，图像的整体感知质量会下降。
获取图像。
设置红色，蓝色和绿色峰，以便仅标记褐色区域并排除负区域（图5）。
注意：保持确保每个样品的设置和分析都保持不变。

图5.设置红色，蓝色和绿色峰。设置右侧的直方图，以区分染色区域和未染色区域。正信号以蓝色显示。
为每个区域选择一根光纤并进行测量（图6）。

图6.单纤维的选择和测量建议一次测量一根纤维，因为每个区域的肌纤维数量不同。 A.使用光标（以白色圆圈突出显示），选择一根光纤（左起第五根光纤），如三条红色箭头所示的细红线所示。 B.仅评估所选纤维，如蓝色所示。 C.左侧的对话框显示所选参数的值。
重复测量至少20-25根纤维（图7）。
注意：纤维应随机选择，评估阴性和阳性纤维。

图7.现场测量示例。在对话框中，报告了一个现场测量的示例。红色方块突出了平均值。
当样本分析完成后，考虑AREA％的平均值。
所有度量都在Excel工作表中报告，如图8所示。

图8. TLR4措施的电子表格
此时，数据已准备好提交给GraphPad Prism ®进行统计分析（图9）。

图9. GraphPad Prism的统计分析 ® 。 A.打开GraphPad Prism ®并选择红色箭头指示的参数。 B.从数据表开始，然后单击红色箭头所示的分析。 C.选择对话框左侧的分析。在这种情况下，我们选择 t -test来测量两组中的变量（强度染色的平均值），假设这些值遵循高斯分布。 D. P 值表明，两组平均值之间的差异具有统计学意义。
通过免疫组织化学和Western Blot（WB）评估TLR4的比较
我们随机选择了5名健康和12名CKD受试者的肌肉样本，并通过WB分离提取的蛋白质。如Verzola 等人（2017）中所述评估TLR4表达的强度。同样由WB，两组之间的差异具有统计学意义（图10）。

图10.通过免疫组织化学和WB评估TLR4之间的比较。 A.通过两种方法测量TLR4的电子表格。 B.图表显示使用两种方法在CKD肌肉中TLR4增加。 C.同样通过WB，两组的TLR4平均值之间的差异在统计学上是显着的，如 P 值所示。

食谱

多聚甲醛2％，pH 7.4（在4°C下储存长达一个月）
DPBS（Euroclone）
多聚甲醛粉EM级
对于500毫升2％多聚甲醛，在玻璃烧杯中：
1. 将10g多聚甲醛与400ml DPBS在通风罩中的搅拌板上混合
2. 在搅拌的同时将溶液加热至约60°C
  注意：请注意解决方案不会沸腾。
3. 一旦多聚甲醛溶解，将溶液冷却并过滤
4. 用DPBS将溶液的体积调节至500毫升
PBS（可在室温下保存）（500 ml）（用于洗涤和稀释生物素化的抗小鼠抗体和链霉抗生物素蛋白/ HRP）
0.2克KCl
0.2克KH 2 PO 4
1.08g Na 2 HPO 4 8g NaCl
在一个烧杯中：
1. 将盐溶解在搅拌板上的400ml去离子水中
2. 加入一些37％的HCl，调节pH至7.4
3. 用去离子水将溶液的体积调节至500毫升
揭开缓冲液（10 mM柠檬酸钠缓冲液）（100 ml）
1. 溶液A（100毫升）
  2.1克柠檬酸
  100毫升蒸馏水
2. 溶液B（100毫升）
  2.94克柠檬酸三钠二水合物
  100毫升蒸馏水
将溶液A和B在4°C下储存至一个月
在使用时，混合2.25ml溶液A + 10.25ml溶液B + 125ml蒸馏水
检查pH = 6
用于稀释一抗的缓冲液
100毫升PBS
1克BSA
0.1克NaN 3
1. 在烧杯中，在4℃下将BSA和NaN 3 溶解在80ml PBS中
2. 用PBS将溶液的体积调节至100ml
3. 储存在4-8°C至一个月
过氧化物酶抑制溶液
90毫升甲醇
10毫升30％过氧化氢
注意：在使用时新鲜准备。
封闭溶液（5％BSA）
50毫升PBS
2.5克BSA
在4°C下储存1周

致谢

这项研究得到了“大学科学与技术学院”和热那亚大学（Cofinanziamento di Ateneo）的资助。

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益披露。

伦理

该研究得到了热那亚大学内科学系伦理委员会（Di.M.I.）的批准。在获得知情同意之前，所有受试者都被告知研究的性质，目的，程序和可能的风险。

参考

Aderem，A。和Ulevitch，R。J.（2000）。诱导先天免疫反应中的Toll样受体。自然 406（6797）：782-787。
Andersson，U.，Yang，H。和Harris，H。（2018）。高迁移率族蛋白1（HMGB1）在细胞外和细胞内都起作用。 Semin Immunol 38：40-48。
Avlas，O.，Bragg，A.，Fuks，A.，Nicholson，JD，Farkash，A.，Porat，E.，Aravot，D.，Levy-Drummer，RS，Cohen，C.，Shainberg，A.， Arad，M。和Hochhauser，E。（2015年）。 TLR4表达与接受冠状动脉搭桥手术的患者的左心室功能障碍有关。 em> PLoS One 10（6）：e0120175。
Barrera，MJ，Aguilera，S.，Veerman，E.，Quest，AF，Diaz-Jimenez，D.，Urzua，U.，Cortes，J.，Gonzalez，S.，Castro，I.，Molina，C.， Bahamondes，V.，Leyton，C.，Hermoso，MA和Gonzalez，MJ（2015）。唾液粘蛋白在人下颌下唾液细胞中诱导Toll样受体4介导的促炎反应：什么是斯金格综合征的粘蛋白？风湿病学（牛津） 54（8）：1518-1527。
Jankowska，M.，Cobo，G.，Lindholm，B。和Stenvinkel，P。（2017）。尿毒症环境中的炎症和蛋白质 - 能量消耗。 Contrib Nephrol 191：58-71。
Kawai，T。和Akira，S。（2010）。模式识别受体在先天免疫中的作用：更新Toll样受体。 Nat Immunol 11（5）：373-384。
Mkaddem，S。B.，Bens，M。和Vandewalle，A。（2010）。由缺氧诱导的Toll样受体介导的细胞凋亡的差异激活。 Oncotarget 1（8）：741-750。
Takeda，K。和Akira，S。（2001）。通过Toll样受体调节先天免疫反应。 Jpn J Infect Dis 54（6）：209-219。
Verzola，D.，Bonanni，A.，Sofia，A.，Montecucco，F.，D'Amato，E.，Cademartori，V.，Parodi，EL，Viazzi，F.，Venturelli，C.，Brunori，G。和Garibotto，G。（2017年）。 Toll样受体4信号传导介导慢性肾病患者骨骼肌炎症。 J Cachexia肌肉减少症肌肉 8（1）：131-144。
Zhang，G.，Liu，Z.，Ding，H.，Miao，H.，Garcia，J。M. and Li，Y.P。（2017）。 Toll样受体4通过协调激活蛋白质降解途径介导Lewis肺癌诱发的肌肉萎缩。 Sci Rep 7（1）：2273。